Proteome Science, 2006; 4: 10-10 (más artículos en esta revista)

Cribado de alto rendimiento de celulasa F mutantes de multiplexadas plásmido conjuntos utilizando un sistema automatizado en una placa de ensayo funcional proteómicos robótico workcell

BioMed Central
R Stephen Hughes (hughessr@ncaur.usda.gov) [1], Steven B Riedmuller (sriedmuller@hudsoncontrol.com) [3], Jeffrey A Mertens (mertensj@ncaur.usda.gov) [2], Li Xin Liang - (Lix@ncaur.usda.gov) [2], Kenneth M Bischoff (bischoffk@ncaur.usda.gov) [1], Nasib Qureshi (qureshin@ncaur.usda.gov) [2], Michael A Cotta (cottama @ Ncaur.usda.gov) [2], Philip J Farrelly (pfarrelly@hudsoncontrol.com) [3]
[1] Estados Unidos Departamento de Agricultura (USDA), Servicio de Investigación Agrícola (ARS), el Centro Nacional para la Investigación de Utilización Agrícola (NCAUR), Bioproducts y Biocatálisis (BBC) Unidad de Investigación, 1815 North University Street, Peoria, IL 61604, EE.UU.
[2] USDA, ARS, NCAUR, Fermentación Biotecnología (FBT) Unidad de Investigación, 1815 North University Street, Peoria, IL 61604, EE.UU.
[3] Hudson Control Group, Inc., 10 Stern Avenue, Springfield, NJ 07081, USA

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Resumen
Antecedentes

El campo de plásmido basada en proteómica funcional requiere la rápida determinación de las proteínas expresadas plásmido de las bibliotecas. La automatización es esencial, ya que las grandes series de mutantes marcos de lectura abierta se están clonados para la evaluación. Hasta la fecha no integrados automatizados plataforma está disponible para llevar a cabo todo el proceso, incluida la producción de plásmido bibliotecas, expresión de los genes clonados, y de las pruebas funcionales de proteínas expresadas.

Resultados

Se utilizó un ensayo funcional proteómicos multiplexadas en un establecimiento integrado en un plásmido basada en la robótica workcell de alto rendimiento para la detección de mutantes de celulasa F, una endoglucanase anaeróbica de la hongo Orpinomyces PC-2. Esto nos permitió identificar los plásmidos que contienen optimizado clones mutantes con expresión de la mejora de la actividad de bajo pH. Un plásmido de la biblioteca mutagenized clones de los genes con celF orientados variaciones en los últimos cuatro codones sitio fue construido por mutagénesis dirigida por PCR y se transforma en Escherichia coli. Un robot recogedor integrado en el workcell se utilizó para inocular en un medio de 96 pozos profundos así plato, la combinación de los transformantes multiplexadas en un sistema en cada bien, y la placa se incubó en la workcell. Plásmidos se prepararon a partir de la cultura multiplexadas en el componente líquido manejador de la workcell y utilizado in vitro para la transcripción y traducción. El multiplexado expresó proteínas recombinantes fueron seleccionadas para mejorar la actividad y la estabilidad en un azo-carboximetilcelulosa placa de ensayo. El multiplexado pozos que contienen mutantes con la mejora de la actividad fueron identificados y vinculados a la correspondiente multiplexadas culturas almacenados en glicerol. Unte las placas fueron elaborados en base a las existencias y el glicerol la workcell se usará para escoger solo colonias de la propagación platos, preparar el plásmido, la producción de proteínas recombinantes, y el ensayo de actividad. El ensayo y la posterior selección de la deconvolución multiplexadas pozos resultó en la identificación de mejores CelF mutantes y de la correspondiente optimizado clones de expresión dispuesto en los plásmidos.

Conclusión

El complejo método automatizado utilizando una plataforma integrada para el cribado de alto rendimiento en un ensayo proteómica funcional permite la rápida identificación de plásmidos que contienen optimizado clones preparado para su uso posterior en aplicaciones que incluyen transformaciones para producir la mejora de las cepas o líneas celulares.

Antecedentes

El plásmido campo de la proteómica funcional basada utiliza cDNA de longitud completa plásmido bibliotecas como fuente de clones para la evaluación de la función de la proteína in vitro de transcripción y traducción in vivo o métodos de expresión. Desde las bibliotecas se componen de varios miles de genes variantes, la automatización del proceso de selección es fundamental. Hasta la fecha, una serie de sistemas automatizados se han desarrollado para ayudar en la selección [1 - 11], pero no existe una única plataforma integrada para llevar a cabo todo el proceso de producción de plásmido bibliotecas a las pruebas funcionales de proteínas expresadas por grandes conjuntos de clones. El sistema libre de células empleadas por Betton [3] para poner a prueba el nivel de expresión de la proteína in vitro por transcripción y traducción de los productos de PCR antes de la clonación del gen en una proteína resultados optimizados para la expresión. Sin embargo, el producto de PCR optimizado identificados por este sistema aún no se ha aislado y purificado manualmente, y luego clonados no convencionales por métodos automatizados para evaluar la expresión de soluble, plegado de proteínas in vivo. La plataforma de preparación automatizada de la proteína descrita por Vinarov y Markley [11] es útil para la producción en gran escala de proteínas de la etiqueta para el análisis estructural de RMN obtenida a través de plásmidos a pequeña escala de detección de determinados ORFs objetivo de los niveles de expresión y solubilidad. Sin embargo, la ventaja de un plásmido automatizado basado en la plataforma es la posibilidad de obtener un gran número de expresión-Ready plásmido establece que contienen optimizado clones automatizado para la mejora de la transformación para producir cepas o líneas celulares. Expresión de plegado adecuada, proteína soluble in vitro o in vivo proporciona los medios para la pantalla optimizado para un clon que ya está situado en un plásmido capaz de almacenar y funcional de proteínas.

En la actualidad estamos desarrollando un plásmido integrado basado en proteómica funcional workcell para automatizar todas las tareas necesarias: la producción de cDNA bibliotecas, recogiendo las colonias, el aislamiento de ADN plásmido, la transformación de levaduras y bacterias, expresando proteínas, y la realización de pruebas funcionales. El desarrollo del componente líquido manejador automatizadas a 96-así placa plásmido workcell preparación en la que se ha descrito anteriormente [12]. La automatizado integrado en gran escala líquido manejador de adaptación descrito en el presente documento produce los plásmidos de cantidad y de calidad suficientes para su utilización en estrategias de mutagénesis para la optimización del marco de lectura abierta y en la generación de expresión única-Ready cDNA bibliotecas para desarrollar variedades mejoradas y líneas celulares.

El costo de la utilización de técnicas de biología molecular automatizada de alto rendimiento en proteína recombinante pantallas pueden ser prohibitivamente caras. Un multiplex formato reduce el tiempo y costo de producción de proteínas recombinantes de gran escala plásmido preparados por disminuir el número de pozos a someterse a las pruebas y de la cantidad de los reactivos necesarios. Aquí presentamos un sistema automatizado múltiplex método posible gracias a la integración de un componente de robótica colonia recogiendo en un sistema automatizado capaz de workcell plataforma de alto rendimiento de detección de un plásmido biblioteca que expresan mutantes de la endoglucanase CelF para obtener clones que dan lugar a proteínas con la mejora de la actividad a menor PH y la estabilidad a altas temperaturas. Enzimas como CelF son capaces de digerir la pared celular de plantas y polisacáridos, por lo tanto, tienen el potencial de aplicación industrial a derribar las plantas de biomasa para su utilización en la producción de etanol combustible [13, 14]. El complejo método consiste en un examen inicial de un multiplex cultura que contiene una mezcla de clones con el fin de identificar a los que dan lugar a la mejora de in vitro expresó proteínas mutantes. Individual clones correspondientes a la mejora de estos mutantes son aislados por escoger solo colonias de la multiplexadas culturas, la producción de ADN plásmido de la recogida colonias y expresando proteínas automatizado en la transcripción in vitro / traducción reacciones identificar a los mutantes con la mejora de la actividad en un plato de base funcional Ensayo.

Resultados
Mutagénesis

Orientada por mutagénesis de los últimos cuatro codones de los genes celF fue inicialmente realizada por la creación de un PCR primer set con el primer inverso (anti-sentido capítulo) que contengan cualquier nucleótidos en la primera y segunda posiciones y una pirimidina en la última posición (NNY). En consecuencia, el capítulo contiene el sentido complementario NNR motivo donde R es una purina. Esta estrategia genera una biblioteca de marcos de lectura abierta que el código para el 14 de los 20 aminoácidos posibles en cada una de las últimas cuatro posiciones en la CelF mutantes, o 14 4 = 38416 combinaciones posibles. Phe, Tyr, Su, Asn, Asp, Cys y no son posibles, ya que sólo han NNY codones. También, debido a la degeneración del código, casi todos los aminoácidos es representado por varios codones (sinónimos). NNR en la estrategia de los aminoácidos con la mayoría de los sinónimos son arginina y leucina. Aunque los aminoácidos con más sinónimos en teoría tienen una mayor probabilidad de aparecer, es posible que no mejoran la actividad de los mutantes y puede incluso eliminar la actividad y, por tanto, no son vistas en el proceso de selección.

Un posterior a gran escala se llevó a cabo el cribado plazo en el que el sitio de mutagénesis dirigida PCR estrategia se modificó para obtener NNY así como NNR codones, en el sentido de capítulo. Esto se logró mediante la producción de PCR primers NNR con un motivo en el sentido de lucha contra la línea, además de los cebadores con el NNY motivo. Una biblioteca de marcos de lectura abierta se obtiene de la NNR primers codificación de los seis aminoácidos que sólo NNY codones y también para los otros nueve aminoácidos que contenga a ambos y NNY NNR codones. Por tanto, la estrategia de NNY codón da un total de 15 4 = 50625 posible CelF variantes. Junto con el 38416 posible CelF variantes de la estrategia de NNR codón esto da un total de 89041 teóricamente posible CelF variantes.

El futuro primer CACC figura la secuencia en la parte delantera del codón ATG de inicio para que la biblioteca de mutagenized clones que se trasladaron a la pENTR D TOPO vector sistema direccional. El resultado se transformó en biblioteca E. Coli células, difusión selectiva en placas y se incubaron durante la noche. En la pantalla inicial NNR, de aproximadamente 10 a 80 colonias se obtuvieron en cada una de las 100 placas en esta serie en que cada placa fue extendido con un 25 - μ l de células competentes de la transformación. En la posterior gran escala NNR más NNY cribado correr, 178 placas de propagación se prepararon a partir de la transformación de las reacciones que contienen los clones con NNY codones y 262 placas de propagación se prepararon a partir de la transformación de las reacciones que contienen los clones con NNR codones. Un 25 - μ l de células competentes de la transformación se utiliza para la difusión de cada plato.

Multiplexadas colonia recogiendo

Colony picking se realizó en la workcell automatizado utilizando el recogedor workcell (Figura 1 # 4) dar a los pozos en un multiplex de 96 pozos profundos así placa de cultivo. La primera ejecución entraña escoger ocho colonias de la propagación placas para inocular cada bien de un pozo profundo ABgene bloque que contiene 1,6 mL de la TB en KAN 25 medianas, lo que da un total de 768 clones de una placa (8 por así × 96 pozos). De los 768 clones seleccionados en este plazo, de cinco (5) multiplexada con la mejora de la actividad culturas fueron identificados. La posterior a gran escala entraña correr recogiendo 80 colonias inocular a cada pocillo de tres de 96 pozos profundos y bloques y 4 colonias para inocular cada bien de otro bloque de 96 pozos, lo que da un total de 23424 clones seleccionados (3 × 96 × 80) + (96 × 4). De ese total, 9486 se tomaron de las colonias que contienen NNY clones y 13938 fueron tomados de las colonias que contienen NNR clones. El número de clones seleccionados se aumentó a verificar la capacidad de alto rendimiento de la plataforma automatizada.

La integración de la operación de recogida en el workcell robótico automatizado permite multiplexación, que conserva los reactivos y tiempo. Después de la colonia se realizó la recogida, la resultante multiplexadas culturas se incubaron durante la noche y procesadas mediante el plásmido preparación protocolo sobre el líquido manejador de la workcell (Figura 1 # 9). Inserta direccional fueron clonados en pENTR D TOPO usando topoisomerasa ligadura, y luego en pEXP-1 DEST vector LR clonase a través de la reacción y se transforma en TOP 10 E. Coli células [12]. El plásmido resultante multiplexadas biblioteca con mutagenized inserciones se utiliza para la in vitro de transcripción y traducción.

Proyección de multiplexadas mutantes

Las proteínas expresadas CelF multiplexadas de la transcripción y traducción se evaluaron las reacciones de celulasa actividad en varios niveles de pH utilizando un sistema automatizado azo-CMC placa de ensayo. Los resultados a pH 5,8 mostró varias zonas despejado después de una incubación de 10 horas a 37 ° C, lo que indica actividad celulasa (Figura 2]. No se puede determinar el diámetro y de la intensidad de las zonas despejado en el plato que la proteína de los pozos B11, C12, G2, G11, H12 y ha elevado la actividad en este pH. El control negativo a la placa (pUC19) y en E1 no mostró actividad celulasa. Actividades de los controles positivos, de tipo salvaje (CelF # 5) y una mejor mutante (CelF # 62) obtenidos anteriormente [12], se indica en los pozos B3 y C5, respectivamente.

Control de los experimentos se realizaron para determinar el efecto de cantidades cada vez mayores de CelF mutantes en un multiplex o bien aumentando el número de colonias de multiplexadas la sensibilidad del ensayo. La Figura 3 muestra que, como la suma de una persona activa CelF mutante manchas en la azo-CMC placa se incrementó de 27,7 a 277 ng, la actividad medida por el diámetro de la zona despejado producido en la placa aumenta en forma lineal. El limpiado zonas en las azo-CMC placa a pH 5,8 se muestran en la inserción en la parte superior de la gráfica (a las 10 horas de incubación, 37 ° C). Además, si el número de colonias multiplexadas en un bien aumenta en relación con un individuo CelF mutante, que la actividad de los mutantes es aún detectable. La figura 4 muestra las actividades obtenidas cuando un individuo activo CelF mutante se añade a una mezcla que contenga un número creciente de las colonias de antecedentes multiplexadas, tal como se describe en este documento, de no antecedentes colonias (activo mutante solos) a 96 colonias por antecedentes. El limpiado zonas en las azo-CMC placa a pH 5,8 se muestran en la inserción en la parte inferior de la gráfica (a las 10 horas de incubación, 37 ° C).

La identificación de cada uno de los clones

El multiplexado pozos que contienen mutantes con la mejora de la actividad que se identificaron en el multiplex azo-CMC cribado placa (Figura 2] estaban vinculados a la correspondiente multiplexadas culturas almacenados en glicerol. El glicerol existencias fueron identificados en la propagación LB AMP 50 placas y solo las colonias de estas placas fueron recogidos por el recogedor workcell colonia en una placa de 96 pocillos de aislar a la persona de clones seleccionados de alta actividad pozos, B11, C12, G2, y G11 . El único colonias fueron recogidos en la TB 50 AMP medio y se incubaron durante 20 horas. En el proceso automatizado de recolección, la colonia recogedor se programó para seleccionar colonias entre 0,2 a 10 milímetros de tamaño. Esta restricción se fija para un determinado plazo, pero podría ser reprogramado si es necesario. Para determinar la forma en este proceso automatizado de recolección manual en comparación con la recogida por una persona que tiene mayor margen en la selección de las colonias y que pueden tratar de optimizar la variedad de las colonias que se recogieron, un conjunto de colonias también fue recogido manualmente.

La recolección manual se realizó con 4 grupos de 24 pozos en la placa de 96 pocillos, y teniendo 24 colonias correspondientes a cada uno de los pozos identificados (proceso descrito en la Figura 5]. Después de la ampliación de la placa de 96 pozos en cuatro placas de 24 y, a gran escala plásmido preparación se realizó en el líquido y la consiguiente manejador de plásmidos se eluye en una matriz de 96 pozos de recolección de placas. La placa fue trasladado a la Bio-Tek UV / VIS lector de microplacas y la absorbancia a 260 nm de cada bien se ajustó a 1,0 (equivalente a una concentración de 0,05 μ g / μ l) diluyendo con Qiagen EB buffer en el líquido manejador cubierta utilizando Pipetas de manejador de los líquidos y de amortiguación del frío edificio a la cubierta. In vitro de transcripción y traducción reacciones se realizó a través de toda la placa de plásmidos. Proteína fue avistada sobre cuatro placas CMC-azo a pH 4,0, 4,5, 5,0, y 5,8. Proteína calienta a 50 º C durante 1 hora fue avistada en una quinta placa (a pH 5,8). La mejora CelF enzima fue aislada de cada uno de los pozos identificados multiplexados (Figura 6]. Mutantes individuales son identificados por fila (letra) y la columna (número) en la placa y por "MP", indicando que fueron recogidos manualmente. Columnas 1-3 en cada plato fueron recogidos de las colonias correspondientes a multiplex y B11 (véase la figura 2] (la variante de alta actividad en F2MP caja púrpura está en la fila y columna 2 F), columnas 4-6 de multiplexadas así C12 (alta actividad variantes Son E5MP caja en color amarillo y en F5MP caja azul), 7-9 columnas de multiplexadas así G2 (alta actividad se E7MP en F9MP en verde y naranja), las columnas de 10-12 multiplexadas así G11 (F12MP en rosa). Clones F2MP, F5MP, F9MP, y F12MP había actividad en pH más bajos que los de tipo salvaje CelF. Clones F2MP, F9MP, y también se F12MP estable después de la calefacción a 50 ° C durante 1 hora. F9MP (en caja), que exhibe las más excepcionales de actividad, se han mostrado a la misma secuencia que B9MP, C9MP, y E8MP (no todos en caja), en el que todos exhiben actividad similar a F9MP. La caja de mutantes fueron seleccionados para Western blot.

El mismo multiplex glicerol stock propagación placas de colonias que se habían recogido manualmente también se utilizaron para la recolección automática en una placa de 96 pocillos (véase el proceso en la Figura 5]. Las colonias fueron recogidos e identificados como los controles o las muestras. Ampliación de la placa de 96 pocillos en la primera de las cuatro placas de 24 y en el que participan la inoculación workcell con 84 colonias de cinco de los identificados de alta actividad multiplexadas existencias (B11, C12, G2, G11, H12). Control de las culturas se colocaron en 12 de los 24 pozos (en caja en la parte superior izquierda de la Figura 7], incluida la pUC19 (control negativo de la expresión), el gen GUS (positivo para la expresión; negativos de la actividad), de tipo salvaje CelF # 5 y la mejora de mutantes CelF # 62 [12] (controles positivos de la actividad). 24-El proceso así se repitió durante tres platos más. Después de la ampliación de la placa de 96 pocillos en los cuatro placas 24-así, a gran escala plásmido preparación se realizó en el líquido y el manejador de los plásmidos resultantes se combinaron en una matriz de 96 pozos de recolección de placas. Plásmido de ADN se ajustaron a las concentraciones de 0,05 μ g / μ l uso de la A 260 lectura de la UV / VIS, de modo que todo lector de microplacas clones estaban presentes en cantidad suficiente para la expresión coherente, y luego in vitro de transcripción y traducción reacciones se realizaron para toda la placa de plásmidos . El resultado conjunto de proteínas recombinantes fue avistada sobre azo-CMC placas a pH 4,0, 4,5, 5,0, y 5,8. Una quinta placa (a pH 5,8) fue manchada con proteínas calentada a 50 ° C durante 1 hora. Los resultados fueron similares a los de la recolección manual de procedimiento e indicó que la mejora de CelF proteína estaba presente en cada uno de los pozos identificados multiplexadas. Dos mutantes de alta actividad de bajo pH y en el que figuran la estabilidad a temperatura elevada (G4AP en caja marrón, G12AP caja en rojo) se identificaron (Figura 7) en el proceso automatizado de recolección ( "AP" indica clones de este proceso). Varios otros CelF variantes se observaron que había una alta actividad a pH 5,8 y 5,0, pero no a pH 4,5 o 4,0 (por ejemplo, C1AP y E2AP caja en agua). Un mutante (H1AP en aqua) sólo había actividad a pH 5,0 y dos variantes no son estables después de la calefacción a 50 ° C (E2AP y D6AP en aqua). Varios clones fueron aberrante porque no se detectó insertar (B8AP), no se recuperó el ADN plásmido (H10AP) o de un infructuoso recombinational evento ocurrido (F9AP) como se ve cuando los plásmidos fueron sometidos a análisis de restricción BsrGI BsrGI (datos no presentados).

Secuencias de mutantes

Secuencias para la mutagenized clones que dieron CelF variantes con la mejora de la actividad de bajo pH se enumeran en el cuadro 1. Secuenciación de los resultados recogidos manualmente clones identificado cinco únicas secuencias de los 768 clones originalmente recogidos en el multiplex pozos. Clones G12AP y G4AP seleccionado en la recogida ha automatizado el mismo orden que F2MP y F9MP, respectivamente, desde la recogida manual. La variante CelF (F9MP/G4AP), que tuvo la mayor actividad de bajo pH y es estable a altas temperaturas también contiene una mutación puntual en el aminoácido 213 además de los cuatro cambios de aminoácidos en el C-terminal mutagenizing generado por los últimos cuatro CelF codones de los genes. Un CelF mutante, C7HTS ( "HTS" denota alto rendimiento pantalla), que se activa a la restrictiva pH 4,0 y muy estable para la calefacción a altas temperaturas, con una secuencia diferente en los últimos cuatro aminoácidos de las de los mutantes obtenidos anteriormente , Se identificó en la gran escala de correr desde el NNY más NNR estrategia de mutagénesis. C7HTS también tuvo un codón de parada prematuro, la reducción de la secuencia de aminoácidos de uno.

Western blot de las proteínas expresadas se presenta en la figura 8. CelF de tipo salvaje (control # 5) y variantes de la misma longitud que de tipo salvaje dar una banda a 47,7 kD. E5MP en el primer carril de 52,6 kD tenían un codón mutado resultando en un CelF variante con 54 aminoácidos más que de tipo salvaje (486 versus 432) (secuencia no se muestra). Ha disminuido la estabilidad después de la calefacción y algunas celulasa actividad a pH 4,5. El G4AP CelF variante, que se han mostrado a la misma secuencia que F9MP, demostró actividad similar a F9MP en que había una mayor estabilidad después de la calefacción a más de tipo salvaje CelF y mantenerse celulasa actividad a pH 4,0. Variantes F5MP, F12MP, F2MP y todos E7MP había actividad en pH más bajo (4,0 o 4,5), pero ninguno era tan estable como G4AP/F9MP después de la calefacción. Variantes H1AP, C1AP, E2AP y D6AP demostrado que menos actividad celulasa de tipo salvaje CelF. Control # 62 es una mejora de la variante CelF obtenido previamente [12]. No celulasa actividad y, de hecho, no se obtuvieron CelF variantes de las localidades B8AP, F9AP y H10AP. Análisis de restricción (datos no presentados) mostró-primer dímero de inserción, un evento o recombinational plásmido no estuvo presente en esos casos, respectivamente.

Figura 9 se ofrece una comparación de la actividad de tipo salvaje CelF y CelF mutantes, # 62, F9MP, y C7HTS, a pH 4,0. C7HTS de la gran escala de la pantalla muestra la mayor actividad en comparación con todos los demás clones obtenidos a la fecha. El Western blot en la inserción de la parte superior muestra que la mejora de CelF variantes C7HTS, F9MP y # 62 están presentes en la misma concentración para todas las comparaciones.

Discusión

El método descrito aquí multiplex utilizando un sistema automatizado basado en el plásmido workcell permite la expresión en gran escala y el rápido análisis funcional de las proteínas mediante un azo-CMC placa de ensayo para evaluar la actividad de la enzima. Integración de la robótica en la colonia recogedor automatizado workcell plataforma permite el proceso completo de la colonia a la producción de proteínas de análisis que se han de realizar en una sola plataforma robótica. Nuestra primera aplicación de este integrado workcell fue la proyección de una biblioteca de mutagenized celF clones. El cDNA celF [15, 16] utilizados para la estrategia de mutagénesis fue inicialmente previstas en el pBlueScript ® polyhistidine con un vector (6 × Su) etiqueta en el amino terminal de purificación por medio de la unión de Ni piedras, y que contiene un promotor T7 en el Vivo expresión en bacterias. Celulasa actividad fue evaluada utilizando una base líquida p-nitrofenol ensayo. Nuestra intención era utilizar la Invitrogen Gateway ® recombinational clonación sistema para automatizar por completo el proceso de producción y plásmido un mayor número de clones. Un promotor T7 modificados se emplean para una óptima in vitro de transcripción y traducción y, además, el 6 × Su etiqueta se colocó en el carboxilo terminal para purificar principalmente de larga duración proteínas expresadas. A modo de alojamiento para la plataforma automatizada, una placa basada en azo-CMC ensayo se desarrolló en lugar de la base líquida ensayo. Sin embargo, además de los 6 × Su etiqueta a la celulasa carboxilo terminal eliminado en la actividad de base líquida p-nitrofenol ensayo. Traslado de la etiqueta de nuevo a la terminal amino dio a la actividad en la azo-CMC placa de ensayo, lo que sugiere que el carboxilo terminal de CelF pueden desempeñar un importante papel funcional. Por lo tanto, los esfuerzos se centraron en la modificación de los últimos cuatro aminoácidos en este final de la enzima para aumentar al máximo el efecto sobre su actividad.

Estamos motivado que la mutación de los cuatro codones debería proporcionar un gran número de variantes suficiente para obtener algunos con la mejora de la actividad, pero aún dar un número de clones que pueden realizarse en un tiempo realista en la plataforma automatizada. La estrategia de NNR mutagénesis dirigida a los últimos cuatro aminoácidos en el carboxilo terminal de CelF y la prestación de los codones de 14 aminoácidos producido suficientes variantes viables con la mejora de la actividad a fin de que el plazo inicial de las colonias en las que ocho fueron multiplexados por así podría identificar con cinco diferentes variantes La mejora de la actividad. En caso de que no se ha optimizado la variante obtenidos, el número de colonias por multiplexadas bien podría haber sido mayor y / o el proceso automatizado de recolección se podría haber repetido de detección rápida de la plataforma automatizada. Aunque sólo 768 de los 38416 teóricamente posible NNR mutagenized celF clones recogidos en el plazo inicial se cribaron (2%), la mejora de varios clones fueron obtenidos. En la posterior NNR más NNY mutagénesis plazo, 23424 o 89041 de 26% de los clones teóricamente posible, el 19% de la NNY clones y el 36% de los clones NNR, fue tamizada. Esta estrategia dado por lo menos una variante con CelF excepcional actividad. El número de variantes viables obtenidos y de las colonias que deben ser multiplexados dependerá de una variedad de factores, incluyendo el gen que se mutagenized y de la estrategia de mutagénesis.

Suficiente plásmido puede ser producido por la conducta repetitiva workcell a la expresión de la proteína y de las reacciones orgánicas ensayos de identificar rápidamente a los pozos que contienen multiplexadas CelF mutantes con más de la mejora de las características de tipo salvaje CelF. Estos pozos son multiplexados entonces deconvoluted a fin de identificar los clones. El ensayo para el análisis de las proteínas expresadas se elaboró teniendo en cuenta que una rápida medición cualitativa de la actividad de los mutantes CelF recombinante es obligatorio. Elegimos un agar-gel basada en la difusión de ensayo que contienen azo-CMC que fue adaptado para el cribado de alto rendimiento en una plataforma robótica.

La necesidad de suficiente proteína de la proteómica funcional de los ensayos de hecho necesario para configurar los workcell por lo que produce muy concentrados y abundante ADN plásmido. Esto se logró haciendo preparativos cuadruplicado en 24 y con placas de 5 mL de medio en cada pocillo seguida de elución y recogida en una placa de 96 pocillos para dar un volumen final de 20 mL. Las cuatro planchas que se eluyen 2D en una matriz de recogida de la placa dio más de cuatro veces la cantidad de plásmido previamente observada por un plato cuando se utilizan 1,6 mL de las culturas [12]. Como se informó anteriormente, una de 96 y placa de Matrix dio 5,35 μ g por así [12], por lo que para cuatro placas de la rentabilidad esperada sería más de 21,4 μ g. En el proceso descrito en este trabajo, un promedio de 31,1 μ g por así se obtuvo (datos no presentados). Sin embargo, la cantidad a partir de la cultura que aquí se describe fue de 20 ml, mientras que en el experimento anterior la suma de la cultura a partir de 1,6 mL por placa (o 6,4 mL si cuatro placas fueron utilizados). Cantidades superiores a la cantidad utilizada aquí superan la capacidad del filtro de placas que causan los pozos a ser bloqueado por lo que la solución de lavado no pueden ser adecuadamente tirados a través de la calidad y el plásmido se deteriora.

Vinculación de los pozos multiplexados con la mejora de la actividad CelF de nuevo a la multiplexadas glicerol aislamiento de las poblaciones y los distintos clones de glicerol a partir de la propagación de valores placas se llevan a cabo en una forma totalmente automatizada en el workcell. Para propósitos de comparación, la primera colonia-picking operación se realizó tanto en forma manual y el workcell. Dos mejora de los mutantes, F2MP y F9MP, aisladas por el proceso de recolección manual de la misma secuencia que G12AP y G4AP, respectivamente, aisladas por el proceso automatizado de recolección. Todos los pozos de alta actividad que se separaron en la colonia nivel dio origen a al menos una mutante con el aumento de la actividad (F2MP/G12AP, F5MP, F9MP/G4AP, F12MP). Inicialmente se seleccionaron ocho selecciones para cada multiplex así basa en la expectativa de que un gran número de diferentes mutantes se obtendría. Si demasiados picos se combinaron, la identificación de cada uno de los mutantes con el aumento de la actividad podría ser difícil. Con ocho selecciones no multiplexados de alta actividad de los pozos en los que se observaron más de una variante contribuido al aumento de la actividad, con indicación de ocho selecciones por así fue suficiente para dar optimizado mutantes de CelF tiempo que se mantiene un número manejable para la realización de pruebas de los protocolos sobre la plataforma automatizada. Para otros genes, no optimizado mutantes podrían encontrarse con ocho selecciones por así. En tales casos, el número de selecciones se puede aumentar, según sea necesario en la plataforma automatizada.

El experimento de control, en la que la suma de una variante conocida (F9MP) con la mejora de la actividad fue mayor y la actividad determinada, demuestra que en el rango de las concentraciones encontradas, la actividad en el azo-CMC placa aumenta de forma lineal ya que la cantidad CelF aumentos de la variante. Además, si el número de colonias es multiplexada aumentado en relación con el importe de una persona CelF variante en un multiplex así, la actividad de una única variante puede ser detectado incluso si tantos como 96 colonias están multiplexados en un bien.

In vitro de transcripción y traducción se espera que cerca de expresar el máximo teórico número de clones a partir de la estrategia de mutagénesis cuando el proceso automatizado se ejecuta repetitiva ya que evita los problemas de plegamiento, la formación de cuerpos de inclusión, o de células intoxicación a menudo se encuentran con expresión in vivo. Cuando todos los plásmidos en un grupo de los 24 a partir de la recolección manual de proceso fueron secuenciados (de multiplexado y C12), cinco diferentes secuencias se encontraron entre los 24 plásmidos (tres de los ocho clones fueron recogidos duplicados). La duplicación es muy posible, ya que los distintos clones fueron recogidos a partir de la misma placa de transformación. Es posible que algunos de los ocho inserciones recogido en el pENTR D TOPO etapa no se recombinationally clonado en el pEXP-1 DEST expresión plásmido. También algunos de los pEXP-1 DEST clones podrían no haber transformado en el TOP 10 Propagación de las células. Transformación en TOP 10 químicamente competente E. Coli células sin f 'pilus evita la contaminación de fagos y plásmidos se propaga sin expresión de la T7 promotor a fin de los clones de expresión no afecta a la supervivencia de E. Coli células. La competencia también puede causar la pérdida de algunas inserciones. BsrGI BsrGI restricción se realizó un análisis sobre los conjuntos de plásmido para determinar el número de inserciones de larga duración. Se encontró que de los 180 clones recogidos de la propagación placas (manual y automatizado de recogida combinado), 143 o el 79% tenía una longitud completo o casi completo insertar longitud (datos no presentados). Aunque hay algunos insertar pérdida, la automatizados workcell tiene la capacidad de pantalla un gran número de mutagenized clones.

La cantidad de proteína producida in vitro en la transcripción y traducción de reacción parece ser menos dependiente de la cantidad de plásmido que en la cantidad de mezcla de reactivos utilizados, como se ha visto bien en el control automatizado para la carrera. Una evaluación estadística (utilizando manualmente clon F9MP recogido en todos los pozos de 96) mostraron una menor variación en la cantidad de proteínas (COV = 13%, n = 24; promedio = 1358 ng/25 μ l de reacción) que la variación en la cantidad de plásmido (COV = 22%, n = 96; promedio = 31,1 μ g / así) de la que se expresó (véase el recuadro en la parte inferior de la Figura 6]. Proteína mostraron la proteína producida a partir de un determinado bien es bastante coherente con las otras 23 de control de los pozos examinados (COV de la actividad fue de 12%). Es posible que una cantidad máxima de ARN del mensaje se produce a partir de un nivel de umbral de plásmido. Esto sugiere que es importante mantener la cantidad de reactivo constante a un nivel suficiente de expresión consistente en la expresión in vitro de las reacciones, sin dejar de mantener el plásmido en el nivel de umbral.

Asignaron al azar en la secuencia final de la inserción de codificación de los últimos cuatro aminoácidos posiciones en el carboxilo terminal de CelF siempre mutantes con una serie de actividades. F2MP/G12AP fue una interesante variante de CelF con actividad a pH 4,0 y también mayor actividad a pH 5,8 que la de tipo salvaje CelF. Tuvo la misma moderada estabilidad como de tipo salvaje después de haber sido calentada a 50 ° C durante 1 hora. La secuencia de esta variante revela los últimos cuatro aminoácidos son Trp Thr Glu Pro. F9MP/G4AP fue el más mejorado clon seleccionado en la pantalla inicial. Demostró alta actividad a pH 4,0 con mucho mayor estabilidad que los de tipo salvaje CelF después de la calefacción a 50 ° C durante 1 hora. Más bioquímicos y cristalográfica investigación de este clon está en marcha. El clon también tuvo un conservador mutación puntual en el aminoácido 213, concretamente un Ser Thr a cambio, además del cambio en los últimos cuatro aminoácidos de Pro Met Thr Leu NNR resultante de la estrategia de mutagénesis. Esto puede ayudar a dar cuenta de su actividad a más bajo pH y su estabilidad después de la calefacción. Estos dos mutantes CelF enzimas de interés (F2MP/G12AP y F9MP/G4AP) mantuvo el mismo número total de los aminoácidos (412) y ambos contenían una Pro de residuos en los últimos cuatro aminoácidos similares a los de tipo salvaje CelF secuencia. La mutación puntual, probablemente, el resultado de la falta de fidelidad de la Taq polimerasa de la DNA en la reacción de PCR.

Dos clones que terminó en una secuencia truncada, E7MP y F12MP, había actividad similar a su forma natural en los niveles de pH probado, pero disminuye la estabilidad térmica. El carboxilo terminal secuencia de aminoácidos de E7MP fue truncado en Leu mediante la inserción de un codón de parada, causando los últimos tres aminoácidos que se desaparecidas. Los otros mutantes truncados F12MP fue moderadamente estable y terminó en Pro. Este CelF mutante, que sólo contiene un aminoácido de los últimos cuatro, ha demostrado actividad a pH 4,0. La mayoría de los mutantes con la mejora de la estabilidad térmica y pH contiene una gama de prolina entre las últimas cuatro posiciones de aminoácidos. En la celulasa CelF túnel en la estructura que se ha descrito [17, 18], la presencia de prolina entre los últimos cuatro aminoácidos de la enzima puede facilitar el acceso de sustrato. Nuestros resultados sugieren que la C-terminal es importante para ambos estabilidad térmica y menor actividad en el pH.

Tres clones (E5MP, E7MP, F12MP) se encontraron cuya secuencia contiene un codón TAA mutado o en el que las adiciones de nucleótidos a la ORF ya llevó a las proteínas, como se ha visto en el Western blot (Figura 8; E5MP). Esto puede haber sido el resultado de errores en los oligómeros. Ninguno de los mutantes con una mejor estabilidad térmica superior o en cualquier actividad que el pH natural CelF. Esto estaba de acuerdo con la observación de que la adición de una etiqueta a la C-terminal de CelF causado pérdidas de la actividad celulasa.

La secuencia de la CelF mutante con la mayoría de la mejora de la actividad obtenidos a la fecha, C7HTS, aislados del NNY más en la estrategia de NNR 23424-clon correr también figura sustituciones de aminoácidos en las cuatro últimas posiciones que resultaron de NNR codones. N de actividad elevada mutantes identificados a la fecha en esta pantalla había aminoácidos en los últimos cuatro posiciones resultantes de NNY codones. Aunque truncado, el mutante C7HTS registró la mayor actividad en el azo-CMC ensayo. Nos siguen investigando las sustituciones de aminoácidos resultante de la NNR más NNY estrategia.

Conclusión

Es posible identificar y aislar a la mejora de los marcos de lectura abierta celF colonias de recogida de multiplexadas conjuntos de mutagenized clones de la celF gen. Para el celF gen, la multiplexación de ocho colonias por así fue suficiente para obtener cinco (5) mejorar la singular CelF mutantes. Se realizó en el cribado de alto rendimiento en un workcell robótico automatizado utilizando un azo-CMC placa de ensayo para analizar la in vitro de proteínas expresadas y optimizado identificar clones de las bibliotecas mutagenized. In vitro de expresión de este gen evita las cuestiones visto con frecuencia la expresión in vivo . La combinación de las operaciones de recogida de colonia multiplexadas placas, en gran escala plásmido preparación, la in vitro de transcripción y traducción, y azo-CMC placa de ensayo de la proteína, seguido por el aislamiento y el análisis de cada uno de los clones, se llevaron a cabo sobre una plataforma automatizada a la pantalla CelF mutantes resultantes De una estrategia de mutagénesis dirigida clon. A efectos de comparación, tanto manual y automatizado colonia recogiendo las operaciones se llevaron a cabo. Ambos llevaron a la identificación de la misma actividad elevada térmicamente estable clones de la placa de cribado multiplexadas CelF mutantes. Esto demuestra que las técnicas de biología molecular norma puede aplicarse a alto rendimiento funcional proteómicos análisis cuando se coloca en un plásmido workcell robótico basado en la utilización del sistema automatizado de las operaciones aquí descritas para la identificación y el aislamiento de un clon mejorado de un multiplex mezcla de clones. El complejo método automatizado utilizando una plataforma integrada para el cribado de alto rendimiento en un ensayo proteómica funcional permite la rápida identificación de plásmidos que contienen optimizado clones preparado para su uso posterior en aplicaciones que incluyen transformaciones para producir la mejora de las cepas o líneas celulares.

Métodos
Plásmido basada proteómicos workcell

El ProLink Express ™ workcell (Figura 1] fue montado por Hudson Control Group, Inc, Springfield, NJ. Este plásmido integrado plenamente automatizado basado en proteómica funcional workcell es capaz de realizar las siguientes operaciones: 1) la placa de llenado, 2) y recogiendo colonia arraying multiplexados en los pozos, 3) a gran escala plásmido preparación, 4) la expresión de la proteína, y 5) funcional Ensayos de proteína. Protocolos para usar el manejador de componente líquido de la workcell plásmido para la preparación y análisis de plásmido se han descrito anteriormente [12]. Plásmidos se analizaron sobre la workcell, mediante la adición de las muestras procedentes de la matriz a una colección de placas UV ópticamente claro 96-VWR microplaca bien, y la medición de la absorbancia a 230 nm, 260 nm y 280 nm en el Bio-Tek UV / VIS lector de microplacas ( Figura 1 # 6). Adicional spectrographic plásmido análisis de las muestras se realizó a través de NanoDrop ND-1000 de fibra óptica espectrofotómetro (NanoDrop Tecnologías) para desarrollar un factor de ajuste para las diferencias en la altura de las lecturas tomadas por la UV / VIS lector de microplacas. Plásmidos fueron digeridos con BsrGI BsrGI y el plásmido preparativos se ejecutan en geles de agarosa al 2% con bromuro de etidio (Sigma) que se añade a visualizar el ADN. El gel fue fotografiado con un Alfa de imágenes utilizando software de la versión 3400 SE-3400 V 3.1.2 para Windows 2000/XP. Plásmidos fueron secuenciados utilizando una máquina MJ Tetrad PCR PTC modelo 225 con el Big-Dye Terminator V3.1 (Applied Biosystems) de acuerdo con las instrucciones del fabricante y correr en una ABI 3730 DNA Analyzer (Applied Biosystems).

Preparación de celulasa F mutagénesis biblioteca

Un mutagenized celF biblioteca se generó, tal como se describe anteriormente [12] utilizando celF cDNA [15, 16] (GenBank adhesión Número U97154 ) De los hongos anaerobios Orpinomyces PC-2 como plantilla. Además, las bibliotecas NNY se generaron de manera similar usando primers con NNR en la lucha contra el sentido capítulo. Métodos de la topoisomerasa mutagenized ligadura de los productos de PCR en pENTR D TOPO, la conversión al TOP 10 E. Coli células, plásmido posterior preparación, recombinationally subcloning insertos en pEXP-1 DEST utilizando LR clonase, transformación en E. Plásmido coli y células para su uso en la preparación in vitro de transcripción y traducción se describieron anteriormente [12]. Aquí subcloning en pEXP-1 DEST, la transformación en E. Plásmido coli y células in vitro para la preparación de transcripción y traducción se realizó de forma automatizada en el workcell.

Expresión in vitro de celulasa F en el plásmido placa multiplexadas

A 5 - μ L alícuota de la pEXP-1 DEST plásmidos preparado en el manejador de líquido se utiliza para la in vitro de transcripción y traducción con reacciones E. Coli lisado contiene T7 polimerasa (RTS 100 Kit; Roche Ciencias Aplicadas) para generar la proteína recombinante. La mitad de las reacciones a 25 μ l se realizaron en lugar de la plena reacción a 50 μ l se describe en las instrucciones para el kit. Las reacciones se incubaron durante 10 horas a 30 ° C. Nueve (9) μ l de las muestras se ejecute en el Western blot (como se describió anteriormente [12]] y 5 μ l de las reacciones fueron avistados (a menos que se indique lo contrario en la figura leyendas) para azo-CMC placa análisis utilizando el ensayo descrito anteriormente [12]. Relativa de la actividad de la enzima fue anotado por medición de la densidad de diámetro o integrado valores de la zona despejado.

El aislamiento de las distintas colonias de las culturas multiplexadas

Esas multiplexadas pozos identificados por la selección azo-CMC placa de ensayo que contenga como mutante (s) con una mejora de la actividad glucanasa estaban vinculados a la glicerol existencias que contiene la pEXP-1 DEST plásmidos que dieron origen a estos pozos. Las muestras de las poblaciones identificadas fueron inoculadas en AMP LB 50 86 × 128 mm propagación placas capaces de ser manejadas por el robot. El resultado individual colonias, que representan a todas las colonias que se inocularon en cada uno de los multiplex pozos, o bien fueron recogidos manualmente o automáticamente, para su posterior análisis.

Manual de recogida de colonias en placa de 96 pocillos

Colonias de propagación de las placas multiplex pozos identificados fueron recogidos manualmente y se utiliza para inocular TB 50 AMP medio en un placa de 96 pocillos. La placa se inocularon manualmente selladas con cinta de gas-permeables, llevados a la workcell agitador y se incubaron durante 24 horas a 37 ° C y 150 rpm.

Automatizado de recolección de las colonias en placa de 96 pocillos

La propagación placas que contienen las colonias de los múltiplex de las culturas se colocaron en el workcell en el pasivo apilador (Figura 1 # 13). Un ABgene de 96 pozos profundos así placa cargada en la activa apilador, una de 4 litros carboy que contiene 2 litros de 50 TB AMP medio fue conectado a la Hudson micro10 relleno (Figura 1 # 10), y el protocolo automatizado para escoger en colonias La placa de 96 pocillos se inició. El ABgene de 96 pozos profundos así placa fue enviada desde la pista activa apilador 2 (Figura 1 # 2B) a la de Hudson micro10 relleno (posición S3), y así cada uno lleno de 1,6 mL de 50 TB AMP medio y la placa se trasladó a la pista 2 Plate Crane StopLink posición S2. La placa fue trasladado por la grúa de la placa (Figura 1 # 3) de posición S2 a S1 y luego enviada a S6 de la inoculación con cada una de las cuatro culturas de control del frío tubo rack en el líquido manejador de la cubierta (Figura 1 # 9) en Los primeros 6 pozos en la parte superior izquierda dos filas en bloques de dos o cuatro usando el manejador de Hudson líquido. Después de los controles se añadieron, la placa fue enviada a través de un Hudson TrackLink (Figura 1 # 1A) en el espacio de cubierta de la recogedor en StopLink posición S4. Desde este lugar la pinza recogedor de la herramienta (Figura 1 # 4) se trasladaron la placa con pozo profundo en el medio recogedor ubicación de destino y retirado la tapa para recibir colonias. Recogida se realizó con un Hudson SoftLinx adaptado rutina de la BioRad VersArray recogedor integrado en el workcell. La propagación de las placas de los pozos identificados fueron trasladados desde el Hudson pasiva apilador (Figura 1 # 13) de la placa de la grúa (Figura 1 # 3) a S1. SoftLinx software de Hudson se utiliza para identificar placa propagación pozos como las placas se trasladaron a la cubierta del selector de pasar el lector de código de barras en la pista 1 (Figura 1A # 1 y # 15). La placa fue luego trasladado a S4 donde la herramienta en la pinza recogedor ocupa la colonia placa en la zona iluminada recogedor de la cubierta (Figura 1 # 4). La cámara CCD fotografió la propagación placa en la zona iluminada para grabar una imagen digital para la captura y el reconocimiento de estereotáxica coordenadas de todas las colonias programadas tamaño de la gama. Las colonias fueron recogidos utilizando cuatro dedicados pines de los 16-pin recogiendo la cabeza (Figura 1 # 4) y inoculadas, cuatro colonias a la vez, en un patrón en forma de S en la placa de 96 pocillos, tomando al azar 20 colonias de cada una de las Los primeros cuatro placas de propagación y 4 colonias de la última placa de propagación. La placa inoculadas se tomó de la ubicación de destino para S1, recogido, clasificado en los Brandel RS3000 sellador cinta porosa (Figura 1 # 8) y sellada con cinta de gas-permeable. La placa fue trasladado a S2 y cargados en la incubadora Liconic (Figura 1 # 12) en la modificación StopLink S5 y se incubaron durante 30 horas a 37 ° C y 600 rpm. Glicerol las existencias y el almacenamiento a largo plazo tarjetas se prepararon en el área de trabajo del manejador de líquido (Figura 1 # 9) de estas culturas después de la incubación.

Automatizado de la inoculación de la placa de 96 pozos en cuatro placas de 24 y en cuatro (4 × 4 × 24 pozos)

El protocolo se llevó a cabo con una modificación de la integración de rutina SoftLinx (Figura 1 # 14). Qiagen 24 y pozo profundo placas fueron cargados en el activo apilador (Figura 1 # 2B), una de 4 litros estéril carboy que contiene 2 litros de 50 TB AMP medio se adjuntó a la de relleno (Figura 1 # 10) con tubo estéril, y El protocolo automatizado de cultivo líquido para la inoculación en placas de 24-así se inició. El 24 de profundidad y así se enviaron placas de la pista activa apilador 2 (Figura 1 # 2B) a la micro10 relleno (posición S3), y así cada una llena con 5 mL de medio TB 50 AMP. Las placas fueron trasladados desde S3 Track 2 a la posición S2 entonces a pista 1 usando la posición S1 Plate Crane EX (Figura 1 # 3) y enviado a través de un Hudson TrackLink a S6 posición y, a continuación, en la cubierta del líquido manejador de la unidad (Figura 1 # 9), de la workcell utilizando el brazo de la pinza líquido manejador. Cuatro de 24 placas y en el momento que fueron inoculados con 20 μ l en cada cultura y en la imagen de la placa de 96 pozos en cuatro ocasiones para dar cuatro series de cuatro y 24 placas en representación de los controles y de las 84 colonias recogido. Las placas inoculadas fueron llevados a la posición S6 luego se trasladó a S1 en la pista 1, recogida por la placa de la grúa, colocada en la cinta porosa sellador (Brandel RS3000) (Figura 1 # 8) en la placa de cada workcell y sellados con gas-permeable Cinta. Todas las placas fueron trasladados a S2 en la posición Pista 2 y, a continuación, a S6 y Liconic en la incubadora durante 30 horas a 37 ° C y 600 rpm. Gran escala plásmido preparación continuación se llevó a cabo en el manejador de líquido, tal como se describe anteriormente [12]. Estos plásmidos se eluyen en el workcell en una matriz con código de barras 2D de recogida placa, colocada en una muestras de UV / visible microplaca (Figura 1 # 6), y la concentración para ajustar coherente expresión.

Automatizada de la producción in vitro de la proteína

MJ y placas de UV / visible ópticamente claro estándar microplacas se colocaron en la activa apilador (Figura 1 # 2A). PCR se llenó en la matriz 2D de código de barras y tubos colocados en la posición de frío reactivo líquido en el manejador (Figura 1 # 9) para la celebración en el 2 ° C. El protocolo para la producción de proteínas adaptado de SoftLinx, XAP acceder a rutinas de reacción para establecer y manchas (Figura 1 # 14), se inició. Proteína reacciones fueron elaborados en base a placas de plásmido en la cubierta del líquido manejador, y luego una nueva placa MJ se trasladó de la activa apilador a S6 en el líquido manejador de la cubierta y transportados por el líquido manejador de pinza para bloquear el frío de las adiciones de reactivo. Los reactivos son mezclados por aspiración y se trasladó a la placa S6 luego S1 a la posición de los transportes por la placa en la grúa 300 de lámina de ABgene sellador de calor (Figura 1 # 7) y, por último, en el termociclador de PCR (Figura 1 # 5). Después de los plásmidos se obtuvieron utilizando el plásmido automatizado de protocolo de preparación a gran escala plásmido preparación, 5 - μ L alícuotas de la pEXP-1 DEST mutagenized biblioteca plásmidos se han utilizado in vitro para la transcripción y traducción reacciones con la E. Coli lisado contiene T7 polimerasa de un RTS 100 Kit (Roche Ciencias Aplicadas) para generar la proteína recombinante. La mitad de las reacciones a 25 μ l (5 μ l de plásmido de plásmido preparativos fueron utilizados en lugar de 10 μ l) se realizaron en lugar de la plena 50 - μ L reacción descrito en las instrucciones de la carpeta. Este medio de reacción suministra suficiente proteína expresada por celulasa y de los ensayos de Western blot. Las reacciones fueron incubadas de acuerdo con las instrucciones durante 10 horas a 30 ° C en el termociclador de PCR después de sellar con cinta de papel de aluminio. La temperatura se mantuvo a 4 ° C hasta que azo-CMC placa manchado podría comenzar.

Temperatura y pH evaluaciones de la proteína expresada utilizando automatizado azo-CMC placa de ensayo

Para pH perfiles de actividad, cuatro azo-CMC placas a diferentes pH (5,8, 5,0, 4,5, y 4,0) fueron cargados en el pasivo apilador (Figura 1 # 13), la remoción de tapa por la pinza del brazo de la grúa de la placa (Figura 1 # 3) y se trasladó a S1, luego a S6 en la zona de trabajo del manejador de líquido (Figura 1 # 9) automatizados para la azo-CMC placa de ensayo. La grúa se trasladó la placa de 96 pozos hardshell placa que contiene la proteína producidos in vitro a partir de la termociclador de PCR (Figura 1 # 5) a S1. Desde esta posición de la placa fue llevado a S6 a fin de que el líquido podría manejador pinza lugar en la fría placa de posición en la cubierta, y luego en la posición de jota piercing y finalmente de nuevo a la posición de frío en la cubierta. Un SoftLinx-XAP iniciado protocolo se utilizó para detectar la proteína en la azo-CMC placas para el ensayo utilizando la pipeta del líquido del brazo manipulador. Las placas fueron trasladados a S6 con la pinza, y luego enviada a S1 a ser recogidos por la placa de grúa y colocado en S2. Las placas fueron trasladados a S5 para la carga en la incubadora. Para la evaluación de la estabilidad de la temperatura, la placa con hardshell proteína se trasladó a la termociclador de PCR (Figura 1 # 5), se incuba a 50 ° C durante una hora, luego se trasladó de nuevo a la fría posición en el líquido manejador de cubierta. Un nuevo pH 5,8 azo-CMC placa fue trasladado a la zona de trabajo, manchadas con el acalorado proteínas, y se trasladó a la Liconic incubadora con los otros azo-CMC placas. Todas las placas fueron incubadas a 37 ° C durante 10 horas. Las placas se han movido a la pila a cabo en el pasivo apilador y fotografió utilizando el Alpha Innotech 3400 la estación de la imagen digital.

Conflicto de intereses

Los autores declaran que no tienen intereses en conflicto.

Contribuciones de los autores

SSR diseñó el workcell, esbozó workcell protocolos, y planificada estrategia de la biología molecular. SBR PJF y diseñados y montados de la workcell integrado y la workcell protocolos. XLL siempre celF cDNA de Orpinomyces PC-2. JM determinado plásmido concentraciones. Los análisis de datos y la asistencia técnica fueron proporcionados por SSR, JM, NQ, XLL, KB, y MC.

Agradecimientos

Nos gustaría agradecer la asistencia técnica y las contribuciones de John Jackson, Watson Chau, y Jonathan Legazo, Unidad de Investigación de la BBC, NCAUR, en el suministro de datos. También queremos dar las gracias a Jody Robinson y Jennifer Steele, Genómica Microbiana y Bioprocessing (MGB) Unidad de Investigación, NCAUR, instalación de la secuencia básica, por su trabajo en la generación y la identificación de las secuencias de CelF mutantes. Nos gustaría expresar nuestro agradecimiento a Karen Hughes para la edición y formateo de este manuscrito. Estamos también muy agradecidos por los valiosos comentarios y sugerencias proporcionados por el doctor Timothy Leathers.