Journal of Occupational Medicine and Toxicology (London, England), 2006; 1: 5-5 (más artículos en esta revista)

Método de optimización y validación para la determinación simultánea de los metabolitos del ácido araquidónico en el aliento condensado exhalado por cromatografía líquida de ionización por electrospray y espectrometría de masas en tándem

BioMed Central
Luis González-M Reche (arbeitsmedizin@ukaachen.de) [1], Anita K Musiol (amusiol@ukaachen.de) [1], Alicia Müller-Lux (alice.mueller @ post.rwth-aachen.de) [1] , Thomas Kraus (tkraus@ukaachen.de) [1], Thomas Göen (thomas.goeen @ post.rwth-aachen.de) [1]
[1] Instituto y ambulatoria-Clínica de Medicina Ocupacional y Social, Hospital Universitario, Universidad de Tecnología de Aachen, Pauwelsstrasse 30, D-52074 Aachen, Alemania
[2] Institute for Occupational, Social y Ambiental Medicina de la Universidad Erlangen-Nuremberg, Schillerstr. 29, D-91054 Erlangen, Alemania

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Resumen
Antecedentes

Determinaciones de marcadores de inflamación en el condensado exhalado aliento se utilizaron para evaluar inflamación de las vías respiratorias. El método aplicado para la mayoría de este tipo de determinación es de inmunoensayo enzimático. Para fines de investigación para encontrar nuevas o se refieren a concretas a los diferentes biomarcadores de enfermedades pulmonares, una determinación simultánea de los diferentes marcadores de inflamación sería ventajosa.

Métodos

Hemos desarrollado un método analítico en línea con la limpieza y el enriquecimiento medidas para determinar 12 diferentes marcadores de inflamación en el condensado exhalado aliento. Un método de detección específico garantiza inequívocamente la determinación de cada analito en el mismo plazo. El método fue validado y optimizado para lograr un bajo límite de cuantificación hasta 10 pg / mL cada analito. La precisión del método osciló entre el 4 y el 16%.

Conclusión

El método presentado debe servir como una herramienta de fácil y rápido para evaluar la utilidad de los marcadores de inflamación en el condensado exhalado aliento a diferentes enfermedades pulmonares y de varias disciplinas relacionadas con la medicina.

Antecedentes

Los diferentes marcadores en el aliento condensado exhalado (EBC) se han medido y se usa para la evaluación y el seguimiento de inflamación de las vías aéreas [1]. Inflamación de las vías aéreas es una consecuencia de muchas enfermedades pulmonares como el asma, fibrosis quística o enfermedades pulmonar obstructiva crónica (EPOC) [2 - 4]. En medicina del trabajo, muchos de los problemas surgen de las reacciones alérgicas relacionadas con las enfermedades respiratorias, que deben ser evaluadas para seguir los procedimientos médicos. Análisis de la EBC es un método poco invasivo para la medición de la baja volatilidad de los mediadores de la inflamación que se sabe que son exhaladas con la expiró el vapor de agua de las personas [5]. En contraste con las técnicas invasivas como el lavado broncoalveolar y las biopsias bronquiales, la EBC extracción de la muestra puede ser utilizado repetidas veces y no induce una respuesta inflamatoria por sí mismo. Fácil no invasiva de extracción de la muestra es una tarea importante en la medicina del trabajo, donde los trabajadores son a menudo las cuestiones de examen de carácter voluntario.

Eicosanoides son mediadores derivados de ácido araquidónico e incluyen las prostaglandinas (PG), isoprostanes y leucotrienos (LT). Estos eicosanoids se utilizaron para tratar de evaluar la inflamación pulmonar en pacientes con enfermedad pulmonar. Algunas prostaglandinas y tromboxanos proinflamatorias o podría tener propiedades anti-inflamatorias [6]. Leucotrienos son potentes constrictors proinflamatorias y mediadores. Leucotrienos LTC 4, LTD 4 y LTE 4 se conocen como cysteinyl leucotrienos-[7].

Isoprostanes están formados por los radicales libres-catalizó la peroxidación lipídica del ácido araquidónico y de actuar como un producto bioactivo de la peroxidación lipídica [8]. Su formación es por el aumento de estrés oxidativo sistémico [9]. Se realizaron estudios para determinar 8-isoprostane en EBC de las pacientes con enfermedades pulmonares [10 - 13].

GC / MS [7], LC / MS [14], [15] RIA y ELISA se utilizaron técnicas de análisis para la cuantificación de este tipo de sustancias en el EBC. Determinaciones de marcadores inflamatorios en EBC con ELISA sólo puede ser hecho por una sustancia o en el mejor de como la suma de los parámetros.

Es el objetivo de este estudio para optimizar y validar un procedimiento analítico para determinar simultáneamente diferentes marcadores de inflamación en EBC con una detección específica como la espectrometría de masa (MS), en contraste con la mayoría de ELISA aplicado métodos de análisis utilizados aún. Para una sensible detección, en especial de información estructural, la espectrometría de masas en tándem se utilizó para determinar de manera inequívoca las prostaglandinas y leucotrienos. Este método podría servir para vigilar marcadores inflamatorios en EBC de los trabajadores necesarios para profundizar la investigación en medicina del trabajo.

Métodos

Con los últimos avances en la cromatografía líquida y la espectrometría de masas separaciones de los sistemas de detección, la mejora de la sensibilidad y la detección simultánea de múltiples analitos es posible. Sin embargo, la determinación de este tipo de marcadores en el aliento condensado hace una muestra de enriquecimiento paso inevitable cuando se trataba de lograr un bajo límite de detección para cubrir el rango esperado en el nivel más bajo pg / mL.

Mediante la combinación de la línea de enriquecimiento y de la LC / MS / MS técnicas que hemos desarrollado un método de análisis para la detección sensible de 12 de diferentes mediadores de la inflamación y los marcadores de estrés oxidativo, tratando de hacer una contribución a la determinación de marcadores inflamatorios en la EBC para mejorar y simplificar La investigación relativa a las enfermedades de diferentes disciplinas en la medicina.

Productos Químicos

La prostaglandina D 2 (PGD 2), 13,14-dihidro-15-ceto-PGD 2, 11 β-PGF 2 α, PGJ 2, Δ 12-PGJ 2, PGF 2 α, 13,14-dihidro-15-ceto-PGF 2 α , PGE 2, 15-ceto PGE-2, 13,14-dihidro-15-ceto PGE-2, 8-iso-PGF 2 α, 15-deoxi-Δ 12,14-PGJ 2, 6-ceto-PGF 1 α, 6,15-diketo-13 ,14-dihidro-PGF 1 α, la Leukotrienes LTB 4 y LTE 4 como de análisis y las normas de la etiqueta [2 H 4] LTB 4 y [2 H 4] PGE 2 como se compraron las normas internas de Caimán Empresa de Productos Químicos (Michigan, EE.UU.). Todas las normas de análisis químicos de pureza> 98%.

Acetonitrilo se adquirió de JT Baker (Alemania), el metanol (GC-grado), ácido acético (glacial, pro analysi) y acetato de amonio pa se adquirió de Merck (Darmstadt, Alemania). Bi-agua destilada se utiliza para la fase móvil HPLC mezcla.

Norma de preparación y normalización interna

Una solución madre se preparó con 10 μ g / mL de cada descrito analitos en acetato de amonio 10 mM / metanol 1:1 (v / v). Esta solución madre se alicuotar y almacenados a -80 ° C en 1,5 ml de reacción tubos eppendorf hasta nuevo uso. 100 μ l de la solución madre se colocó en una 100 mL de vidrio matraz aforado y diluido a la marca con acetato de amonio 10 mM la obtención de un 10 ng / mL de solución. Esta solución se utiliza como solución de trabajo para la preparación de los demás concentraciones estándar para la calibración y control de calidad de materiales.

Para la preparación de las normas internas de soluciones disponible en el comercio [2 H 4] LTB 4 y [2 H 4] PGE 2 fueron utilizados (Figura 3]. Una solución stock de 100 ng / mL en acetato de amonio 10 mM se preparó. A 1 mL alícuota de la solución madre del patrón interno, se colocó 5 mL en un matraz aforado de vidrio y diluir a la marca con acetato de amonio 10 mM la obtención de un 20 ng / ml solución para cada etiqueta estándar. [2 H 4] LTB 4 es utilizado para la corrección de leucotriene valores de respuesta, mientras que [2 H 4] PGE 2 se utiliza para la prostaglandinas y 8-isoprostane. Para la cuantificación, el pico de área de los derivados de las prostaglandinas a los analitos [2 H 4] PGE 2 y el pico de área de los derivados de leucotrienos a [2 H 4] LTB 4 fueron utilizados.

EBC recogida de muestras

El comerciales disponibles ECOSCREEN condensador de Viasys Healthcare-(Hoechberg, Alemania) se ha utilizado para la recogida de muestras EBC. Los sujetos fueron alentados a realizar las mareas respiración durante 15 minutos a través de la boquilla conectada al condensador mientras que el uso de un clip de la nariz. El resultado EBC volúmenes de un rango de 1 a 3 ml. Las muestras fueron alicuotar en Eppendorf microtubos de 1,5 mL y almacenadas a -80 ° C hasta el análisis. Descripción detallada acerca de la recogida de condensado exhalado aliento se describe en otro lugar [16].

Preparación de la muestra

EBC muestras congeladas / solución estándar fueron descongelados y permite equilibrar a temperatura ambiente. 1 mL alícuotas de cada muestra fueron trasladados a 1,8 mL tornillo de la tapa de vidrio del vial para el análisis HPLC y 100 μ l de la solución de trabajo del patrón interno se han añadido a cada muestra. A continuación, las muestras fueron mezcladas y un vórtice 900 μ L alícuota se inyecta en la LC / MS / MS sistema para el análisis cuantitativo.

Procedimiento de calibración y control de calidad

A partir de la solución de trabajo de análisis de las normas antes descritas, seis normas de calibración en el rango de 10 a 500 pg / mL se prepararon por dilución de la solución de acetato de amonio con 10 mM. Lineal curvas de calibración se obtuvieron por el trazado de los cocientes de las áreas de los picos de cada analito con la asignada patrón interno [2 H 4] LTB 4 o [2 H 4] PGE 2 como una función de las concentraciones utilizadas. Estas curvas de calibración se utilizaron para determinar los analitos de pinchos en la EBC muestras.

No había control de los materiales disponibles en el comercio. Por lo tanto el control de la calidad material fue preparado en el laboratorio spiking un tampón de acetato de amonio corresponde con la cantidad de analitos. Dos niveles de concentración que cubren la parte superior y la inferior rango se prepararon para el control de calidad. Por la baja concentración de material de control de calidad (Q1), de pinchos 10 mM de acetato de amonio con 50 pg cada analito por mL, mientras que para los de alta concentración de material de control de calidad (Q2), de pinchos 10 mM de acetato de amonio con 500 pg / mL. El control de calidad de materiales de pinchos se alicuotar y almacenados a -80 ° C hasta el análisis. Para garantía de calidad Q1 y Q2 muestras de control se incluyeron en cada serie de análisis para la validación de métodos. Estabilidad de los compuestos se midió mediante el análisis de la prueba y alicuotar en la congelación de -80 ° C Q1 y Q2 soluciones.

Cromatografía líquida

Cromatografía líquida de la separación se realizó en una Hewlett-Packard HP serie 1100 HPLC equipado con un sistema binario gradiente bomba, una bomba isocratic, desgasificador y Autosampler. El isocratic bomba se utiliza para cargar los 900 μ l alícuota en un material de acceso restringido (RAM) fase, un LiChrospher RP-18 ADS (25 μ m, 25 × 4 mm) de Merck (Darmstadt, Alemania), utilizando un buffer de acetato de amonio 2 MM (pH 4,6) y el metanol (9:1, v / v) como fase móvil y un caudal de 0,8 mL / min. La carga de la muestra en esta fase de RAM sirve como un paso de enriquecimiento y de excluir las macromoléculas como las proteínas que estaban presentes en la EBC. A continuación, fueron trasladados en analitos backflush modo controlado a través de un tiempo de seis puerto de la válvula (Rheodyne) con el gradiente LC bomba a la columna de análisis HPLC (Prisma-RP 150 × 2,1 mm, de Thermo). El gradiente de elución LC condición y la válvula de conmutación pasos se describen en la Tabla 1. Todos los pasos estaban bajo el control de los Analistas 1,3 Software de Perkin Elmer isocratic excepto la bomba. Un esquema de los dos sistemas de dimensiones columna se representa en la Figura 1.

Optimización de la línea de limpieza y enriquecimiento paso

LC-LC Una columna de conmutación método fue optimizado para la automatización de las muestras de limpieza y enriquecimiento para el análisis de marcadores de inflamación en EBC.

Para la muestra de enriquecimiento automatizado de paso, un LiChrospher ® ADS C18 se utilizó. Este es un llamado material de acceso restringido (RAM) fase, en donde la extracción de los analitos se basa en dos procesos cromatográficos: por un lado, las interacciones en fase reversa para el mantenimiento del medio unpolar y compuestos polares, y por otro lado el tamaño de la cromatografía de exclusión Evitar las macromoléculas como las proteínas [17]. Estas macromoléculas son eluidos con el vacío en el volumen de residuos. Moléculas con un peso molecular de hasta 15 kDa son capaces de penetrar en los poros y se conserva en fase reversa interacciones. C8 también ADS y ADS C4 RAM fases se pusieron a prueba cuantitativa, pero la retención de todos los analitos, se alcanzó sólo por la ADS C18.

El disolvente isocratic fue optimizado a un 2 mM solución acuosa de acetato de amonio y metanol (90/10, v / v) para cargar la muestra en la RAM 18 ADS fase analito sin pérdidas y con la mayoría de limpieza efecto de los compuestos de matriz.

Después de la carga y de lavado de la muestra con el isocratic disolvente para eliminar las macromoléculas y compuestos polares en los residuos, la transferencia paso a la columna analítica puede iniciarse. Pasando el puerto de conmutación de seis válvulas en posición B de los analitos pueden ser eluidos en backflush modo en la fase de RAM con el gradiente de disolventes y trasladado a la columna de análisis de la separación de los analitos (véase la figura 1]. Las condiciones iniciales para el gradiente de solventes fue una composición de 70% de disolvente y un 30% de disolvente B (70:30, v / v) siendo un disolvente y disolvente B se describe en Métodos.

Espectrometría de masas

Un Sciex API 3000 tándem MS sistema se utiliza para la detección MS-MS electrospray con una fuente de iones negativos en el modo de iones (ESI-). Compuesto específico espectrómetro de masas se optimiza automáticamente los parámetros con los correspondientes Sciex Analistas 1.3.1 de las herramientas de software de inyección continua de cada recinto con una bomba de jeringa junto a la LC / MS / MS sistema. Fuente parámetros específicos que dependen de las condiciones cromatográficas fueron optimizados manualmente. La fuente de iones establecido parámetros son los mismos para todos los analitos. El voltaje aplicado fue electrospray aguja - 3500 V de nitrógeno y se utilizó como nebulizador y turbo calentador de gas (500 ° C) a una presión de 8 psi cada uno, así como para el establecimiento de la colisión de gas a las 10 unidades de instrumento. La cortina de gas se fija a 8 psi. GRM (múltiples reacción de vigilancia) fue el modo elegido para llevar a cabo la detección MS-MS. GRM modo permite el registro simultáneo de todos los MS-MS transiciones en un tiempo de búsqueda de 150 ms para cada fragmentación. En la modalidad utilizada ESI negativo, el precursor iones seleccionados en la primera cuadripolares para todos los analitos fueron [MH] -. El producto de iones fragmentos fueron seleccionados con la máxima intensidad para todos los analitos de garantizar la máxima sensibilidad. El espectrómetro de masas para cada sustancia, las condiciones de cada compuesto se enumeran en el cuadro 2 y se realizaron con el flujo continuo de las inyecciones de las soluciones estándar de todos los analitos junto con un sistema de bomba de jeringa a la Sciex API 3000 LC / MS / MS sistema. Así que fue posible encontrar la más específica e intensa padre-hija de iones transiciones para cada compuesto para la detección MS tándem (véase el cuadro 2].

Resultados y discusión
Optimización de enriquecimiento y de la cromatografía

El aumento de la fracción de disolvente B, como se muestra en el Cuadro 1 los analitos pueden ser eluida de la Fase de RAM y separados en la columna de análisis antes de la detección. Después de todos los analitos se eluida de la columna de análisis, tanto de memoria RAM y de la columna de análisis fueron el lavado con un 100% de disolvente B antes de reacondicionamiento para el próximo plazo. Optimización de la separación cromatográfica de los analitos es necesario distinguir algunos de los isómeros estructurales de las prostaglandinas, que se han traducido en el mismo padre-hija de iones transiciones. El conjunto de análisis en tiempo de ejecución, incluido el reacondicionamiento paso de la columna de la próxima inyección, fue de 21 min. La Figura 2 representa un ejemplo de cromatograma de pinchos EBC con cada analito.

Espectrometría de masas y la normalización interna

Un aumento de la respuesta de los detectores de los analitos se logró mediante el uso de un 2 mM ammoniumacetate disolvente como fase móvil, en contraste con el agua o superior concentrada ammoniumacetate buffer. Esto se debe probablemente a una óptima condición de ionización en la fuente de iones para estas sustancias. Sólo la PGF 2 α derivados tienen un 10-25% la mejora de la respuesta utilizando el agua bi-destilada como fase móvil. Tratando de cubrir la mayor parte de los analitos con la mayor respuesta posible 2 mM de amortiguación ammoniumacetate fue seleccionado como fase móvil.

Uso de la zona de los cargos [2 H 4] LTB 4 y [2 H 4] PGE 2 como factor de correccionales de todos los demás leucotrienos y prostaglandinas, respectivamente, muestra un mejor coeficiente de correlación de la curva de calibración en la regresión lineal de que la renuncia a la aplicación de Estas normas internas a la homóloga analitos (Figura 4]. Aun cuando estas normas internas han utilizado sólo como comportamiento cromatográfico similar a la aplicada analitos diferentes, de modo que era posible mostrar una mayor correlación interna de la aplicación de cada norma correspondía a los grupos de sustancias que sin patrón interno.

La fiabilidad del método

Comparando calibraciones logrado con los analitos de pinchos en 2 mM ammoniumacetate de amortiguación y agrupados EBC se pudo demostrar ningún matriz de influencia para la pendiente y la linealidad de la curva de calibración. Debido al bajo contenido de compuestos de matriz en EBC en contraste con otras como la matriz de orina o plasma que podrían influir en la respuesta de los analitos en cuestión, no se observó efecto de la matriz como se esperaba. EBC está formada principalmente por vapor de agua que no contiene compuestos volátiles en las partículas de aerosol llevar durante la respiración. Agrupados EBC se utilizó como representante de la matriz individual adquirida EBC.

Curvas de calibración con pinchos EBC son congruentes con las curvas realizadas en tampón de acetato de amonio 10 mM. Así, se obtuvieron las curvas de calibración por spiking aumento de las cantidades de los analitos en 2 mM ammoniumacetate y en mezcla EBC. Todas las curvas de calibración obtenida en el rango de 10 a 500 pg / mL es lineal (Figura 4 y como ejemplo véase la Tabla 3] y coeficientes de correlación lineal producido mayor que 0,99.

De precisión y exactitud

La repetibilidad intradía se abordó el análisis de Q1 y Q2 diez veces en una fila y en seis días diferentes como consecuencia de una desviación relativa de todos los parámetros en el rango de 2-6% para los dos niveles de concentración. La desviación relativa de la repetibilidad entre los días para el Q1 y Q2 nivel osciló entre el 4-16% y del 6-12%, respectivamente.

Precisión se obtuvo a partir de la relación de la calculada y el importe nominal de pinchos para los mencionados niveles de concentración medidos diez veces en una fila. En la Q1 y Q2 nivel de precisión para todos los analitos excepto 15-deoxi-Δ 12,14-PGJ 2 osciló entre 93-120% y del 88-133%, respectivamente. Para el mencionado 15-desoxy-Δ 12,14-PGJ 2 exactitud media fue de aproximadamente 150%, lo que resulta en una sobreestimación de la concentración calculada. Esto puede ser debido a la falta de un patrón interno de la mencionada sustancia, en contraste con los otros analitos donde el patrón interno utilizado parece reflejar el comportamiento de los compuestos asignado. Otra posible razón puede ser un efecto positivo para la matriz de este analito en que otros compuestos de matriz podría aumentar la ionización en la fuente para el analito de que se trate. Los datos que muestra la fiabilidad del método se presenta en la Tabla 3.

Límite de detección y cuantificación

Los límites de detección (LOD), que se define como una relación señal / ruido de los tres registrados para el fragmento de iones, se estima que alrededor de 5 pg / mL.

Los límites de cuantificación (LDC) se define como una relación señal / ruido de seis para los inscritos fragmento iones, se estima en cerca de 10 pg / ml.

La estabilidad de los analitos

No disminuciones en la concentración de los compuestos fueron observados durante un período de unas 8 semanas almacenadas a -80 ° C.

Consideraciones generales

En la literatura, las mediciones de PGE 2 y PGF 2 α se incrementan en el condensado exhalado aliento de los pacientes con EPOC.

Leucotrienos EBC se detectaron en las muestras de sujetos sanos y asmáticos por tanto, inmunoensayo y GC / MS [3, 7]. La mediana de las concentraciones exhalado LTD 4, LTE 4 y LTB 4 en individuos asmáticos (adultos y niños) se incrementaron en comparación con las de los adultos sanos y los niños, respectivamente [7].

Algunos estudios se realizaron para determinar 8-isoprostane en EBC de pacientes asmáticos [12], de los niños con exacerbaciones de asma [11], los sujetos con EPOC [12] y los pacientes con fibrosis quística [13]. Carpagnano et al. [12] encontraron una mayor concentración media de 8-isoprostane EBC en muestras de pacientes con EPOC en comparación con sujetos sanos.

Todos estos estudios ocuparse de determinaciones de marcadores inflamatorios que sirven como marcadores biológicos, la diferenciación entre el aumento de los niveles de concentración en los pacientes de más bajos niveles de concentración endógena en EBC en sujetos sanos.

La mayoría de los datos encontrados en la literatura fueron las determinaciones hechas por ELISA o RIA, donde los anticuerpos de reactividad cruzada debe ser considerado. Hay un conocimiento limitado acerca de la fiabilidad de inmunoensayo enzimático para determinar la carpeta de marcadores inflamatorios en EBC. Il'Yasova et al [18] informe sobre un método de comparación de la determinación de un isoprostane derivado en la orina mediante GC / MS y ELISA. Con el ELISA 30 veces excesiva, en contraste con el GC / MS se obtuvo para este parámetro en la orina.

No es posible determinar simultáneamente diferentes marcadores de inflamación en una carrera con la tecnología ELISA, mientras que otras ventajas como la rentabilidad y el análisis de alto rendimiento hay que señalar por ELISA. Para fines de investigación podría ser importante hacer un seguimiento de diferentes parámetros simultánea puede referirse a diferentes marcadores o de una clase de sustancia a diferentes enfermedades. Sin embargo, debido a los pequeños volúmenes de las muestras obtenidas de EBC, esta ventaja de determinar varias sustancias en una carrera hay que destacar.

En contraste con los métodos GC / MS, LC / MS tiene la ventaja, que los procedimientos de derivatización y de la correspondiente muestra de pre-tratamiento para los no volátiles no es necesario, por lo tanto, evitar más fuentes de errores. La especificidad de la detección MS asegura una inequívoca determinación de las sustancias analizadas.

Conclusión

La mayoría se aplica el método de cuantificación para el análisis de EBC se eicosanoids en venta en el comercio vinculado inmunoensayos enzimáticos, que es muy sensible, pero carecen de especificidad en la detección y estructurales relacionados con la información como la espectrometría de masas.

Nuestro método desarrollado permite una sensible, específico y fiable determinación de los leucotrienos y prostaglandinas en el EBC, evitando así las fuentes de error debido a la aplicación automática de la muestra tratamientos previos. Con el método que aquí se presenta, es posible detectar las prostaglandinas y leucotrienos derivados simultáneamente hasta un LDC, de 10 pg / mL, respectivamente, y pueden ser muy útiles para las conclusiones de nuevos biomarcadores de enfermedades pulmonares o incluso a aplicar otras metodologías para la evaluación de riesgos, tales como Metabonomics. La aplicación de estos métodos podría ayudar al avance de las evaluaciones de las enfermedades pulmonares usando aliento condensado exhalado como un fácil matriz de la muestra obtenida para diagnóstico.

En este contexto, una revisión crítica acerca de la utilidad de EBC pulmonar para los investigadores y los clínicos se describe por Effros et al. [19].

Conflicto de intereses

Los autores declaran que no tienen intereses en conflicto.

Contribuciones de los autores

LMGR y AKM llevó a cabo el método de desarrollo. AML, TG y CT participó en la concepción del estudio y ayudó a redactar el manuscrito.

Agradecimientos

Los autores desean agradecer a la Srta Kathy Bischof gramaticales para la revisión de este manuscrito.