Radiation Oncology (London, England), 2006; 1: 6-6 (más artículos en esta revista)

La membrana moduladores de la apoptosis dirigida erucylphosphocholine y erucylphosphohomocholine aumentar la respuesta de la radiación de las líneas celulares de glioblastoma humano in vitro

BioMed Central
Amelie Rübel (amelie.ruebel @ med.uni-tuebingen.de) [1], René Handrick (rene.handrick @ med.uni-tuebingen.de) [1], Lars H Lindner (Lars.Lindner @ med.uni - Muenchen.de) [2], Matthias Steiger (Matthias.Steiger @ web.de) [2], Hansjörg Eibl (H. Eibl @ mpi-bpc.mpg.de) [3], Wilfried Budach (wilfried.budach @ uni - Duesseldorf.de) [4], Claus Belka (claus.belka @ uni-tuebingen.de) [1], Verena Jendrossek (verena.jendrossek @ uni-tuebingen.de) [1]
[1] Departamento de Oncología Radiológica, Oncología Radiológica Experimental de la Universidad de Tuebingen, Hoppe-Seyler-Str. 3-72076 Tuebingen, Alemania
[2] Departamento de Medicina Interna III, Hospital Universitario Großhadern, Marchioninistraße 15, D-81377 Munich, Alemania
[3] Instituto Max-Planck de Química Biofísica, Am Fassberg 11, D-37077 Goettingen, Alemania
[4] Departamento de Oncología de Radiación, Moorenstrasse 5, D-40225 Düsseldorf, Alemania

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Resumen
Antecedentes

Alkylphosphocholines constituyen una nueva clase de antineoplásicos fosfolípidos derivados sintéticos que inducen la apoptosis de células tumorales humanas líneas de orientación por las membranas celulares. Recientemente hemos podido demostrar que la primera se aplica por vía intravenosa alkylphosphocholine erucylphosphocholine (ErPC) es un potente inductor de la apoptosis en humanos altamente resistente astrocitoma / glioblastoma líneas celulares in vitro. ErPC era la que atraviesa la barrera hematoencefálica a repetidas inyecciones intravenosas en ratas y, por tanto, constituye un prometedor candidato para la terapia glioblastoma. Objetivo del presente estudio fue analizar los supuestos efectos beneficiosos de ErPC y sus derivados más avanzados clínicamente erucylphosphohomocholine (erucyl-N, N, N-trimethylpropanolaminphosphate, ErPC3, Erufosine ™ en la apoptosis inducida por la radiación y la erradicación de la clonigénicas células tumorales en humanos astrocitoma / Glioblastoma líneas celulares in vitro.

Resultados

Si bien todas las líneas celulares mostraron alta resistencia intrínseca contra la apoptosis inducida por la radiación determinadas por microscopía de fluorescencia, el tratamiento con ErPC y ErPC3 firmemente aumento de la sensibilidad de las células a la radiación inducida por la muerte celular (apoptosis y necrosis). T98G células son más sensibles a la combinación de tratamiento altamente revelador efectos sinérgicos mientras A172 mostró aditivo a la mayoría de los efectos sinérgicos, y U87MG células sub-aditivo, aditivo o sinérgico efectos, en función de las respectivas dosis de radiación, la concentración de las drogas y el tratamiento del tiempo. El tratamiento combinado mejora la terapia de los daños provocados por la mitocondria y la activación de caspasa. Es importante destacar que el tratamiento combinado aumentó también inducidas por la radiación erradicación de la clonigénicas T98G células determinadas por los ensayos de formación de colonias estándar.

Conclusión

Nuestras observaciones que el tratamiento combinado con la radiación ionizante y la membrana moduladores de la apoptosis dirigida ErPC y ErPC3 un enfoque prometedor para el tratamiento de pacientes que padecen glioma maligno. El uso de este innovador concepto en un tratamiento in vivo xenoinjertos ajuste es en virtud de la actual investigación.

Antecedentes

Durante las últimas décadas ha habido pocos progresos en la terapia de glioma maligno en particular la más agresiva manifestación glioblastoma multiforme (GBM). Este infiltrante y destructiva creciente tumor todavía está casi uniformemente fatal con una esperanza de vida de pocas semanas a varios meses. El tratamiento consiste en el postoperatorio de cirugía con radioterapia externa (RT) prolonga la supervivencia media a veces 9-12 meses, con casi ningún beneficio de refinado cirugía, la quimioterapia agresiva o la mejora de la tecnología de la terapia de radiación [1 - 4]. En este sentido, la baja sensibilidad intrínseca de las células malignas a las radiaciones ionizantes y el nivel de ADN dañando las drogas constituye uno de los parámetros críticos para el fracaso del tratamiento. Así, novela enfoques de tratamiento son muy necesarios para mejorar el pronóstico de los pacientes con GBM. Desde defectuoso apoptosis puede contribuir al tratamiento de la resistencia a la apoptosis aberrante de las rutas de señalización de las células tumorales constituyen un blanco atractivo para la modulación de la respuesta de la terapia.

Existe evidencia acumulada de que el tratamiento con radiación ionizante o dañar el ADN de la droga provoca la activación de la intrínseca, independiente de la muerte del receptor de muerte vía. Esta vía crítica implica alteraciones de la función mitocondrial incluyendo el desglose de potencial de membrana mitocondrial y la liberación del citocromo c. Un complejo compuesto citoplásmica de citocromo c, el adaptador de proteína Apaf-1, dATP y pro-caspasa-9, la apoptosome, permite la activación proteolítica de la caspasa iniciadora-9 que posteriormente desencadena la cascada de caspasas efectoras [5]. Pro-y anti-apoptóticos proteínas de la familia Bcl-2 funcionan como reguladores importantes de esta vía mitocondrial de muerte.

La principal vía de señalización de activación de ADN daños apoptosis inducida por aguas arriba de la mitocondria implica la activación transcripcional del gen supresor tumoral p53. P53 dispara hasta reguladas expresión de la pro-apoptótica Bcl-2 y Bax miembro de la familia Bax inducida por daño mitocondrial [6 - 8]. Aparte de Bax, p53-regulado más pro-apoptótica Bcl-2 de proteínas, como el BH-3 sólo proteínas y Puma Noxa puede igualmente participar en la regulación de la permeabilidad mitocondrial y desencadenar la intrínseco, el de la mitocondria de muerte vía para la ejecución de la apoptosis [9 - 11 ]. Además de la activación transcripcional de p53, la liberación de los lípidos proapoptótico segundo mensajero de la ceramida membranas celulares a través de la acción de ácido sphingomyelinase (ASM) ha sido descrito como un importante mediador de la apoptosis inducida por la radiación aguas arriba de la mitocondria (para revisión ver [12 ]) La participación de Bax mitocondrial mediada por alteraciones [13].

Durante la tumorigénesis células tumorales a menudo adquieren mutaciones relacionadas con la resistencia a la apoptosis. Entre las moléculas de señalización que se encuentra alterada o defectuosa en el glioma maligno, miembros de la cascada de señalización de la apoptosis (p53, Bcl-2, para su revisión ver [14]], así como moduladores de la supervivencia indirectamente en la regulación de apoptosis (PI3K/PKB-pathway ; Para revisión ver [15]] han sido identificadas [16 - 18]. En consecuencia, la novela anti-neoplásicas, que se dirigen a los agentes de la apoptosis aberrante y / o vías de supervivencia puede ser adecuado para superar la resistencia intrínseca de glioma maligno. En particular, una combinación de terapia de radiación con un modulador de la apoptosis que anula la resistencia a la radiación puede ser útil para aumentar la respuesta terapéutica a la radiación ionizante [19].

En este sentido, alkylphosphocholines (APC), una clase de antineoplásicos estructurales sintéticos análogos de fosfolípidos, han sido identificados como moduladores de la apoptosis prometedores con un alto valor potencial para el tratamiento del glioma maligno. Estos fármacos dirigidos membrana ejercer potentes efectos citostáticos y citotóxicos in vitro como en modelos animales. Afectan tanto apoptosis y la supervivencia vías de transducción de señales, incluyendo la activación de la pro-apoptótica SAPK / JNK y la inhibición de la vía de los mitógenos MAPK / ERK y PI3K-Akt/PKB supervivencia de las vías (para una revisión ver [20, 21]].

Curiosamente, los análogos sintéticos de fosfolípidos casi no mostrar resistencia cruzada a nivel de ADN dañando las drogas y la radiación ionizante in vitro [22 - 26] y datos no publicados). En cambio, el tratamiento combinado con el ADN perjudiciales medicamentos contra el cáncer y las radiaciones ionizantes punto aditivo a los efectos sinérgicos o [22, 25, 27, 28]. Estos prometedores in vitro y los datos preclínicos sugieren que estos moduladores de la apoptosis dirigida membrana puede ser adecuado para la administración de drogas como única, así como en combinación con radioterapia para superar la resistencia al tratamiento estándar conceptos.

Dado que en el caso de glioma maligno, el uso de agentes destinados a la apoptosis que cruzar la barrera hematoencefálica es obligatorio, el prototipo de aplicación intravenosa APC-derivado ErPC es más prometedores para el tratamiento del glioma maligno: Además de la eficacia citotóxica potente en humanos malignos Astrocitoma / glioblastoma líneas celulares in vitro [20, 24, 29, 30] farmacocinéticos experimentos con ratas sanas reveló que ErPC es capaz de atravesar la barrera hematoencefálica. Tras reiteradas solicitudes por vía intravenosa de la dosis de medicamento no tóxica una acumulación en el tejido cerebral se puede observar. Por otra parte, teniendo en glioma de las ratas una acumulación en el tejido del tumor fue también demostrado [31, 32].

Para proporcionar una base científica para el uso de ErPC y sus derivados estructurales ErPC3 en combinación con la radiación ionizante, el objetivo del presente estudio fue analizar los supuestos efectos beneficiosos de ErPC y ErPC3 sobre la apoptosis inducida por la radiación y la erradicación de la clonigénicas células tumorales en humanos astrocitoma / Glioblastoma líneas celulares in vitro.

Resultados
ErPC induce tiempo-y la apoptosis dependiente de la concentración humana en las líneas celulares de glioma maligno

Hemos demostrado anteriormente que la inducción de la apoptosis a través de la vía intrínseca contribuye a la actividad antineoplásica de ErPC [24, 29, 33]. El presente estudio fue diseñado para fundamentar nuestras conclusiones sobre la importancia de la apoptosis de eficacia citotóxica de ErPC humanos en el glioma maligno. Con este fin, el tiempo y el curso de las relaciones dosis-respuesta para ErPC inducida por la muerte de las células se analizaron en tres astrocitoma / glioblastoma (AC / GBM) líneas celulares (A172, T98G y U87MG) por microscopía de fluorescencia. Combinado con tinción Hoechst33342 IP y permite diferenciar entre la apoptosis y necrosis.

De acuerdo con nuestros resultados anteriores concentraciones, de 25 a 50 μ M ErPC eran suficientes para inducir la detención del crecimiento y la apoptosis en células A172 y T98G dentro de las 48 h de tratamiento. Esto se visualiza en la Fig. 1A por una disminución de la densidad celular y el aumento del número de células con cromatina condensada y fragmentación nuclear indicativo de la apoptosis tras el tratamiento con el aumento de las concentraciones de ErPC. En contraste, 75 a 100 μ M ErPC se necesitaban para inducir efectos similares en las células U87MG (fig. 1A]. Concordantemente, 50 μ M ErPC fuertemente disminuido el número de A172 viables y células T98G con efectos más pronunciados en los tiempos de incubación extendido (72 h) (Fig. 1B]. En cambio, sigue siendo principalmente U87MG células no afectadas por el tratamiento con 50 μ M ErPC incluso después de 72 h de tratamiento (Figura 1B]. En general, todos los AC / GBM líneas celulares probadas fueron sensibles a los efectos citotóxicos de ErPC. ErPC desencadenó tiempo-dependiente de la concentración y de la muerte de las células en todas las líneas celulares con células T98G y A172 ser más sensibles que las células U87MG en todos los puntos (fig. 1C-E].

Humanos glioma maligno líneas celulares son resistentes a la apoptosis inducida por la radiación

Resistencia intrínseca glioma maligno de las células a la radiación ionizante contribuye al fracaso del tratamiento. Para establecer el tiempo y el curso de las relaciones dosis-respuesta inducida por la radiación en la muerte de la célula humana glioma maligno líneas celulares utilizadas en el presente estudio, la apoptosis y muerte celular necrótica se cuantificó 24, 48 y 72 h después de la aplicación de dosis única de 2,5, 5 o 10 Gy . En contraste con el tratamiento con ErPC, T98G, A172 y U87MG células resultó ser bastante resistente contra la apoptosis inducida por la radiación y la necrosis (Fig. 2]. Incluso 72 horas después de una sola dosis de 10 Gy, irradiación casi completamente logrado provocar la muerte celular en células T98G, A172 y células U87MG células resultantes en la muerte de la célula por debajo de las tasas del 20%.

ErPC sensibiliza humanos glioma maligno líneas de células a la apoptosis inducida por la radiación

Se ha demostrado que las radiaciones ionizantes, así como la membrana modulador de la apoptosis dirigida ErPC inducir apoptosis a través de la intrínseca, vía mitocondrial de muerte. A pesar de estas similitudes en la ejecución de la apoptosis, ErPC fue capaz de inducir la apoptosis y necrosis en el glioma maligno líneas celulares resistentes a la radiación inducida por la muerte de la célula (Fig. 1]. Esta observación constituye la razón fundamental para evaluar si el tratamiento combinado con radioterapia ErPC podría aumentar la muerte celular inducida en humanos glioma maligno líneas celulares. Con este fin, T98G, A172 y U87MG células fueron tratados con 2,5, 5 y 10 Gy y / o 0, 12,5, 25, 50, 75 o 100 μ M ErPC. ErPC se añadió al medio de cultivo a 10 minutos después de la irradiación y la inducción de la apoptosis y necrosis se determinó 24 h, 48 hy 72 h después del tratamiento.

Como se muestra en la Fig. 3A tratamiento combinado de T98G células durante 48 h con 10 Gy y 50 μ M ErPC claramente el aumento de los niveles de radiación inducida por apoptosis. El análisis cuantitativo indica que el aumento de la inducción de la muerte celular después de 48 h de tratamiento combinado en comparación con uno de los tratamientos se produjeron en una sola dosis-dependiente de la concentración y de manera rendimiento máximo los niveles de apoptosis en presencia de 50 μ M ErPC (Fig. 3B]. Además, en todas las dosis de radiación a prueba la eficacia del tratamiento combinado ErPC depende de la concentración y el tiempo de tratamiento con efectos más pronunciados a las 72 h (Fig. 3C + D, y los datos no presentados).

Similar a los resultados obtenidos con células T98G-, el tratamiento combinado con el aumento de las concentraciones de ErPC sensibilizado A172 células a la apoptosis inducida por la radiación (Fig. 4]. Como se muestra en la Fig. 4A, la irradiación con 10 Gy sólo inducidos por sí sola el crecimiento detención de las células A172 (disminución de la densidad celular) sin signos morfológicos para la inducción de la apoptosis. En contraste, el tratamiento con 50 μ M ErPC inducida por el crecimiento por sí solo arresto A172 y de la apoptosis de las células. Sin embargo, el nivel de apoptosis aumentado aún más por la administración combinada de ambos tratamientos (Fig. 4A]. Aumento de la citotoxicidad de la combinación depende de la concentración de la droga y la dosis de radiación (fig. 4B]. Si bien la combinación de 12,5 y 25 μ M ErPC sólo ligeramente aumentado la eficacia citotóxica de la radiación ionizante, la combinación de 50 μ M con las radiaciones ionizantes con eficiencia inducida por la muerte de las células producen hasta 57% de células matar a 50 μ M ErPC combinado con 10 Gy (Fig. 4B ). Una vez más, en todas las dosis de radiación a prueba el efecto combinado es claramente el tiempo y la concentración máxima de la citotoxicidad dependiente con μ M en el 50 y 72 h de tratamiento (Fig. 4C + D, y los datos no presentados).

Como se ha mencionado anteriormente, 75 a 100 μ M ErPC se necesitaban para inducir el crecimiento significativo de la detención y la apoptosis en las células U87MG (Fig. 1A, B, E]. Por lo tanto, para poner a prueba los supuestos efectos de la sensibilización de ErPC inducidas por la radiación sobre la muerte celular en células U87MG irradiación se combinó con 0, 50, 75 y 100 μ M ErPC. Fotomicrografías de las células tratadas durante 48 h con 10 Gy, 75 μ M ErPC o la combinación revelan que la irradiación por sí solo el rendimiento de pequeñas cantidades de detención del crecimiento y la apoptosis mientras que el tratamiento con 75 μ M ErPC inducido un fuerte crecimiento y de aumento de las cantidades de detención de la apoptosis en comparación con la radiación sola ( Fig. 5A]. Sin embargo, el tratamiento combinado con 10 Gy y 75 μ M ErPC dado lugar a un nuevo aumento de la inducción de la muerte celular (Fig. 5A].

Como se muestra en la Fig. 5B, una mayor eficacia de la combinación depende de la dosis de radiación y el ErPC-concentración (Fig. 5B]. Similar a los resultados obtenidos con células T98G y A172, en todas las dosis de radiación a prueba la respuesta del tratamiento combinado aumentó en un tiempo-y de manera dependiente de la concentración. Sin embargo, en contraste con el A172 y células T98G, máximo inducción de la muerte celular ya se observó 48 horas después del tratamiento (Fig. 5C + D, y los datos no presentados). En consonancia con la comparativamente baja sensibilidad de las células U87MG a ErPC, masivas tasas de más del 80% de células matar requiere la presencia de 100 μ M ErPC (Fig. 5B-D].

ErPC media aditivo a los efectos sinérgicos de sensibilización sobre la apoptosis inducida por la radiación

Para determinar en qué medida la interacción entre la radiación y ErPC tratos en humanos glioma maligno líneas celulares fueron sub-aditivo, aditivo o incluso sinérgicos, biomathematical se evaluó mediante el análisis isobologram. En general, la sensibilidad de las células de glioma maligno depende de la concentración de fármaco, la dosis de radiación y el tiempo de tratamiento (Fig. 6 + 7]. T98G eran más sensibles a tratamiento combinado que muestra casi exclusivamente los efectos sinérgicos después de 24 h, 48 hy 72 h de tratamiento. El tratamiento combinado de las células A172 reveló sub-aditivo a los efectos sinérgicos después de las 24 h y 72 h, y los efectos sinérgicos después de 48 h de tratamiento. U87MG fueron ligeramente menos sensible frente a T98G y A172 con menos de aditivo a los efectos sinérgicos a las 24 horas y sub-aditivo a los efectos aditivos a las 48 y 72 h después del tratamiento (Fig. 7A-C].

Representante análisis selectivo de las combinaciones 48 h después del tratamiento están representados en la Fig. 6. En T98G células A172 y un efecto aditivo sobre aumento de la citotoxicidad de la combinación se observó después de 48 h de tratamiento con 25 μ M ErPC y 10 Gy (Fig. 6A + B], mientras que en las células U87MG efectos aditivos de 75 μ M ErPC en combinación con 10 Gy Se encontraron (Fig. 6C].

ErPC3 sensibiliza a las células T98G a la apoptosis inducida por la radiación

Basado en la alta capacidad de respuesta de las células T98G a ErPC solo y en combinación con terapia de radiación, hemos ampliado nuestros estudios sobre la ErPC-derivado ErPC3 (Erufosine ™), que es más avanzado en desarrollo clínico (Lars H. Lindner, datos no publicados).

En una primera serie de experimentos de ErPC3 citotóxica eficacia fue evaluada en la mayoría de las células T98G responda las 48 h después del tratamiento con este fármaco, como las concentraciones utilizadas para la ErPC de experimentos (0, 12,5, 25 o 50 μ M ErPC3). Similar a ErPC, su derivado ErPC3 resultó ser un potente inductor de la detención del crecimiento y la apoptosis en las células T98G (Fig. 8A]. En este sentido, ErPC3 ya era efectiva en concentraciones de 12,5 μ M y una más pronunciada citostáticos, y la actividad citotóxica se observó en el aumento de las concentraciones de drogas (Fig. 8A + C]. Dado el potente efecto de la inducción de la apoptosis ErPC3 que posteriormente analizó su putativo de la sensibilización de los efectos inducidos por la radiación sobre la muerte de la célula. Como se muestra en la Fig 8B tratamiento combinado con ErPC3 y 10 Gy de manera eficiente un mayor crecimiento de detención y la muerte de las células apoptóticas en células T98G en comparación con el tratamiento, ya sea por sí sola como se indica por la disminución de la densidad celular y el aumento de número de células con cromatina condensada y fragmentación nuclear, respectivamente. El aumento de la eficacia del tratamiento combinado depende de la concentración de la droga y la dosis de radiación (Fig. 8C]. Curiosamente, la citotoxicidad máxima de la combinación con el 81% de la muerte de la célula ya se obtuvo con 25 μ M ErPC3 en combinación con 10 Gy (Fig. 8C]. Evaluación de la interacción entre la radiación ionizante y ErPC3 por isobologram análisis reveló la mayoría de los efectos sinérgicos, como se muestra en la Fig. 7D y 8D.

El aumento de la eficacia del tratamiento combinado es, en parte debido al aumento de los niveles de apoptosis

Con el fin de obtener una perspectiva de la importancia de la apoptosis sinérgicos para la inducción de muerte celular por tratamiento combinado con radiación ionizante y ErPC o ErPC3 primero analizaron las mecanismo de la muerte celular tras el tratamiento combinado. Como se ha demostrado en la Fig. 9A + B, el tratamiento combinado con 10 Gy y varias concentraciones de ErPC o ErPC3 principalmente a la apoptosis inducida frente a la necrosis, con la excepción de 50 μ M ErPC en combinación con 10 Gy. Curiosamente, en la concentración equimolar de drogas ErPC3 sensibilizado T98G células de manera más eficiente a la apoptosis inducida por la radiación que ErPC (Fig. 9A + B].

Especializado de las proteasas celulares, el caspasas han sido identificados como los principales ejecutores de la muerte de las células apoptóticas. Para demostrar aún más la importancia de la inducción de la apoptosis de la sensibilización de los efectos inducidos por la radiación sobre la muerte de las células que analiza la división de las caspasas efectoras PARP-sustrato, una proteína nuclear que participan en la reparación del ADN. Si bien en el control de las células PARP-división no podría ser detectada, la administración de 25 μ M ErPC dado lugar a la aparición de los fragmentos de cleaved PARP (89 kDa), indicativo de activación de la caspasa-3. En contraste, la radiación de hasta 10 Gy no era suficiente para inducir importantes PARP-división (Fig. 9C y datos no presentados). Aumento de la citotoxicidad de tratamiento combinado con 25 μ M ErPC y 5 Gy fue acompañado por una división más destacado de PARP ErPC-en comparación con el tratamiento solo, indicativo de una mayor activación de la caspasa-y la apoptosis (Fig. 9C].

Nuestras investigaciones anteriores revelaron que la inducción de apoptosis por la radiación ionizante y ErPC implica alteraciones de la función mitocondrial incluyendo el desglose de potencial de membrana mitocondrial y la liberación del citocromo c. Para cuantificar la inducción de la apoptosis por un nuevo método que analiza la terapia inducida por desglose del potencial de membrana mitocondrial (Fig. 10]. De acuerdo con los resultados obtenidos mediante la cuantificación de la apoptosis de células con morfología nuclear ErPC tratamiento combinado con el aumento de la radiación inducida por daño mitocondrial. Estos resultados apuntan a una mayor eficacia de la combinación a nivel de las mitocondrias (Fig. 10A + B].

ErPC y ErPC3 reducir la capacidad de formación de colonias de células T98G y aumento inducido por radiación erradicación de la clonigénicas células T98G

Hasta ahora nuestros datos indicaban que ErPC y ErPC3 incrementar la sensibilidad de AC / GBM líneas celulares a la muerte celular inducida por la radiación, en particular a la apoptosis. Para obtener más información sobre la eficacia citotóxica de ErPC/ErPC3 tratamiento solo y en combinación con radiación, nivel de formación de colonias se realizaron ensayos clínicos relevantes como punto final. Como se muestra en la Figura 11A + C ErPC y ErPC3 reducido clonigénicas supervivencia de T98G a concentraciones de más de 12,5 μ M. Un destacado sobreviviente de reducción de la fracción se obtuvo tras el tratamiento con 25 μ M ErPC. ErPC3 reducido aún más eficiente clonigénicas la supervivencia celular de células T98G: Si bien 16 μ M ErPC3 eran suficientes para erradicar el 90% de las células tumorales clonigénicas, 20 μ M ErPC se necesitaban para inducir el mismo efecto (Fig. 11A + C].

En una siguiente serie de experimentos de prueba y por la tarde si el tratamiento combinado con ErPC o ErPC3 alteraría clonigénicas erradicación de las células tumorales en respuesta a la radiación ionizante. A pesar de las mencionadas T98G resistencia de las células a la apoptosis inducida por la radiación irradiación pudo reducir clonigénicas la supervivencia celular en una forma dependiente de la dosis (Fig. 11B + D]. Sin embargo, la combinación con ErPC o ErPC3 dado lugar a una nueva disminución en la supervivencia de las células T98G clonigénicas a irradiaton (Fig. 11B + D]. Como se visualiza en la Fig. 11B y 11D, el tratamiento combinado de las células irradiadas con el aumento de las concentraciones de ErPC y ErPC3 llevado a un cambio paralelo de las curvas de respuesta por lo menos en el rango de dosis baja indicativa de efectos aditivos, mientras que a dosis más altas no se alcanzó la aditividad . Curiosamente, el tratamiento combinado con 16 μ M ErPC3 y de las radiaciones ionizantes fue más eficiente en la erradicación de la clonigénicas tumor de las células de la respectiva combinación con equimolar ErPC de concentraciones.

Discusión

Sobre la base de la hipótesis de que los derivados sintéticos de fosfolípidos y de las radiaciones ionizantes inducen la apoptosis a través de distintos blancos principales para activar la vía intrínseca de muerte, citotóxicos eficacia del tratamiento combinado con ambos tratamientos fue evaluada en humanos glioma maligno líneas celulares in vitro. En nuestra investigación hemos demostrado por primera vez que el prototipo se aplica por vía intravenosa APC-derivados ErPC y ErPC3 aumento de la radiación respuesta humanos glioma maligno líneas celulares. En ensayos de corto plazo ErPC y ErPC3 mayor sensibilidad de estas células altamente resistentes a la radiación inducida por la muerte de la célula, incluida la apoptosis. Cualquier combinación de la radiación con ErPC fue más eficaz que el tratamiento ya sea por sí solo; dependiendo del tipo de células, el tiempo de tratamiento, la dosis y el nivel de concentración de drogas sub-aditivo, sinérgico o aditivo se observaron efectos. En el largo plazo la formación de colonias de ensayos ErPC y ErPC3 se muestra eficiente para matar las células tumorales clonigénicas por su cuenta y al aumento inducido por radiación clonigénicas erradicación de las células tumorales a tratamiento combinado en un aditivo.

La observación de corto plazo potentes efectos citotóxicos y citostáticos de ErPC y ErPC3 humanos glioma maligno en líneas celulares in vitro es consistente con anteriores investigaciones en diversas líneas celulares de cáncer humano incluyendo glioma maligno ([24, 29, 30] y datos no publicados). Como más clínicamente relevante punto final nos demuestran que estos medicamentos reducen la membrana orientada colonia formación en ensayos de largo plazo, indicativa de erradicación de la clonigénicas células tumorales.

Hasta ahora, sólo unos pocos estudios in vitro a prueba la eficacia de los análogos sintéticos de fosfolípidos en combinación con la radiación ionizante. En este sentido, el APC-derivados hexadecylphosphocholine (HePC) y Octadecyl-(N, N-dimetil-piperidinio-4-il)-fosfato (D-21266; Perifosine ™) mejorar la apoptosis inducida por la radiación de líneas de células leucémicas humanas en un Aditivo, el prototipo alkyllysophospholipid Edelfosine (Et-18-OCH 3, 1 - O-Octadecyl-2-O-metil-rac-glycero-3-phosphocholine), incluso de forma sinérgica. Similar a ErPC y ErPC3, HePC fue capaz de superar la resistencia de las células tumorales humanas a la apoptosis inducida por la radiación. De acuerdo con nuestras observaciones, el tratamiento combinado de la línea celular epitelial con Et-18-OCH 3 o HePC y de las radiaciones ionizantes también mayor clonigénicas erradicación de la colonia de células tumorales en ensayos de la formación [22]. Por lo tanto, nuestros datos son consistentes con estos informes sobre rentables in vitro efectos de la combinación de tratamiento con derivados sintéticos de fosfolípidos y de las radiaciones ionizantes con respecto a la apoptosis inducida por la radiación y clonigénicas matar células en líneas celulares de cáncer humano.

Curiosamente, mecanicista investigaciones apuntan a una función crítica de la inducción de la apoptosis de mejorar la eficacia de la combinación. En este sentido, sobre todo para ErPC3 inducción de la apoptosis es el modo principal de la muerte de las células después de poco tiempo de tratamiento. El nivel molecular, los efectos sinérgicos sobre la inducción de la apoptosis al tratamiento combinado se refleje en una mayor división de la caspasa-3 sustrato PARP. Por otra parte, los efectos sinérgicos que participan en la inducción de apoptosis mayor daño mitocondrial. Así, los efectos beneficiosos de estos nuevos fármacos sobre la eficacia de las radiaciones ionizantes al menos, en parte se debió al aumento de la inducción de la apoptosis a nivel de la mitocondria. Sin embargo, la importancia de la apoptosis de las respuestas a largo plazo, la radiación de las células tumorales y tejidos normales aún es controvertido y se sugirió que depender de los celulares del sistema [34, 35]. En nuestras manos cuantificación de la inducción de la apoptosis en ensayos de corto plazo no fueron predictivos de la respuesta de la radiación en los ensayos de formación de colonias con respecto a las radiaciones ionizantes solo. Sin embargo, la inducción de la apoptosis eficiente al tratamiento con ErPC solo o en combinación con radiación ionizante se asoció con un aumento de clonigénicas erradicación de las células tumorales en ensayos de formación de colonias. Así, la combinación de las radiaciones ionizantes y los moduladores de la apoptosis y ErPC claramente ErPC3 puede aumentar la eficacia de los tratamientos de radiación. Similares resultados fueron obtenidos recientemente mediante la radiación ionizante en combinación con la proapoptótico factor de necrosis tumoral alfa relacionados con la inducción de la apoptosis ligando RUTA [36, 37] y el inhibidor de la proteína quinasa PKC412, respectivamente [38]. Sin embargo, ha de tenerse en cuenta, que la detención del ciclo celular en G2 también contribuye a la toxicidad de ErPC/ErPC3 en células de glioblastoma humano (datos no presentados).

Aunque varios derivados sintéticos de fosfolípidos muestran prometedoras antineoplásicos en la actividad preclínica de la investigación, hay que tener en cuenta que muy pocos fármacos puede ser adecuado para el futuro desarrollo clínico de drogas. A pesar de su potente acción antineoplásicos in vitro e in vivo la actividad de la prototípicos alkyllysophospholipid derivado Et-18-OCH 3 sólo es moderada. Esto se atribuyó al alto nivel de biotransformación después de la aplicación sistémica que se traduce en una falta de tejido acumulación [39]. Hemolítica efectos secundarios de HePC, la primera APC-derivado introducido con éxito en la clínica, se oponen a su aplicación por vía intravenosa. En consecuencia, el uso clínico de HePC es o bien limitado a la aplicación tópica como una eficaz opción de tratamiento paliativo de las metástasis cutáneas de pacientes con cáncer de mama, así como para el linfoma maligno cutáneo (Miltex ™) [40 - 44] o de aplicación oral (Impavido ™). Las dosis diarias de 100 mg HePC que han demostrado ser insuficientes para el tratamiento del cáncer han demostrado curar la leishmaniasis visceral [45]. El escalado de la dosis de forma oral dado HePC es impedido por toxicidad gastrointestinal.

Perifosine, un heterocíclicos APC, mostraron prometedores antineoplásicos en la actividad preclínica de la investigación [46] y ya entró clínicos Fase Iy la Fase II de ensayos clínicos para probar la viabilidad y la tolerabilidad de la administración oral de los fármacos en monoterapia y en combinación con la radioterapia en pacientes con tumores sólidos avanzados. La administración oral de Perifosine es seguro y sobre todo los resultados en la fatiga y los efectos secundarios gastrointestinales mientras que la toxicidad no hematológica se observó [19, 47 - 50]. Desafortunadamente, no significativa actividad clínica se encontró solo después de la administración de fármacos en pacientes con melanoma metastásico y el cáncer de próstata independiente de andrógenos [49, 50].

En contraste con las mencionadas drogas, y de sus derivados ErPC falta ErPC3 hemolítica efectos secundarios y, por consiguiente, constituyen los primeros sintéticos análogos de fosfolípidos que son apropiados para su administración intravenosa. Iv después de repetidas aplicaciones de la dosis no tóxica de drogas ErPC se acumula en diversos tejidos sanos de ratas incluido el tejido cerebral [31]. Afortunadamente, ErPC y ErPC3 son incluso más potente que en HePC preclínicos investigaciones [29, 51].

Curiosamente, en nuestro estudio in vitro ErPC3 era una más eficaz inductor de la apoptosis en las células T98G que ErPC cuando se administra solo y en combinación con la radiación ionizante. Además, en los ensayos de formación de colonias ErPC3 también resultó ser la más activa en su uso como fármaco único o en combinación con la radiación ionizante. En este sentido, similares de erradicación de las células tumorales requiere clonigénicas 16 μ M ErPC3 o 20 μ M ErPC, respectivamente. Lo mismo ocurre con el tratamiento combinado con 10 Gy y 16 μ M ErPC3 frente a 10 Gy y 25 μ M ErPC.

Las mencionadas conclusiones sobre la mejora de la actividad en comparación con antineoplásicos ErPC junto con su mayor solubilidad en soluciones acuosas que permite simplificar la administración intravenosa en vivo, favor de seguir ErPC3 desarrollo clínico. En consecuencia, un ensayo clínico de fase I se inició en el Departamento de Medicina Interna III, Hospital Universitario Großhadern, Munich, Alemania, para probar la viabilidad y la tolerabilidad de la administración intravenosa de ErPC3 a los pacientes con neoplasias malignas avanzadas. A medida que la dosis máxima tolerada (DMT) de ErPC3 todavía no se ha alcanzado, el reclutamiento de pacientes continúa (Dr. LH Lindner, Departamento de Medicina Interna III, Hospital Universitario Großhadern, Munich, Alemania, comunicación personal).

En resumen nuestro estudio demuestra el aumento de la eficacia de las radiaciones ionizantes en combinación con la membrana proapoptótico orientados ErPC y moduladores de la apoptosis en humanos ErPC3 glioma maligno líneas celulares in vitro. Ambos fármacos sensibilizado humanos glioma maligno líneas de células a la radiación-incluyendo la muerte celular inducida por la apoptosis y el aumento de la radiación inducida clonigénicas erradicación de las células tumorales. La mejora de la eficacia de ErPC3 hacer frente a este ErPC APC derivado una herramienta promisoria para el tratamiento combinado los enfoques innovadores en el tratamiento de pacientes que padecen glioma maligno. El moleculares necesarios para el aumento de la eficacia de la radioterapia en combinación con ErPC y ErPC3 requieren mayor definición.

Métodos
Productos químicos y drogas

ErPC y ErPC3 fueron sintetizados por H. Eibl, el Instituto Max Planck de Química Biofísica, Goettingen, Alemania. Para los experimentos in vitro, ErPC se disolvió en 200 μ l de etanol, y se diluye con RPMI1640 suplementado con 10% (v / v) de suero fetal ternero a una concentración de 10 mM (solución madre). El final de las concentraciones de etanol en los experimentos de cultivo de tejidos se encontraban por debajo de 0,05% (v / v). ErPC3 se disolvió en medio RPMI1640 complementado con un 10% (v / v) de suero fetal ternero a una concentración de 10 mM (solución madre) sin previa disolución en etanol. Hoechst33342 (Calbiochem, Bad Soden, Alemania) fue disuelto en agua destilada como una solución 1,5 mM de existencias. Iodide propidio (Sigma) fue disuelto en agua destilada a 5 mg / ml solución madre.

Rabbit anti-longitud completa anti-PARP y conejo anti-cleaved PARP fueron de Señalización Celular (New England Biolabs, Schwalbach / Taunus, Alemania). Mouse β-actina fue de Sigma. HRP-conjugadas anti-conejo anticuerpos secundarios se obtuvieron de Amersham Biosciences-, Freiburg, Alemania.

Todos los demás productos químicos fueron adquiridos de Sigma-Aldrich (Deisenhofen, Alemania), si no que se especifique.

Líneas celulares, cultivo celular y celulares tratamiento

T98G, U87MG y A172 astrocitoma / glioblastoma líneas celulares eran de ATCC (Bethesda, Maryland, EE.UU.). Para todos los experimentos con células fueron cultivadas en RPMI 1640 suplementado con 10% (v / v) de suero de ternera fetal (Gibco Life Technologies, Eggenstein, Alemania) y se mantendrá en humidificado incubadora a 37 ° Cy 5% de CO 2.

La irradiación se realizó a temperatura ambiente de 6 MV de fotones o Siemens Elekta aceleradores lineales con una tasa de dosis de 2 ó 4 Gy por min, respectivamente.

Determinación de la apoptosis

Se analizó la muerte celular por microscopía de fluorescencia combinado a la tinción de las células con Hoechst33342 y yoduro de propidio (PI) para discriminar entre las células apoptóticas y necróticas. En resumen, las células fueron incubadas con Hoechst33342 a una concentración final de 1,5 μ M y PI a una concentración final de 2,5 μ g / ml durante 10 min. Morfología de células se determinó mediante microscopía de fluorescencia (Zeiss Axiovert 200, Carl Zeiss, Jena, Alemania) usando un G365/FT395/LP420 filterset. Las células se analizaron en la magnificación 40x y documentado utilizando una cámara CCD dispositivo (Zeiss Axiocam MR). En apoptosis (azul o rosa manchado con núcleos apoptóticos morfología nuclear) y células necróticas (rosa manchado núcleos sin fragmentación) se cuantificaron por el recuento de células.

Determinación de la división PARP -

PARP división fue determinada por Western blot de extractos citosólica. Con este fin, las células (1 × 10 7 / ml) fueron lyzed durante 10 min a 99 ° C en buffer de lisis CCT (62,5 mM Tris-HCl (pH 6,8), el 2% (w / v) SDS, 10% (V / v) de glicerol, 50 mM DTT, 0,01% (w / v) bromphenolblue). 20 μ g lisado fueron separados por SDS-PAGE y borró a PVDF-membranas (Roth, Karlsruhe, Alemania). Blots fueron bloqueados durante 1 h en una solución tampón que contiene PBS 0,05% (v / v) de Tween 20 y el 5% (w / v) de leche en polvo sin grasa. La membrana se incubó durante la noche a 4 ° C con los respectivos primaria de anticuerpos (anti-PARP; anti-cleaved PARP; 1:1000). Después de repetidos lavados con TBS/Tween-20 (0,05%, v / v) de la membrana se incubó durante 1 h a temperatura ambiente con el anticuerpo secundario (anti-IgG-AP 1:2000, Santa-Cruz-Biotech, Heidelberg, Alemania ) Y de nuevo lavar varias veces con TBS / Tween. La detección de la unión de los anticuerpos se realizó por aumento de la tinción de chemoluminescence (ECL Western Blot sistema de análisis, de Amersham Biosciences, Freiburg, Alemania). Igualdad de proteína de carga fue confirmada por tinción de Coomassie y β-actina de detección.

Determinación del potencial de membrana mitocondrial

El potencial transmembrana mitocondrial (ΔΨ m), se analizó por citometría de flujo utilizando el ΔΨ m específicas mancha TMRE (tetramethylrhodamine-ethylester-perclorato) (Molecular Probes, Mobitech, Goettingen Alemania). Con este fin, las células fueron cargados durante 30 min a 37 ° C con 25 nM TMRE y posteriormente analizadas por citometría de flujo. Preincubación con 1 μ M, de la CCCP ionóforo de protones (carbonylcyanide-m-chlorophenylhydrazone) se utilizó como control positivo para completar despolarización.

Ensayos de formación de colonias

Crecido exponencialmente células fueron sembradas y cosechadas en 6 y placas de cultivo de tejidos o frascos en una densidad de 50 a 128000 células dependiendo de las dosis de irradiación y ErPC. Después de 24 h las células fueron irradiados (2,5, 5 o 10 Gy), tratados con ErPC (12.5-100 μ M) o sometido a tratamiento combinado. Posteriormente, las células fueron incubadas bajo condiciones estándar de cultivo (37 ° C / 5% CO 2) hasta 4 semanas dependiendo de tratamiento. Para la determinación de la formación de colonias de células fueron fijadas en el 3,7% formaldehído y 70% de etanol. Fijo células fueron teñidas con azul de Coomassie 0,05%.

Colonias de al menos 50 células fueron contados. La fracción de los que sobreviven tratados culturas se calcula dividiendo el número de colonias por el enchapado eficiencia de las células no tratadas. La curva de supervivencia fue establecido por tramar el registro de la fracción sobrevivir frente a la dosis de irradiación.

Análisis estadístico

La eficacia de la combinación de modalidades de tratamiento se evaluó mediante análisis isobologram [52]. En base a los valores medidos para los regímenes de tratamiento único, el tratamiento combinado de los datos se extrapolaron la definición de un área calculada de la respuesta al tratamiento aditivo (dotación de aditividad) [52]. El dado resultados de los experimentos se comparó a los datos calculados: valores dentro de la dotación de aditividad son representativos de un efecto aditivo, mientras que los valores por debajo de esta dotación indicar un sinergismo entre ambas modalidades de tratamiento. Por el contrario, los valores por encima de la dotación de aditividad son indicativos de sub-efectos aditivos.

Abreviaturas

AC, astrocitoma; APC, alkylphosphocholine; ErPC, erucylphosphocholine; ErPC3, Erucylphosphohomocholine, Erufosine ™; ET18-OCH 3, Edelfosine; GBM, glioblastoma; HePC, Hexadecylphosphocholine

Conflicto de intereses

Los autores declaran que no tienen intereses en conflicto.

Contribuciones de los autores

AR contribuido significativamente a la adquisición de datos, análisis de datos y redacción del manuscrito. RH contribuido significativamente a la adquisición de datos, análisis de datos y redacción del manuscrito. LHL y MS realizó revisión crítica del manuscrito. Excmo sintetizados y siempre ErPC y ErPC3 para el análisis. BM contribuyó de forma significativa al análisis de datos. CB participó en la concepción del estudio y la interpretación de los datos. VJ realizado la concepción y el diseño del estudio y contribuido de manera importante a la interpretación de los datos, la redacción del manuscrito, revisión crítica del manuscrito y su aprobación final. Todos los autores leído y aprobado el manuscrito final.

Agradecimientos

El excelente apoyo de Karim-Maximilian Niyazi con la preparación de las cifras es muy apreciada. El trabajo fue apoyado por una beca de la Deutsche Krebshilfe / Mildred-Scheel-Stiftung (10-1970 Sea-III) a CB y VJ, la fortuna fortuna-programa Universität Tübingen (126-0-0) a VJ, el Ministerio Federal De la Educación y la Investigación (Fö. 01KS9602) y el Centro Interdisciplinario de Investigación Clínica Tübingen (IZKF) a VJ y CB.