Plant Methods, 2006; 2: 7-7 (más artículos en esta revista)

Una novela fluorescentes sonda de pH para la expresión en plantas

BioMed Central
Alexander Schulte (aschulte@biochem.uni-kiel.de) [1], Inken Lorenzen (ilorenzen@biochem.uni-kiel.de) [2], Markus Böttcher (boettcher@physio.uni-luebeck.de) [3] , Christoph Plieth (cplieth@zbm.uni-kiel.de) [1]
[1] Zentrum für Biochemie und Molekularbiologie, Universität Kiel, Am Botanischen Garten 9, 24118 Kiel, Germany
[2] Biochemisches Institut, Universität Kiel, Höber-Rudolf-Str. 1 24098 Kiel, Alemania
[3] Botanisches Institut, Universität Kiel, Am Botanischen Garten 9, 24118 Kiel, Germany
[4] Institut für Physiologie, Universität zu Lübeck, Ratzeburger Allee 160, 23538 Lübeck, Germany

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Resumen
Antecedentes

El pH es un parámetro muy importante para el control de muchas vías metabólicas y de señalización en las células vivas. Recombinante fluorescentes indicadores de pH (pHluorins) han entrado en boga para la vigilancia de pH celular. Que se derivan de los más populares GFP Aequorea victoria (Av-GFP). En este caso, presentamos una novela proteína fluorescente pH reportero de la naranja seapen Ptilosarcus gurneyi (Pt-GFP) y comparar sus propiedades con pHluorins de expresión y la utilización de plantas.

Resultados

PHluorins tienen una mayor sensibilidad a pH. Sin embargo, Pt-GFP tiene un pH más amplio de respuesta-, un excelente ratio de gama dinámica y una mejor estabilidad del ácido. Demostramos cómo Pt-GFP expresando Arabidopsis thaliana informe citosólicas pH-clamp y los cambios de pH citosólico en la respuesta a la anoxia y la sal-estrés.

Conclusión

Pt-GFP parece ser la mejor elección cuando se utiliza para la grabación en vivo de las plantas en el pH celular.

Introducción

Proteínas fluorescentes han revolucionado la comprensión de las cascadas de eventos celulares, transducción de señales, y la estructura dinámica [1, 2]. La proteína verde fluorescente de Aequorea victoria (Av-GFP) es el más popular de especies utilizadas por los científicos hasta la fecha. Av-GFP y sus correspondientes ADNc ha sido alterado muchas veces a dar proteínas fluorescentes de mayor eficiencia cuántica, diferentes características espectrales, menos la temperatura Sensibilidad, la mejora de la solubilidad, y los niveles más altos de expresión en otros organismos [por ejemplo [3, 4]]. Aumento de las variantes de Av-GFP se utilizan con frecuencia para decorar las estructuras celulares y las proteínas con el fin de observar la forma, la ubicación y dinámica in vivo [por ejemplo [5 - 12]] o de visualizar la expresión génica y / o actividad de los promotores o potenciadores [13] .

Una de las ventajas de GFPs es su capacidad de la ingeniería a los indicadores de la transducción de señales celulares estudios [por ejemplo, [14 - 16]]. Diseñado GFPs se han utilizado en las plantas de informar de las concentraciones celulares de Ca 2 +, H +, Cl -, y NO 3 - [por ejemplo, [17 - 23]]. N de carga de este indicador es necesario con las buenas prácticas agrarias basadas en sondas y pueden ser adaptadas a casi todos los orgánulos, o en los compartimentos de tejido en cuestión [por ejemplo [8, 9, 11, 12, 24]]. Esto hace que potencialmente derivados de las buenas prácticas agrarias sondas superiores a los pequeños peso molecular tintes fluorescentes utilizados como indicadores de iones siempre que puedan replicar la sensibilidad y capacidad de respuesta de estas sondas.

En particular, dos de pH sensibles variantes de Av-GFP (los llamados pHluorins) se han diseñado [25]. Estos dos periodistas se denominan 'la' y 'eclíptica' pHluorin. Ambos permiten la in vivo-pH grabación. PHluorin la doble excitación es un indicador que eclíptica pHluorin tiene que ser utilizado en la doble modalidad de emisión [21]. Las modificaciones necesarias para la expresión suficiente de Av-GFPs en las plantas (es decir, la eliminación de la críptica intrón, cambios en A. thaliana codón de uso y la mejora de la solubilidad) se han combinado con las propiedades de pHluorins. El pH resultante indicadores se han expresado y se utilizan con éxito en Arabidopsis [21, 26, 27].

Sin embargo, más y más proteínas fluorescentes (FF) de otros organismos marinos se han descubierto con otros interesantes propiedades [28 - 35]. Algunos de estos recién descubiertos PM desvelar ventajas en comparación con las variantes de GFP-Av. Hemos expresado las buenas prácticas agrarias de la naranja seapen (Ptilosarcus gurneyi) en bacterias y plantas. En este sentido, se comparan las propiedades de la Pt-GFP con los de pHluorins y también con tintes fluorescentes convencionales utilizadas para la medición del pH in vivo.

El espectro de un indicador es la fluorescente en una primera aproximación principalmente a la suma o superposición de dos espectros [36]: En primer lugar, el espectro de la libre indicador (en el caso de los indicadores de pH de la forma protonada-) y el segundo el espectro de la Obligado (protonada) indicador moléculas. Hay otros dos diferentes efectos sobre el pH de fluorescencia de los indicadores que hay que distinguir cuando el pH es menor: Primero de fluorescencia de apagado en todas las longitudes de onda. En segundo lugar, el disproportionation espectral (es decir, la atenuación de la gama de de-protonadas indicador en beneficio de la fluorescencia del espectro formado por las moléculas protonadas). Mediciones de la fluorescencia se han establecido para cancelar todas los efectos secundarios sobre la base de las variaciones en el indicador de concentración, la intensidad de la iluminación, etc detector de sensibilidad [37, 38]. Así, sólo el segundo efecto, es decir, espectral disproportionation es esencial y pertinente para ratiometry y, en teoría, la relación sólo se correlaciona con la concentración de analito (aquí [H +]). Un refrescante en todas las longitudes de onda puede considerarse una aparente disminución en el indicador de concentración y, por tanto, irrelevante para ratiometry.

Aquí se presentan todos los espectros de sus normalizado por la zona por tres razones: En primer lugar, esta es una manera de detectar todos los efectos espectrales pertinentes para la medición. En segundo lugar, es la mejor forma de presentar el potencial de la capacidad del indicador (es decir, la mejor pareja de longitudes de onda, la dinámica del cambio, etc) cuando se destinen a la ratiometry y / o relación de imágenes. En tercer lugar, que no requiera un a-priori de los conocimientos de la isosbestic punto.

Al calcular el denominado minimax espectro (es decir, el espectro que se obtiene cuando el mínimo de fluorescencia se resta del máximo de fluorescencia en cada longitud de onda dentro de un conjunto de espectros de escaneado) es posible obtener el indicador de dos importantes características: En primer lugar, el real isosbestic Es el punto donde la longitud de onda de fluorescencia es independiente de disproportionation espectral. Aquí, el minimax espectro, en teoría, es discontinua con pendiente cero, pero, en la práctica, los planteamientos de un mínimo cercano a cero. En segundo lugar, la sensibilidad del indicador, que se define aquí como la integral de la minimax espectro. La sensibilidad es un número en el rango entre cero y dos. Se trata de dos cuando no hay superposición espectral de la protonada y el de-forma protonada del indicador (indicador de la ideal). Se acerca a cero cuando el indicador es menos adecuado para ratiometry. En consecuencia, el espectro normalizado dar el verdadero punto isosbestic mientras que en los espectros de los datos brutos (no da aquí), este punto se desplaza por el efecto de amortiguación superpuestos, y que será distinguido como 'aparente' isosbestic punto.

Resultados y Discusión
Propiedades espectrales de los indicadores de pH recombinante

La indicadores fluorescentes se caracterizan sobre todo por una serie de espectros de fluorescencia tomadas en diferentes concentraciones de analito (aquí: los diferentes valores de pH) y otra idénticas condiciones. El normalizado espectros (de color curvas en la Figura 1] permiten calcular el espectro minimax (líneas grises en la Figura 1], y para extraer una serie de parámetros característicos que dan pistas sobre la calidad de la señal, señal-ruido, la sensibilidad, y la mejor Aplicación de la gama de indicadores y acerca de la configuración óptima óptico cuando se utiliza en vivo. Los parámetros más importantes para el trabajo práctico son los siguientes:

1 La isosbestic puntos λ iso (precisamente, la isoexcitation puntos en el caso de una sonda de doble excitación o isoemission puntos en el caso de una sonda de doble emisión) son las longitudes de onda en que la fluorescencia es independiente del analito indicó concentración (de iones). Aquí, el verdadero punto isosbestic se distingue de la aparente isosbestic punto.

2 picos espectrales hombros o la izquierda (λ 1) y derecho (λ 2) de la isosbestic punto λ iso que varían en sentido contrario cuando la concentración de la sustancia analizada se cambia.

3 El máximo de fluorescencia de longitud de onda (λ max) es el pico en el espectro de emisión en caso de un doble indicador de excitación (como la pHluorin y Pt-GFP) y el máximo en el espectro de excitación en el caso de un doble indicador de emisiones (como PHluorin eclíptica).

4 El Stokes turno de una sonda fluorescente se define por la diferencia entre la longitud de onda de su pico de absorción (Figura 2] y la longitud de onda de su pico de emisión (Figura 1].

5 Los coeficientes máximos y mínimos, R max y min R (es decir, los coeficientes tomado en ausencia del analito o cuando el indicador está saturado de analito).

6 El pK aparente (es decir, el punto medio de la curva de calibración donde la relación llega a la mitad del máximo y mínimo entre R R max) depende de la longitud de onda del elegido (ver datos complementarios en ficheros adicionales 1]. Idealmente, la aparente pK es acerca de la disociación constante que se define por la concentración de la sustancia analizada en que el indicador es la mitad saturado.

7 La gama útil de concentración (eje "x" gama) en la que el indicador es razonablemente aplicado y en los que el logaritmo de la relación depende aproximadamente lineal en el logaritmo de la concentración de analito. En el caso de los indicadores de pH de esta gama está dado por la valores de pH donde la línea recta a través del punto medio de la curva de calibración logarítmica intersecta con log (R max) y log (R min) (Figura 3].

S 8 La sensibilidad del indicador se define aquí (véase la sección de introducción) de la zona o integrante de la minimax espectro. La sensibilidad es excelente cuando S> 0,5 (Tabla 1] y es insignificante cuando S <0,1 (Cuadro 4].

Los parámetros para los tres pH-reportero proteínas discutido aquí, es decir, Pt-GFP, la, y la eclíptica pHluorin Se atribuyen a la comparación en los cuadros 1 y 2. Espectros y curvas de calibración se muestra en la Figura 1. Parámetros de algunos tintes químicos fluorescentes a menudo la utilizan como indicadores de pH in vivo se dan para más, en comparación un nuevo archivo (cuadro).

Al hacer ratio de imágenes, un máximo ratio de fluorescencia rango dinámico (es decir, un máximo ratio de incremento de fluorescencia veces R máx / min R) es deseada con el fin de obtener una óptima relación señal / ruido. Sin embargo, las condiciones experimentales -, en particular, las características espectrales de la serie dispone de filtro y / o espejos dicroicos - a menudo no están optimizados para el uso en la sonda o el cambio de Stokes-el indicador es demasiado pequeño para separar fiable de emisión de fluorescencia de excitación La luz. En el caso de Pt-GFP, por ejemplo, el cambio de Stokes es sólo 6 nm (es decir, derecho pico de excitación λ 2 = 502 nm; máximo de emisión λ max = 508 nm; véase el cuadro 1]. Esto es muy cerca de ser separados por conjuntos de filtro microscópicas convencionales. Por lo tanto, las longitudes de onda distintas de las de dar el máximo rango dinámico ratio son obligatoriamente elegido. Por ello, debe tenerse en cuenta que el punto medio de respuesta y de la curva de calibración (pK aparente) dependerá de las dos longitudes de onda elegida para ratio de mediciones. Este efecto se demuestra como datos complementarios adicionales en el archivo 1 (Figura S1, Mesa de S2).

Para la comparación in vivo de la pHluorin y Pt-GFP hemos utilizado la F475 nm/F390 nm de par de excitación con una gama de emisiones entre 510 nm ≤ ≤ λ em 560 nm. En el cuadro 2 las propiedades ópticas de esta particular pareja se enumeran para la comparación.

Ambos, la eclíptica y pHluorins no difieren significativamente en sus espectros de otras proteínas cuando están fusionados a la N-y / o la C-terminal [21]. Esto también es cierto en el caso de Pt-GFP (observaciones no publicadas). Esta propiedad es importante, ya que las fusiones con péptidos señal de tránsito o se utilizan a menudo para centrarse específicamente en el indicador de subcelulares lugares.

Por comparación directa de las tres sondas de pH de los ratios que trazarán en un log-log escala (Figura 3]. Esto permite determinar el ámbito de la mejor indicador de respuesta (rango dinámico ratio vs. Dinámica rango de pH). El diagrama (Figura 3] muestra claramente que Pt-GFP tiene la mejor respuesta (Δ log (R) pH = 9,8) y la más amplia gama de aplicaciones de pH. La capacidad de respuesta es menor con la pHluorin (2,9) y la eclíptica pHluorin (2,0). Pt-GFP de respuesta también es superior al de los indicadores convencionales de pH (Cuadro S1 adicionales en el archivo]. Sin embargo, Aequorea GFPs tener una mejor sensibilidad que Pt-GFP (Tabla 1], pero la sensibilidad de los tres indicadores recombinante son de magnitud similar (0,65 <S <1) en comparación con los tintes convencionales (Tabla S1).

PH de la estabilidad de GFPs

La fluorescencia de amortiguación en todas las longitudes de onda de bajo pH ya se ha mencionado anteriormente. Esto se debe a reversible protonation de GFPs Av-en el rango 7> pH> 5 irreversible y por cambios conformacionales de proteínas conduce a la inestabilidad en el rango de pH <5 [39, 40]. Este último efecto no es deseable cuando GFPs se utilizan como sondas de pH en la planta. El apoplast de células vegetales suele ser ácida (pH <6,5) [21, 41, 42], y también algunas vacuolas tienen bajo pH. Así, frente al citoplasma de los cambios de pH pueden ser drásticas en las plantas (por ejemplo, ver en vivo los experimentos más adelante). Por lo tanto, es bueno tener un indicador de pH ácido con alta estabilidad y la respuesta en la parte baja del rango de pH.

Para cuantificar la estabilidad en el indicador de bajo pH grabamos GFP fluorescencia y reversibilidad durante su bajo pH-tratamiento (Figura 4]. GFPs de Aequorea victoria (Av-GFPs) no recuperarse de un tratamiento con pH inferior a 4 (Figura 4B], mientras que las buenas prácticas agrarias Ptilosarcus es más estable a pH bajo y hace recuperar a aprox. El 40%, incluso después de 30 minutos a pH = 2.5 (Figura 4A]. Este ácido estabilidad de Pt-GFP es una ventajosa característica especial que permitirá a superar las dificultades que se han experimentado en la Av-GFP se utiliza para la planta de etiquetado vacuolas [8, 12]. Junto con el más amplio rango de pH aplicación Pt-GFP también se puede utilizar para supervisar los cambios en el pH vacuolas y otros ácidos compartimientos en el citoplasma o en las condiciones cuando el entorno celular se enciende hacia el ácidas.

Misa propiedades de los indicadores de pH recombinante

La proteína predice masas de Pt-GFP y pHluorins son aproximadamente 27 kDa. Nos confirmó así denaturating SDS PAGE (datos no presentados). Sin embargo, cuando las proteínas se ejecutan en diferentes masas FPLC se detectaron. Pt-GFP exhibió una masa de aprox. 105 kDa, mientras que en pHluorins se detectaron alrededor de 55 kDa. Esto indica la formación de los dímeros en el caso de pHluorins de tetramers y en el caso de Pt-GFP.

Cruz-recombinante sensibilidad de los indicadores de pH

Cruz-sensibilidades son a menudo los principales inconvenientes cuando se diseñan las proteínas fluorescentes a los indicadores de la transducción de señales celulares estudios [19, 43]. Por lo tanto, los espectros de fluorescencia de las tres sondas de pH se tomaron in vitro con la proteína purificada, para comprobar la posible cloruro de redox y sensibilidades transversales. El cloruro de sensibilidades encontradas (Tabla 3] en el rango de 0 <[Cl -] <1 M (a pH = 7,5 en 50 mM Hepes) son insignificantes (es decir, S <<0,1) y tampoco hay notables Espectral de las diferencias entre la reducción y oxidar sondas (es decir, 20 mM de TDT en desgasificado vs PBS 50 mM H 2 O 2 en PBS).

In vivo recombinante propiedades de los indicadores de pH

Cuando la codificación de cDNA Pt-GFP se transfiere en el genoma de Arabidopsis bajo el control del promotor CaMV 35S, la proteína fluorescente es fácilmente expresa en todas las células de la planta y se distribuye bien en el citoplasma (Figura 5]. Desde Av-GFP se ha experimentado que esta no es una cuestión de tiempo. En primer lugar, la Av-gen GFP no era del todo aceptada por Arabidopsis y se expresó sólo después de un críptico intrón fue retirado de la cDNA [3]. En segundo lugar, la eficiencia cuántica era pobre en el inicio y las mutaciones se introdujeron para aumentar el brillo. En tercer lugar, la distribución en el citoplasma se encontró que era más homogénea y modificaciones necesarias para aumentar la solubilidad citoplásmica de la proteína [4]. Ambos, la alta eficiencia cuántica de Pt-GFP [35] (Patente EE.UU. n º 6.232.107) y su buena expresión en plantas (Figura 5] no hace ninguna alteración de la secuencia de aminoácidos o codón de uso necesario.

Sin embargo, la eficiencia cuántica o brillo de GFPs no se puede comparar directamente in vivo, ya que un menor eficiencia cuántica podría ser compensada por un mayor nivel de expresión. Sin embargo, la dosis o la energía de excitación es crucial para el trabajo práctico, ya que puede dar lugar a la decoloración de fotodaño o cuando demasiado alto. Por lo tanto, en comparación tiempos de exposición necesarios para llegar a una razonable señal en las dos longitudes de onda utilizadas para ratiometry in vivo (Tabla 4]. Cámara CCD-basado en vivo ratio de imágenes de los sistemas de permitir ajustes de longitud de onda-independiente de los tiempos de exposición.

En la Figura 2 se normalizó la absorción por la concentración de proteínas (es decir, por A280). Esto permite una comparación directa de la absorción en el visible y demuestra que Pt-GFP tiene un pico más alto de absorción que pHluorins aquí. Ello contribuye a la necesidad de más baja energía de excitación. Pero su muy baja absorción de 390 nm requiere la F390 nm señal de haber triplicado el tiempo de exposición de la F475 nm señal de estar en el rango óptimo (Cuadro 4]. Fluoresceína derivados como BCECF y FITC han similares asimétrica como espectros Pt-GFP y también requieren ajustes apropiados. Por el contrario, tales AtpHluorins asimétrica ajuste de los tiempos de exposición no es necesaria debido a la mayor simetría en sus espectros. Por lo tanto, la mayor eficiencia cuántica de Pt-GFP no necesariamente llevar adelante un menor en la energía necesaria para la excitación equilibrada señales. Una forma de burlar esta puede elegir en lugar de 390 nm, longitud de onda o en la más próxima a la isosbestic punto.

'En situ'-calibración

Para convertir los datos de fluorescencia proporción de las células vivas en cyt valores de pH, un 'in-situ' procedimiento de calibración se realizó con la misma óptica de configuración como de mediciones in vivo. Por lo tanto, agar fueron decorados con perlas de la proteína fluorescente, insertada entre las hojas de celofán y dializados en el microscopio en contra de buffers de diferentes pH ajustado (Figuras 6A, B]. Relaciones son de trazarse sobre el pH y una curva sigmoidal (Boltzmann función) ajustado a los datos. El bajo nivel máximo de excitación Pt-GFP a 390 nm (Figura 1] podría sostener a conducir a una mayor diferencia en la relación, en particular, a valores de pH fisiológico F390 cuando se utiliza como denominador. Tal espectral desequilibrio entre las dos longitudes de onda de excitación utilizados para ratioing se encuentra también con fluoresceína convencionales derivados utilizados para la medición del pH igual o BCECF FITC. Sin embargo, la errorbars en 6C y 6D Las cifras muestran que la dispersión de Pt-GFP ratios es insignificante si se compara con el aumento de la pHluorin.

Microambientales parámetros tales como la viscosidad, hidrofobicidad, la movilidad de las proteínas, las interacciones y vinculante [44], así como espectral desequilibrio puede atribuirse a los cambios en la respuesta de un indicador cuando van de in vitro (espectrómetro) a la conservación in situ o in vivo al (microscopio ) La grabación. Notable aquí es un cambio de la aparente cuando se comparan las cifras de pK 1B y 6C. Sin embargo, esto no es desastroso, siempre y cuando las grabaciones de datos de calibración y datos in vivo son idénticos.

PH-pinza

El pH citoplásmico en las plantas es así buffer [45] y estrictamente regulado [46]. Sin embargo, es posible ajustar los valores de pH diferentes citoplásmica de la célula del set-point usando ácidos débiles [44, 45] o bases débiles. En este sentido, realizó pH-clamp experimentos con Arabidopsis expresando Pt-GFP y la pHluorin y registró la citoplásmica pH (pH cyt), en condiciones idénticas (Figura 7].

Anoxia - un estímulo abióticos que en gran medida afecta el pH citoplásmico

Anoxia es un típico estrés abiótico factor que aparece por ejemplo en los suelos arcillosos o anegadas. Anoxia se conoce para producir en masa la acidificación del citoplasma. Aquí demostramos cómo expresar Arabidopsis Pt-GFP informe en este sentido (Figura 8]. Citoplásmica pH cambios en la respuesta a los bajos de oxígeno se han reportado muchas veces y cuantificados por diferentes métodos [46, 47]. Felle [48] utilizados pH específicos de microelectrodos y registrados de Medicago sativa bajo anoxia un descenso del pH cyt a 6,8. Esto es aproximadamente la mitad de un pH por debajo de la unidad frente al citoplasma de nivel normal. Un cambio de semejante magnitud se informó de las raíces de maíz [49] y de las células sicómoro [50] para el 31 de P-RMN. Los resultados presentados aquí (Figura 8] y coinciden con los experimentos de Felle [48], Ratcliffe [49], y Gota et al. [50].

Salt estrés - un estímulo abióticos que apenas afecta a pH citoplásmico

Salt estrés es un factor de gran estrés lo cual produce una gran recortes en el rendimiento de los cultivos en todo el mundo ([51]; http://www.plantstress.com]. Una forma de combatir este problema es producir plantas de cultivo con la mejora de la tolerancia de sal [52 - 54]. Un requisito previo para ello es de entender-el transporte de iones y de los mecanismos subyacentes a la sal en la tolerancia a nivel celular y subcelular. Empezamos a estudiar los cambios en las relaciones celular de iones de sal bajo estrés [21, 23]. Aquí usamos Pt-GFP expresando Arabidopsis para demostrar la forma en que el pH citoplásmico se ve afectada por las crecientes concentraciones de NaCl (Figura 9]. El resultado coincide bien con un experimento similar realizado con la pHluorin [21]. Arabidopsis parece estrictamente de control de pH cyt cuando se enfrentan con sal estrés. Aquí (Figura 9] NaCl concentraciones por encima de 100 mM conduce a la ligera acidificación de aproximadamente 0,04 unidades de pH. Sin embargo, un más pronunciado acerca de la acidificación de 0,2 unidades de pH se observa cuando saltstress es puesto en libertad. Este último efecto se puede atribuir a H + Na + junto exportación a través de Na + / H + antiporter [55]. Otros estudios sobre diferentes especies de plantas y realizado con diferentes métodos muestran resultados inconsistentes [55 - 60]. Sin embargo, todos confirman claramente que la sal de estrés (Figura 9] en su caso sólo ligeramente (es decir, cyt Δ pH <0,3) afecta pH cyt en comparación con anaerobiosis (Figura 8].

Resumen

Las ventajas se han encontrado al comparar Pt-GFP con pHluorins:

1 Pt-GFP es fácilmente expresadas por Arabidopsis cDNA sin modificaciones (Figura 5]. Aunque el cDNA se deriva de una clara y totalmente desvinculadas organismo, el codón de uso es aceptado por la planta Arabidopsis y constitutivamente expresa la proteína con alto rendimiento bajo el control de un solo promotor 35S-. El uso de la Av-GFP en las plantas superiores, en cambio, fue inicialmente limitada. Reforma de la codón el uso y la eliminación de un críptico intrón se encontraron necesario expresar Av-GFP en Arabidopsis [3].

2 Pt-GFP es fácilmente soluble y se distribuye bien cuando se expresa en el citoplasma de las plantas (Figura 5], mientras que para el Av-GFPs modificaciones donde encontró beneficiosa para aumentar la solubilidad de proteínas en el citoplasma de la planta [4].

4 La relación de fluorescencia de excitación Pt-GFP tiene un rango dinámico máximo (R max - R min) 15 veces y un coeficiente de incremento máximo (R max / min R) tres veces más alto que el de la pHluorin al utilizar excitations a 390 nm y 475 nm (Tabla 2]. Además, tiene una zona más amplia de la respuesta (Figura 3] y, con ello, también supera fluoresceína convencionales derivados utilizados para la in vivo de las mediciones de pH (datos complementarios de ficheros adicionales en la Tabla S1).

5 Pt-GFP es mucho más robusto a bajo pH (Figura 4]. Esto también hace que sea adecuado para el seguimiento de pH ácido en compartimentos subcelulares o en las condiciones cuando el pH celular se desplaza hacia el ácidas.

En su conjunto, Pt-GFP es un excelente indicador de pH para la excitación de fluorescencia ratio de imágenes y en algunos aspectos superior a pHluorins cuando se utilizan en las plantas.

Materiales y métodos

Norma PCR y técnicas de clonación [61, 62] fueron empleados para todos ingeniero construye se describe a continuación. ADNc de codificación para pHluorins se han clonado y expresado como describe [21].

Bacteriana expresión, purificación, y de los análisis in vitro de GFPs

De ADN que codifica la Pt-GFP (Acc.No. AY015995) ha sido subcloned de un vector pUC18 (Nanolight Technologies, Pinetop, AZ, EE.UU.) en el vector de expresión bacteriana pRSETb (Invitrogen GmbH; Karlsruhe, FRG). Se indujo la producción de proteínas con 1 mM IPTG cuando OD600 = 0,6 y expresó a 20 ° C/300 rpm largo de la noche (es decir, 15 h). Para el aislamiento de proteínas por bacterias fueron craqueados sonificación (HD2200 y MS73, Bandelin, Berlín, Alemania) en 200 mM de fosfato buffer (pH 7.5). Lisado bacteriano se pre-limpiado en 4000 × g durante 2 horas a 4 ° C. Resto de los desechos se eliminan de la sobrenadante de la filtración a través de un 0,45 μ m de nylon filtro. El 6xHis-etiquetados proteína fluorescente fue purificado y concentrado a través de un Ni 2 + / NTA-agarosa columna (Qiagen, Hilden, Alemania). Gel de filtración a través de una columna PAN-25 (Pharmacia Biotech, Freiburg, Alemania) se realizó para eliminar imidazol eluyen de la proteína. El indicador de las proteínas purificadas se evaluaron spectroscopically. Los espectros de fluorescencia (Figura 1] de las proteínas fueron tomadas con un espectrómetro de fluorescencia (F-2500, Hitachi) en 150 mM KCl y 50 mM apropiado orgánicos buffers (Mes, Tuberías, Hepes, grifos) ajustado a la deseada pH con NaOH. Espectros de absorción (Figura 2] se tomaron en buffer fosfato (pH = 7,5) con un espectrómetro de absorción (2100, Hitachi).

Tamaño de la cromatografía de exclusión (FPLC)

Por FPLC proteína ligada a una columna de 0,5 ml de resina Toyopearl (AF-Chelate-650 M; Tosoh Bioscience) lavada con Tris / HCl-buffer (50 mM Tris / HCl pH = 8) y tratados con Enterokinase (EKMax, Invitrogen) Durante 24 horas a RT. Proteínas con Su-Etiqueta cleaved fue lavado de la columna con 2 × 1 ml de PBS y utilizado para la cromatografía líquida rápida de proteínas (FPLC). En resumen, las proteínas son objeto de FPLC a 4 ° C con una columna HiLoad-16/60 Superdex200 (Amersham Biosciences), 1 × equilibrada con PBS (Medicago AB, Uppsala, Suecia), pre-equipado con una columna de guardias, y conducido por Una bomba HPLC (Äkta-Explorer; Amersham Biosciences), con un caudal de 1 ml / min. La columna fue calibrado usando una combinación de cuatro proteínas de peso molecular conocido, es decir, la catalasa (232 kDa), aldolasa (158 kDa), chymotrypsinogen A (25 kDa), y un ribonucleasas (13,7 kDa).

Expresión en plantas

PHluorins de expresión en plantas fueron construidas como se describe en Gao et al. [21]. Pt-GFP cDNA (Nanolight Technologies, Pinetop, AZ, EE.UU.) se expresó en ecotipo Columbia-0 de Arabidopsis thaliana bajo el control del promotor CaMV 35S utilizando la clonación pART7/pART27 / sistema de expresión [63]. Funcionalidad completa de Pt-GFP en pART7 fue evaluada por biolistic bombardeo y la expresión transitoria de jóvenes plantas de Arabidopsis (ecotipo Col-0) subcloning antes de la cinta de cDNA de pART7 en el vector binario pART27. Para mediada por agrobacterium transformación de Arabidopsis thaliana (Col-0), el método floral dip [64] se aplicó.

Microscopía de escaneo láser confocal (CLSM)

Transitoria y estable expresiones de GFPs (Figuras 6] fueron evaluadas por CLSM como se describe [21] utilizando una Leica TCS SP sistema de escaneo láser confocal. Por Pt-GFP 476 nm de excitación el suelo de la línea de los láser de argón fue elegido; emisión a 500-540 nm (canal verde) para GFP fluorescencia y 600-660 nm (canal rojo) de la clorofila autofluorescence; HC PL APD objetivo (40 × petróleo ).

In situ-calibración de las sondas de pH

Para la evaluación de la estabilidad del ácido (Figura 4] y a la conservación in situ, la calibración de los indicadores de pH (Figura 6], la proteína está obligado a Ni 2 +-perlas de agarosa (Qiagen, Hilden, FRG). Fluorescente cuentas se encuentra entre dos capas de celulosa (Cellophane) y dializados en el microscopio en contra de las soluciones tampón indica en cifras.

In vivo pH-grabación

Para la grabación en vivo de fluorescencia ratios (Figuras 7, 8, 9] Arabidopsis transgénicas fueron cultivadas en cajas de Petri de 9 cm en vertical, tal como se describe en agar [65] y se utiliza cuando 6 a 14 días. Citoplásmica pH se midió en el peludo cerca de la raíz segmentos de hipocotilo. Condiciones experimentales, perifusion técnica, y la fijación de material vegetal que se describieron anteriormente [44]. Las raíces se colocaron en un volumen de 1,6 ml y perifusion corriente se ajustó a 2,4 ml / min. La figura de amortiguación perifused KCl, MgCl 2, y CaCl 2, 0,1 mM de cada uno y 5 mM MES / NaOH ajustada a pH = 5,4. Para pH-abrazadera de este buffer se complementó con diferentes concentraciones de butirato de sodio como se indica en la barra superior de la Figura 7.

Ratio de imágenes de fluorescencia

Fluorescencia de imágenes se realizó tal como se describe en esencia [21, 23]. En pocas palabras, las imágenes de fluorescencia a longitudes de onda de excitación de 475 nm y 390 nm se tomaron cada 12 s con un ratio de imagen de sistema TILL-Fotónica http://www.TILL-photonics.de equipado con un microscopio invertido (Diaphot, Nikon) utilizando luz De un monocromador (Polychrome IV, HASTA). Por la vía de emisión de un filtro de bloque con beamsplitter 500 dcxr y filtro de emisión HQ535/50 (-Analysentechnik lo tanto, Tübingen, Alemania) se utilizó. HASTA software (TILLVision 3.3) fue utilizado para el procesamiento de datos en bruto. El ratio de fluorescencia F475/F390 se tomó con Pt-GFP y la relación (F390/F475) se adoptó con la pHluorin como una medida de pH.

El análisis de los datos

Cada espectro es normalizado por su integral (es decir, la suma de los valores de fluorescencia, sobre todas las longitudes de onda λ). El espectro minimax F minimax (λ), de un conjunto de espectros se determina restando el mínimo de fluorescencia de la máxima fluorescencia en cada longitud de onda obtenidas en el conjunto de los espectros (es decir, dentro de la gama de concentración de analito escaneadas). El isosbestic punto (λ iso) está determinada por la búsqueda de mínimos en el espectro minimax. Lo ideal es que el espectro es cero minimax en el isosbestic punto (es decir, F minimax (iso λ) = 0). La sensibilidad S se define aquí por la integral de la minimax espectro. La sensibilidad S de cada reportero proteína se calcula para el conjunto de sus espectros de excitación (S x), así como de su correspondiente serie de espectros de emisión (S m). El Boltzmann encajan aquí se ha elegido para el montaje sigmoidal, curvas de calibración de los datos ya que la ecuación de Boltzmann puede ser directamente derivados de la Grynkiewicz ecuación [66] para describir la relación entre la concentración de analito en la fluorescencia y tasas de fluorescencia. El ajuste de parámetros de la Boltzmann incluir min R, R max, y la aparente pK del indicador calibrado. Montaje se ha realizado utilizando Origen 7.0 (OriginLab Corp, Northhampton, MA, EE.UU.).

Disponibilidad de los materiales

Semillas de Pt-GFP Arabidopsis están expresando libremente disponibles en el Centro Europeo de Arabidopsis Stock (Nottingham, Reino Unido; http://arabidopsis.info/]. Todos los demás novedoso material descrito en este estudio se pueden obtener con fines no comerciales de la correspondiente solicitud de autor.

Abreviaturas

Av = Aequorea victoria, A = Arabidopsis thaliana, CLSM = microscopía de escaneo láser confocal, di = TDT-Thiotreitol; FPLC = cromatografía líquida rápida de proteínas, GFP = proteína verde fluorescente, Hepes = N-2-hidroxi-etil-piperazina-N ' - 2-etano-sulfónico, Mes = 2 - [N-morpholino]-etano-sulfónico, PBS = buffer fosfato salino; Pt = Ptilosarcus gurneyi

Conflicto de intereses

Los autores declaran que no tienen intereses en conflicto.

Material suplementario
Disposición adicional 1
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Agradecimientos

Damos las gracias a Bruce Bryan de Prolume Ltd (Eagar, AZ, EE.UU.) por el generoso regalo de Pt-GFP cDNA y Toyopearl resina. Damos las gracias a Gero Miesenböck y James Rothman (Memorial Sloan-Kettering Cancer Centre, New York) por el generoso regalo de pHluorin cDNA y Jim Haselhoff (Universidad de Cambridge) para el vector binario pBINm pBINm-gfp5-ER. También muchas gracias a Dana Schöneberg y Steffi Schnell para la asistencia técnica y para Hartmut Kaiser para la lectura crítica del manuscrito.