Saline Systems, 2006; 2: 5-5 (más artículos en esta revista)

Toxinas de las cianobacterias en el Mar de Salton

BioMed Central
Wayne W Carmichael (wayne.carmichael @ wright.edu) [1], RenHui Li (reli@ihb.ac.cn) [1]
[1] Wright State University Departamento de Ciencias Biológicas 3640 Coronel Glen Highway Dayton, Ohio 45435, EE.UU.
[2] Institute of Hydrobiology Chinese Academy of Sciences Wuhan, Hubei 430072, China

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Resumen
Antecedentes

El Salton Sea (SS) es el mayor cuerpo de agua tierra adentro en California: superficie de 980 km 2, el volumen de 7,3 millones de acres-pies, 58 km de largo, 14-22 km de ancho, una profundidad máxima de 15 m. Situado en el sureste de California, el desierto de Sonora, es 85 m bajo el nivel del mar en su punto más bajo. Se formó entre 1905 y 1907 de las fuertes corrientes del río del Río Colorado. Desde su formación, que ha atraído a las personas ya la vida silvestre, incluyendo las bandadas de aves migratorias que han hecho el Salton Sea crítico escala en el Pacífico rutas. En los últimos 15 años las poblaciones de invernada orejas grebe (Podiceps nigricollis) en el Mar de Salton, han experimentado más de 200000 muertes. La causa de estas grandes die-offs sigue siendo desconocido. Las únicas condiciones ambientales de la Salton Sea, incluyendo salinidad del agua dulce en el río salobre ensenadas a hipersalinos condiciones, al día de verano las temperaturas extremas (> 38 ° C), y la alta carga de nutrientes de los ríos y el drenaje agrícola favor eutróficos condiciones que fomentan la proliferación de algas en todo El año. Un componente importante de estas floraciones de algas son las procariótico grupo - el Cyanophyta o algas verde-azules (también llamados cianobacterias). Dado que muchas cianobacterias producen toxinas (el cyanotoxins) se convirtió en importante evaluar su presencia y de determinar si son un factor que contribuye a la mortalidad grebe orejas-en el Mar de Salton.

Resultados

De noviembre de 1999 a abril de 2001, 247 muestras de agua y sedimentos fueron recibidos por el fitoplancton cyanotoxin identificación y análisis. Inmunoenzimático (ELISA) de cribado de este tipo de muestras encontró que ochenta y cinco por ciento de todas las muestras de agua contenida baja, pero los niveles detectables de la potente péptido cíclico hígado toxina llamada microcistinas. Aislamiento e identificación de las cianobacterias aislados mostró que el picoplanktonic Synechococcus bentónicos y la filamentosos Oscillatoria fueron dominantes. Ambos organismos se encontraron para producir microcistinas dominado por microcystin-LR y YR. Una cepa de laboratorio Synechococcus fue identificado por PCR de ser más cercana a las formas marinas conocidas de este género. Los análisis de los hígados afectados grebe microcistinas encuentran en niveles que puede dar cuenta de algunas de la mortalidad aguda.

Conclusión

La producción de microcistinas por un marino Synechococcus microcistinas indica que puede ser más común en ambientes marinos - un hallazgo no reconocida antes de este trabajo. Habría que investigar más sobre la definición de la distribución de la producción de microcystin cianobacterias marinas y determinar la exposición / respuesta efectos de microcistinas y posiblemente otros cyanotoxins en el Mar de Salton. Los futuros esfuerzos para reducir la mortalidad de aves y reparar el Salton Sea deben evaluar los vectores por los que entrar microcistinas especies de aves y las formas de control y de mitigación de waterblooms cianobacterias tóxicas en el Mar de Salton.

Antecedentes

A partir de la década de 1990, masivas de aves y peces epornitics se han producido en el Mar de Salton y más de 200000 orejas grebes han muerto [1]. La epizootia más importante se produjo en 1992, cuando un estimado de 155000 aves, principalmente orejas grebes (Podiceps nigricollis), murió de una causa no diagnosticados. La causa de estas masivas grebe epornitics sigue siendo desconocida, aunque varias enfermedades como el botulismo aviar, el cólera aviar y han sido diagnosticadas [2]. Biotoxinas de algas, especialmente las producidas por dinoflagelados, también han sido mencionados como posible causa contingentes [3], pero ninguno de los conocidos dinoflagelados tóxicos se ha identificado hasta la fecha. Los resultados preliminares de los análisis de las muestras de fitoplancton y orejas grebe tejidos recogidos en el mar en los principios de los 1990 identificados microcistinas producido por cianobacterias [[4, 5], informes internos a USGS]. Orejas grebes invierno en el Mar de Salton, por lo tanto, el epornitic normalmente ocurre anualmente durante los fines de invierno y comienzos de primavera. Orejas-grebe tejidos recogidos de la mortalidad de aves en el Mar de Salton en 1992 - el 94 había cyanotoxin - microcystin - en concentraciones lo suficientemente altas como para causar toxicidad aguda. Vinculada enzima Immunosorbent Assay (ELISA) para medir los valores de microcistinas, en 25 muestras de hígado, la molleja y el tracto gastrointestinal superior, mostraron niveles de microcystin en el hígado tan altas como 700 ng / g. Esto es muy por encima de los niveles de microcystin conocido en el hígado que puede causar letalidad aguda (alrededor de 200 ng / g) [6]. Cuarenta y nueve muestras de agua de fitoplancton, proporcionada por los EE.UU. Servicio de Pesca y Vida Silvestre, recogidos en 1995-96, desde el Mar de Salton, figuran los niveles de microcistinas que iban desde negativo a 2 ppb [Carmichael, informes internos de la USGS]. Estos niveles son bajos y no es probable que provoque toxicidad aguda. Sin embargo, la toxina se asoció con un organismo más pequeño que 5 micrones. Estos resultados sugieren una pequeña célula o planctónicas picoplancton (es decir, el dulce / salobre / marinos cianobacteria Synechococcus) pueden estar presentes en el mar que produce microcystin. Pequeños cianobacterias planctónicas se conoce que produce microcistinas [7]. Este año la información sirvió de base para la hipótesis de este proyecto: Microcystins contribuyen a la mortalidad grebe orejas en el Salton Sea y el hecho de que un organismo de la fuente (s) de la producción de microcistinas se encuentra en el picoplancton.

El Mar de Salton ha salinidades que varían de agua dulce y de agua salobre en las grandes desembocaduras de ríos en hipersalinos condiciones en el mar propiamente dicho, al día de verano las temperaturas extremas (> 40 ° C), y la alta carga de nutrientes (condiciones eutróficas) de los ríos y drenajes agrícolas Que alienta la proliferación de algas a lo largo del año [8]. Estas proliferaciones de algas pueden producir biotoxinas que contribuyen a la masiva mortalidad de peces y aves en el Mar de Salton. Además se sabe muy poco sobre las especies de algas que sobreviven en virtud de las actuales condiciones de Salton Sea. La combinación de temperaturas extremas de verano, el agua salina varias condiciones, la carga de nutrientes y proporcionan una oportunidad única para investigar las especies de algas en la zona del Mar de Salton. Dado que se sabe muy poco acerca de estas especies de algas, y sus biotoxinas, hay un elevado potencial de nuevas especies y la identificación de biotoxinas que pueden contribuir a la comprensión de la alta mortalidad de peces y aves. El objetivo de este estudio es recoger muestras de agua para la identificación de especies de algas y de biotoxinas (sólo cyanotoxins), y para determinar la presencia de cyanotoxins en orejas grebe tejidos.

Bloom y mat-en la formación de cianobacterias dulce, salobre y de las aguas marinas producen una amplia variedad de toxinas incluyendo hepatotoxins, neurotoxinas y dermatotoxins (Tabla 1]. Hepatotoxins son los más frecuentemente encontrados cianobacterias toxinas en alimentos frescos y aguas salobres de todo el mundo. El grupo más común, la microcistinas y nodularins, péptidos son cíclicos de siete o cinco aminoácidos respectivamente. Cerca de 70 diferentes variantes estructurales de microcistinas nodularins y algunos son conocidos. Varían en potencia de los altamente tóxicos a no tóxicos específicos en función de la estructura química, que en su mayoría son muy tóxicos [4, 5, 9].

Microcistinas se han caracterizado desde cualquiera de las cianobacterias más cosmopolita incluyendo géneros Anabaena, Microcystis, Oscillatoria, Planktothrix, Nostoc, Anabaenopsis y Hapalosiphon mientras nodularin se encuentra en el agua salobre especies Nodularia spumigena. Un alcaloide hepatotoxin cylindrospermopsin es producido por Cylindrospermopsis raciborskii, Umezakia natans, Raphidiopsis curvata y Aphanizomenon ovalisporum [10].

Tres grupos de cianobacterias neurotoxinas son conocidos: (i) anatoxina-a y homoanatoxin-a, que imitan el efecto de la acetilcolina, (ii) anatoxina-a (s), que es una anticolinesterasa y (iii) saxitoxins, que bloquean las células nerviosas Los canales de sodio. Anatoxina-a se ha encontrado en Anabaena, Oscillatoria y Aphanizomenon, homoanatoxin-a en Oscillatoria, anatoxina-a (s) en Anabaena, Aphanizomenon y en saxitoxins, Anabaena, Lyngbya y Cylindrospermopsis. Dieciséis confirmó saxitoxins muestras de cianobacterias se ha informado, algunos de los cuales (el decarbamoyl-gonyautoxins) pueden ser químicos desglose productos en algunas especies.

En las aguas marinas, las cianobacterias bentónicas como Lyngbya, Oscillatoria y Schizothrix pueden producir toxinas que causan dermatitis severa entre los nadadores en contacto con cianobacterias. Aplysiatoxin y debromoaplysiatoxins son activadores de la proteína quinasa C y potentes promotores de tumores. Lyngbyatoxin Una exposición oral ha causado graves inflamaciones y gastrointestinales en los seres humanos. Trichodesmium sp. Que se forman en los mares tropicales, se sabe que contiene una neurotoxina todavía no. Aunque comparativamente poco estudiada, componentes de la pared celular, en particular endotoxinas lipopolisacárido (LPS), de las cianobacterias pueden contribuir a problemas de salud humana asociados con la exposición a los sucesos en masa de cianobacterias. Cianobacterias son también conocidas para producir otros compuestos bioactivos, algunos de los cuales son de interés médico, así como otros compuestos tóxicos a las cianobacterias, las bacterias, las algas y el zooplancton.

El cyanotoxins son colectivamente responsables de la continuación de una intoxicación de los animales domésticos y salvajes y humanos de víctimas mortales. Cyanotoxins aviar de la mortalidad se ha informado desde principios de 1900 [11]. Más informes recientes de la mortalidad microcystin inducida aviar son de gran azul [12] garzas y flamencos [13]. Si bien estos acontecimientos en sí mismos el documento de constante preocupación para cyanotoxins es la nueva empresa de agua y la acuicultura marina organismos que podrían verse afectados en la mayoría de los Estados Unidos. Antropógenas de las aportaciones de la agricultura, la industria, los residuos municipales y junto con pesada carga de nutrientes de las aguas de uso por la industria de la acuicultura están estimulando floraciones de cianobacterias toxigénicas en alimentos frescos y las explotaciones de acuicultura marina. Cyanotoxins especialmente microcistinas ya han tenido impactos significativos sobre determinados organismos, incluida la acuicultura del salmón, lubina despojado, el camarón y bagre (Tabla 2]. El más bien definido es la pérdida neta de Atlántico-pluma de cría de salmón producido por microcistinas aún desconocidas organismos [14]. Estas pérdidas se han mantenido desde 1991 y han causado pérdidas de salmón en el estado de Washington [Carmichael datos no publicados].

Resultados

ELISA waterbloom análisis de las muestras de campo puso de manifiesto que casi todos tenían niveles de microcystin mensurables, pero que no muestra los niveles que había microcystin superarse más de 100 μ g / L. Esto se debió a la presencia de la sal, que contribuyó a los niveles de peso en seco y para la mezcla de la biomasa en la que no todos se cianobacterias toxigénicas. Dos ejemplos de la prueba de ELISA-microcystin valores encontrados se dan en la Tabla 3 (alta y baja final de la microcystin valores). PPIA El ensayo no respondía así a la presencia de la sal en estas muestras y los resultados no eran satisfactorios para la presentación de informes. Es posible que con más trabajo que el método de preparación de la muestra puede ser mejorada que permite alta sal muestras que se realizarán las pruebas de microcistinas por PPIA.

No todos fitoplancton se identificaron en las muestras de agua. Se hizo hincapié en las cianobacterias toxigénicas. Un resumen de las principales fitoplancton encontrado en las muestras de agua se da en la Tabla 4. Estas cianobacterias son similares a las reportadas en otros trabajos sobre el fitoplancton en el Mar de Salton. Wood et al. [15] También figuran Oscillatoria y Synechococcus de ser bastante común en sus muestras que se obtuvieron durante los meses de enero y junio de 1999. Su trabajo y el de otros que buscan en Salton Sea fitoplancton no investigó la presencia de cyanotoxins como la microcistinas.

Selección de muestras de fitoplancton de casi todos los envíos son más chapada en medio de agar y cultivadas para aislamiento de cianobacterias que pueden ser cyanotoxin productores. En el curso de este proyecto son de plata de 100 muestras y unos 150 cultivos unialgales. Los aislamientos fueron dominados por la filamentosos Oscillatoria y la picoplanktonic Synechococcus. Debido a la duración del estudio fue relativamente corto culturas probados fueron los que respondieron con rapidez a las condiciones de cultivo en nuestras instalaciones. La cultura tipos encontrados en nuestro estudio fueron de nuevo similares a los obtenidos en un estudio realizado por Wood et al. [15]. De estas culturas 50 de la cada vez mejor aislados fueron procesadas y analizadas por ELISA para microcystin. Treinta y cuatro de las 50 cepas cultivadas fueron positivos para microcistinas. Los valores son bajos, oscilando entre detectable (0,147 μ g / L) a 1 μ g / L. Cuatro de estos 34 fueron identificados como culturas Synechococcus y los cuatro fueron positivos para microcistinas por ELISA y LC / MS. Sólo cepa SS-1, de estas cuatro cepas, fue identificado como Synechococcus por PCR.

LC / MS análisis de algunas culturas también se utilizó para confirmar la presencia de microcystin producción. Desde el picoplancton tienen potencial de ser una importante fuente de microcystin el año en el Mar de Salton la presencia y tipo de microcystin en estas culturas fue analizado. Figura 1 y 2 muestran que microcystin-LR y YR, respetuosamente, estuvieron presentes en la cepa SS-1 mientras que la cepa de Synechococcus O-1 de Oscillatoria figura microcystin-LR (Fig. 3].

Cianobacterias 16S rRNA secuencias de genes disponibles de GenBank y las examinadas en el estudio fueron alineados utilizando las múltiples herramientas de alineación de secuencias CLUSTAL W en la versión 1,7 [16]. Esto fue seguido por la conversión a una distancia matriz. La matriz de distancia se utilizó para reconstruir un árbol filogenético (Fig. 4] por el vecino a participar (NJ) CLUSTAL W algoritmo de la versión 1,7, con múltiples sustituciones corregido posiciones y con lagunas excluidos. La cantidad de semillas para la generación de números aleatorios y el número de ensayos de arranque se establecieron a 111 y 1000, respectivamente.

Número de acceso. 16S rRNA secuencias de genes de las cepas utilizadas en este estudio se puede obtener en el Genbank usando el número de acceso: DQ455751 . Resultados de la muestra cultivo, microcystin análisis y generación de la dendrograma microcystin muestran que la producción de Synechococcus fue miembro de la Salton Sea fitoplancton en el curso de este estudio. Desde el dendrograma resultados y la comparación con otras secuencias de genes GenBank encontramos que el Mar de Salton Synechococcus cepa prueba está más cerca de marina Synechococcus cepas de agua dulce que a las cepas de este género. Esto es significativo, ya que demuestra que las cianobacterias marinas pueden producir Microcystins, un hallazgo no demostrado hasta el presente estudio. Esto tiene implicaciones para la posible presencia de microcistinas en otros ambientes marinos y puede hacer microcystin marina HAB, así como un agua dulce toxina HAB.

Cinco de los 20 envíos que figuran orejas grebe tejidos de hígado, el intestino y el estómago de contenidos. Cuadro 5 da los valores para microcystin en estos tejidos, medida por ELISA. En comparación con otros casos de intoxicación microcystin las cantidades encontradas en estas orejas grebe hígados están en el rango de toxicidad aguda y, posiblemente, la toxicidad aguda letal. Por ejemplo microcystin valor de la media en 52 de 39 muestras de hígado humano de las víctimas que murieron durante la diálisis microcystin exposición fue de 223 ng / g [6]. Además de dosis intraperitoneal de ratones mostró que 125 ng / g de microcystin-LR se detectables por ELISA en el hígado de ratones expuestos a una letal inyección intraperitoneal (100 μ g / kg).

Microcystin en determinados tipos de muestras de hígado fueron analizadas por LC / MS. Misa picos indicativos para microcystin-LR YR y se identificaron a pesar de la sensibilidad no es lo suficientemente bajo como para confirmar su presencia por LC / MS-MS.

Discusión

El grupo de microcistinas cyanotoxin debe ser considerada como una posible causa de los contingentes grebe morbilidad y mortalidad en el Salton Sea y los esfuerzos para reparar los Salton Sea la calidad del agua debe tener esto en cuenta. Nuestro estudio no incluyen el control de la exposición a los estudios grebes y esto es evidente la necesidad de futuras investigaciones con el fin de determinar el papel de cyanotoxins en estas toxicidades. Asimismo, no investigó las posibles rutas por las que microcistinas vector en grebe hígado e intestinos-otro importante estudio que debe realizarse. Finalmente la conclusión de que todas las cepas cultivadas de la picoplancton Synechococcus produce microcystin es importante en sí mismo, sino que, además, la PCR basada en la genética lo coloca dentro de la marina Synechococcus grupo es aún más significativo. Es evidente que es preciso seguir trabajando para extender este hallazgo y aclarar si marina Synechococcus producir microcystin son generalizadas en el Salton Sea y en otros sistemas marinos. Niveles de salinidad puede ser un factor importante en la selección de productores para la microcystin. En un estudio sobre el río Swan Australia, Orr et al. [17] demostró que las culturas de laboratorio de producción de microcystin Microcystis aeruginosa son más tolerantes a las altas concentraciones de sal y fueron seleccionados para preferentemente, como se aumentaron los niveles de sal en los medios de cultivo.

Los esfuerzos por reducir la salinidad y mejorar la calidad del agua en el Mar de Salton debería considerar la posibilidad de que los géneros de cianobacterias actualmente en la alta mar no son productores de microcistinas. Si se bajan sin salinidad también la gestión de los niveles de los principales nutrientes como el nitrógeno y el fósforo otros géneros de cianobacterias que producen niveles más elevados (aguda letal) de microcistinas pueden ser seleccionados para. Estos podrían incluir los géneros Microcystis y Anabaena. Waterblooms de estos géneros son típicamente más intensa y se presente un mayor riesgo de cyanotoxin (microcistinas, anatoxins, cylindrospermopsin y saxitoxins) riesgos.

Conclusión

Una investigación para determinar el papel de cyanotoxins en grebe mortalidad y morbilidad en el Mar de Salton se inició en noviembre de 1999 y finalizó en abril de 2001. Agua fechas de muestreo varió, pero las muestras fueron recibidas de cada mes, con excepción de mayo, junio y julio de 2000. Veinte envíos se recibieron durante este período de 18 meses. Quince de los envíos contenía agua y muestras de fitoplancton mientras que seis muestras de tejido que figuran grebe (un envío contenga el agua y muestras de tejidos). Las muestras de agua que contienen los números de las cianobacterias en dar un visible color a las muestras de agua (aprox. 10 5 y 10 7 células / ml) fueron liofilizados y analizadas para microcistinas por ELISA. Aproximadamente el 85% de las 247 muestras fueron positivas para microcistinas. Las concentraciones de microcistinas son típicamente menos de 100 μ g / gdw. Esta concentración es en general inferior a la necesaria para causar toxicidad aguda letal de la ingestión de flores muestras de los mamíferos.

Durante todo el período de muestreo la mayoría de las muestras de agua fueron dominadas por el género Oscillatoria filamentosos y la picoplanktic género Synechococcus. El aislamiento, la cultura y la técnica ELISA para microcystin de 50 aislamientos de la cepa encontró que microcistinas son producidas por todas las cepas - aunque en niveles muy bajos (<1 μ g / gdw). La producción de géneros de los niveles mensurables microcystin incluyen principalmente Synechococcus y Oscillatoria. Otros géneros positivo microcystin incluido Gloeocapsa, Phormidium, Aphanothece y Lyngbya.

PCR 16S rRNA análisis se hizo sobre una cepa de Synechococcus, SS-1. Los resultados confirmaron que esta cepa fue Synechococcus y la comparación con un grupo de marinos Synechococcus apoya una conclusión de que esta cepa de Synechococcus es más similar a la marina de agua dulce que a los miembros de este género. Las cuatro cepas fueron Synechococcus demostrado por ELISA y LC / MS para producir las microcistinas-MCYST-LR y MCYST-YR.

Microcistinas fueron detectados por ELISA en la mayoría de las muestras de hígado y el intestino de grebes recogidos debido a la morbilidad o la mortalidad. Las concentraciones de microcistinas no siempre eran lo suficientemente alto como para tener en cuenta la toxicidad letal aguda (<50 ng / g), pero un número significativo de muestras de hígado contiene microcystin nivel lo suficientemente elevado como para tener en cuenta la toxicidad aguda letal (> 50 ng / g) .

Aunque la concentración de microcistinas en las muestras de agua y en los aislamientos de la cepa cianobacterias no fueron lo suficientemente alto como para tener en cuenta la toxicidad aguda letal, en los niveles grebe hígados menudo sugieren aguda o toxicidad aguda letal podría ocurrir. Esto sugiere que microcistinas acumulado, por un todavía desconocido vector (s), en grebe tejidos a niveles que pueden ser letales.

Métodos
Recogida de muestras, envío y manipulación

Las muestras de agua fueron recolectadas por personal de la Salton Sea Refugio de Vida Silvestre, según la definición de las necesidades del proyecto, el calendario de trabajo para el Salton Sea Refugio de Vida Silvestre de personal y, a veces, el clima y otras condiciones logísticas. Colecciones comenzó en noviembre de 1999 y finalizó en abril de 2001. Fechas de muestreo varió, pero las muestras fueron recibidas de cada mes, con excepción de mayo, junio y julio de 2000. Veinte envíos se recibieron durante este período de 18 meses. Quince de los envíos contenía agua y muestras de plancton mientras que seis muestras de tejido que figuran grebe (un envío contenga el agua y muestras de tejidos). Grebe necropsias de tejido y los traslados se realizaron por personal de la SS y de personal Refugio Nacional de Vida Silvestre en el Centro de Salud-USGS en Madison, Wisconsin (Chris Franson) después de la recogida por el personal de Salton Sea. Control grebe muestras de tejidos fueron arreglados por Chris Franson y fueron recolectados en el lago Mono de California durante el mes de octubre de 2000.

Kits de muestra utilizada para reunir y enviar el toxigénicas muestras de algas, figuran:

1. (1) enfriador de envío

2. Gran bolsa de línea (para el revestimiento interior del refrigerador) y el cable de empate en la votación para garantizar su cierre

3. 500 ml de muestra de botellas Nalgene

4. Zip-lock bolsa (para los que remite el informe muestra el formulario)

5. Hielo-pack

Lugares de extracción de la muestra

Durante el tiempo en que se hicieron los envíos 1-3 un transecto sistema se utilizó para la recolección de muestras. Estos transectos se establecieron por Salton Sea personal y ensenadas cubiertos río, aguas abiertas y las zonas cerca de la costa. Más tarde se determinó que la mayoría de fitoplancton se encuentra cerca de zonas de río ensenadas donde la salinidad es más baja. Esta fue también la áreas en las que la mortalidad de aves fueron típicamente más altos. Ello se tradujo en 4 sitios de la muestra: A = río Alamo, N = New River, O = abierto de agua y 1 ubicación en el norte, W = Whitewater Río. Figura 5 da la visión de conjunto de la muestra de sitios de la Salton Sea para este proyecto.

Ejemplo de recepción y procesamiento

1. Las muestras fueron conectados, y luego almacenarse a 4 ° C para el fitoplancton y en el análisis de -80 ° C en la preparación de liofilización, la extracción y el análisis de la toxina. Un típico régimen de tratamiento para este tipo de muestras fue el siguiente: 1) Las muestras se han registrado en la muestra y la ubicación y condiciones que se observaron. 2) Las muestras se dividieron, con la mayor parte de la muestra está liofilizada y una pequeña cantidad de fitoplancton conservados examen y la definición de los principales cianobacterias presentes. 3) Dado que la mayor parte del peso seco de una muestra fue la sal, sólo visible verde o verde marrón muestras se utilizaron para los análisis microcystin. 4) Todas las muestras que habían identificable cianobacterias en ellos, por observación microscópica, o bien se colocaron en tubos con líquido cultura (CT medio más sal) o en placas de agar que contiene más sales CT mediano. Otras cianobacterias crecimiento de los medios de comunicación se pusieron a prueba inicialmente incluidos BG-11, ASM-1 y Z-8, pero los medios de comunicación además de la sal CT se encontró a dar el mejor crecimiento global de los resultados.

Taxonomía de las cianobacterias aislamientos Salton Sea

Cultivadas de los aislados fueron examinadas en un microscopio Nikon Optiphot fase con la fase óptica y de fluorescencia. Taxonomía, sobre la base de caracteres morfológicos, se determinó a partir de referencia a Komarek y Anagnostidis [18], Komarek y Anagnostidis [19], Desikachary [20] y [21] Carpenter.

Detección de microcistinas

La más común de la cyanotoxins, es probable encontrar en este estudio, son el péptido cíclico hepatotóxicos microcistinas y nodularins. La rápida y sensible ahora existen métodos para la detección y vigilancia de estas toxinas en muestras ambientales (agua, las células, los sedimentos y de tejidos de animales). Esto incluye un anticuerpo policlonal sensible inmunoensayo, desarrollado por Chu FS en la Univ. De Wisconsin, y adaptada por una y Carmichael [23] y Carmichael y un [24]. Esta enzima inmunoadsorbentes ligados (ELISA), es sensible a ppb y la cruz de anticuerpos reacciona con la mayor parte de la conocida microcistinas. Este ensayo químico es complementado por un ensayo colorimétrico actividad de la enzima [23] que mide el microcystin contra la inhibición de la proteína fosfatasa 1 y 2A. La inhibición de la PP1 y 2A es el mecanismo concreto de acción para microcistinas y está directamente relacionada con la toxicidad microcistinas. Estos dos ensayos se pueden utilizar para vigilar y cuantificar todas las microcistinas en los diversos estudios se señala en esta propuesta.

Ensayo ELISA para el péptido cíclico de microcistinas (MCYST) y nodularin (NODLN). El método se basa en el método descrito anticuerpos policlonales por Chu et al. 1989, 1990 y adaptada por una y Carmichael [23] y Carmichael y un [24]. El nivel de sensibilidad de microcystin / nodularin usar este método es de aproximadamente 0,5 ng / ml. Los valores por debajo o cerca de este nivel no se consideran importantes. Cincuenta microlitros (50 μ l) de la muestra que contiene 500 μ g de algas que se utiliza para el ensayo. Diluciones seriadas, de 10 -1 -10 -4 (por duplicado) se utiliza para ejecutar el ensayo.

Las muestras se ejecutan en un PP1 ensayo de inhibición o 2A. El péptido cíclico de las toxinas del hígado, microcystin y nodularin, han demostrado ser inhibidores potentes y específicos de la proteína fosfatasas 1 y 2A (PP1 y PP2A). La inhibición de estas enzimas se ha demostrado que se correlaciona con la capacidad de estas toxinas a ser promotores tumorales, en especial la promoción de tumores de hígado. El ensayo es, por tanto, útil en combinación con el ensayo ELISA (que las pruebas de la presencia de compuestos - no todos los cuales son bioactivos) como una actividad de ensayo (para medir el real efecto tóxico). El ensayo es de aproximadamente 1000 veces más sensible que el bioensayo de ratón o HPLC. Determinación del PP actividad fue realizada por la medición de la tasa de formación de color de la liberación de P-nitrofenol de la categoría P-nitrofenol fosfato utilizando un Molecular Devices Corp, Vmax cinética lector de microplacas, Palo Alto, CA. [25].

Preparación de muestras para ELISA y LC / MS
La extracción de tejidos

Muestras de hígado o intestino (0.5-1.0 g) fueron homogeneizadas en 10 mL de hexano (Power Gen 125 tejido homogeneizadora, la Ciencia Fisher Pennsylvania, EE.UU.) a 15000 rpm utilizando un 7 mm vio generador diente sonda (Fisher Científico, Pensilvania, EE.UU.). Después de la homogeneización de aproximadamente 1 ml de etanol pf fue agregado a la muestra para disolver la formación de la emulsión. La muestra se agita lentamente para alrededor de 0,5 horas en un agitador orbital. Después de este tiempo, la capa de hexano fue removido, secado con una corriente de aire o nitrógeno y reconstituido en 0,5 ml de MeOH 35%. Preparación de la muestra para la separación de la fracción con microcystin-fue por Isolute C18 embalaje / 3 ml embalse cartucho. El 100% MeOH fracción de este cartucho se secaron con una corriente de aire y se reconstituye en 1 ml de 5% MeOH. Esta fracción se ha utilizado en el ELISA y LC / MS análisis [26].

LC / ESI-MS condiciones

Columna: MetaChem Monochrom C18, 2 × 50 mm, 5 micras tamaño de las partículas

Fase móvil: A) 0,1% de ácido fórmico en agua B) 0,1% de ácido fórmico en acetonitrilo

Desnivel: 25% a 50% B B en 5 minutos, con el primer minuto desviado a los residuos

(Purgar 20 volúmenes de la columna B, con un 50% al final del plazo; equilibrar la columna con 20 volúmenes antes de correr)

Temperatura: 35 grados C (columna para estabilizar la temperatura del calentador)

Flujo: 0,25 mL / min

Volumen de inyección: 20 μ l

Selección de la reacción de Vigilancia (MS / MS) Los experimentos de exploración (con un mínimo de 3 repeticiones)

Límite de detección: 300-500 pg (en la columna)

Límite de cuantificación: 0.5-1.0 ng (en la columna); alta ppm (ng / g-ug / g) para las muestras; precisión ≤ 15% (análisis de trazas de muestras de tejidos); ≤ 5% de las muestras de algas

Eficiencia de extracción (SPE muestra prep): 90%

Ionización represión de la matriz de tejido: 35-40% represión en señal de respuesta

Combinado reducción de la recuperación / respuesta: 50%

Peso espera de las muestras de tejido: 1-2 gr

Base de resolución de los analitos, RT repetibilidad + / - 0,5%

Extracción en fase sólida / preparación de la muestra

Función:

1) eliminación de las interferencias y la columna asesinos

2) la desalinización

3) la concentración o de enriquecimiento de trazas de analito

Capacidad de los SPE cartucho: 10-20 mg analito interferencias + / g sorbente

Cartucho SPE Volumen: 1 μ l disolvente / 1 mg sorbente

PCR aislamientos de cianobacterias
Primer designación y amplificación de la reacción en cadena de la polimerasa

Sobre la base de cianobacterias 16S rRNA gen secuencias de los dos primers para la amplificación y se secuencia; F1 (5 'TAACACATGCAAGTCGAA3'), y de nuevo diseño R4N (5 'CCTACCTTAGGCATCCCC 3'). Esta última tiene una secuencia que muestra una alta especificidad para la familia Nostocaceae, que se comprueban mediante una base de datos de búsqueda BLAST [26]. Reacción en cadena de polimerasa (PCR) de amplificación se realizó en un 80 μ l de mezcla de reacción usando 10-20 ng de DNA genómico, 0,05 unidades / μ l Ampli Taq ADN polimerasa, 10 × buffer que contengan 1,5 mM MgCl 2, 0,2 mM dNTPs, y 0,05 μ M de primers . La reacción fue correr en un Techne Termociclador (Progene, Reino Unido) con un ciclo de 94 ° C durante 5 min., 30 ciclos de 94 ° C durante 30s, 50 º C por 30 años, 70 ° C durante 1 min, y finalmente 72 ° C durante 3 min.

Análisis de secuencias

Productos de PCR fueron purificados mediante la aplicación de la QIA rápido ADN Eliminar Kit (QIAGEN, EE.UU.). Esto se utilizó como plantilla en la secuencia de reacciones utilizando una Applied Biosystems; PRISM Dye Terminator Cycle Secuenciación Listo Reacción Kit suministrado con Ampli Taq ADN polimerasa. Los primers utilizados para la secuenciación de reacción son los mismos que para la amplificación. Productos de las reacciones de secuenciación se analizaron en un Applied Biosystem 310 secuenciador de ADN.

Alineación y análisis filogenéticos

Cianobacterias 16S rRNA secuencias de genes disponibles de GenBank y los encontrados en el presente estudio fueron alineados utilizando CLUSTAL W versión 1,6 [27]. Esto fue seguido por la conversión a una distancia matriz. La matriz de distancia se convirtió en un árbol filogenético utilizando vecino a participar en la (NJ) CLUSTAL W algoritmo de la versión 1,6, con múltiples sustituciones corregido posiciones y con lagunas excluidos. La cantidad de semillas para la generación de números aleatorios y el número de ensayos de arranque se establecieron a 111 y 1000, respectivamente.

Abreviaturas

ELISA ELISA

LC cromatografía líquida

MCYST microcystin

EM espectrometría de masas

BDL debajo de los límites de detección

Conflicto de intereses

Los autores declaran que no tienen intereses en conflicto.

Agradecimientos

El autor agradece Jennifer Flynn inicial para la preparación de muestras y de la cultura, más aislamientos Laurel Carmichael y María Stukenberg para la asistencia técnica de la edición. Jerry Servaites, John Blakelock, Beth Donnelly, Jennifer Ott y Moucan Yuan Se agradecen por su colaboración con el procesamiento de la muestra, taxonomía y / o análisis de microcistinas. También damos las gracias a Tahni Johnson y Chris Franson del Salton Sea Refugio de Vida Silvestre Nacional de la Vida Silvestre y el Laboratorio de Toxicología, respectivamente, para la asistencia con colecciones de muestras y logística. Este trabajo fue apoyado en parte por la Autoridad del Mar Salton a través de la USGS (Contrato # EPA-98-012). El autor está especialmente agradecido a un amigo Milton, Oficial de Proyecto, por su apoyo y aliento de este trabajo.