Kinetoplastid Biology and Disease, 2006; 5: 2-2 (más artículos en esta revista)

Un método rápido y simple para la detección de Trypanosoma evansi en el camello dromedario anidadas utilizando una reacción en cadena de polimerasa

BioMed Central
Imadeldin E Aradaib (aradaib@yahoo.com) [1], A Ali Majid (ali.majid @ gmail.com) [3]
[1] Unidad de Investigación en Biología Molecular, Universidad Nacional de Ribat, Jartum, Sudán
[2] Laboratorio de Biología Molecular (MBL), Departamento de Medicina, Farmacología y Toxicología de la Facultad de Medicina Veterinaria de la Universidad de Jartum, PO Box 32, Norte de Jartum, Sudán
[3] Consejo Nacional de Investigación, Khartoum, República de Sudán

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Resumen

Un anidados de reacción en cadena de la polimerasa (nPCR) basado en ensayo, se desarrolló y evaluó para la detección rápida de Trypanosoma evansi en ratones infectados experimentalmente infectadas y, por supuesto, los camellos (Camelus dromedarius). Cuatro oligonucleótidos (TE1, TE2, TE3 y TE4), seleccionados a partir de genes nucleares repetitivos de T. Evansi, fueron diseñados y utilizados para PCR amplificaciones. La primera amplificación, utilizando un par de cebadores TE1 exterior y TE2, produjo un 821-bp PCR principal producto de T. Evansi ADN. La segunda amplificación, utilizando anidadas (interna) TE3 par de primers y TE4, produjo un 270-bp PCR producto. T. Evansi ADN extraído de muestras de sangre de ratones infectados experimentalmente y naturalmente infectados sudaneses dromedario raza de camellos fueron detectados por esta basado en la PCR anidada ensayo. El anidados primers TE3 y TE4 aumento de la sensibilidad del ensayo de PCR y de tan poco como 10 fg de T. Evansi ADN (equivalente a una única copia del gen putativo del parásito) se amplificó y visualizados en bromuro de etidio-geles de agarosa teñidos.

Amplificación de los productos no se detectaron cuando el ensayo basados en la PCR se aplicó al ADN de otros parásitos de la sangre incluyendo Thieleria annulata, Babesia bigemina ácido nucleico o muestras gratis. La aplicación de la presente nPCR basada ensayo de muestras clínicas como resultado directo de detección de T. Evansi de una variedad de tejidos de las muestras obtenidas de ratones infectados experimentalmente y naturalmente infectados sangre de los camellos. El descrito nPCR basada ensayo proporciona una valiosa herramienta para estudiar la epidemiología de T. Evansi infección en camellos y otras poblaciones de animales susceptibles.

Antecedentes

Trypanosoma evansi (T. evansi), la causa de la tripanosomiasis (Surra), que constituye uno de los principales problemas veterinarios en todo el mundo. La enfermedad causa importante de morbilidad y mortalidad en los camellos en el Sudán, que tiene una población de más de 3 millones de camellos [1]. Tripanosomiasis en los camellos se produce tanto en las formas crónica y aguda [2]. La forma crónica de la enfermedad es más común y es probable que esté asociado con infecciones secundarias debido a la inmunosupresión [3]. Signos clínicos y patológicos de las lesiones causadas por T. Evansi en camellos no son fiables para el diagnóstico definitivo [4]. Además, la detección de parásitos en la sangre es difícil, ya que la parasitemia es intermitente [5]. Pruebas serológicas han sido desarrolladas y evaluadas para el diagnóstico de la tripanosomiasis en camellos. Incluyen tarjeta de la prueba de aglutinación y ensayo inmunoenzimático (ELISA-Ab) [6 - 8]. En general las técnicas serológicas son útiles para la detección de la infección por un pasado, pero no para la detección de una infección activa con T. Evansi. Para solucionar estos problemas, sondas de hibridación de ácidos nucleicos han sido desarrollados y evaluados para la detección de T. Evansi. Sin embargo, la concentración de T. Evansi muestras de ADN en casos de sospecha puede ser por debajo del límite de detección de la hibridación de ensayo y, por tanto, los casos positivos, probablemente no se [9]. Por lo tanto, es cada vez más evidente que el desarrollo de técnicas de diagnóstico molecular para la rápida, sensible y específica de detección de T. Evansi sería ventajosa en diversas circunstancias, como la investigación de la enfermedad clínica y los estudios epidemiológicos de la enfermedad, así como en los programas de control. Recientemente, la reacción en cadena de polimerasa (PCR) ha sido ampliamente utilizado como altamente sensible y específica para la detección de ensayo de tripanosomas. Primers orientación subgrupo Trypanozoon fueron descritas previamente [10, 11]. Además, repetitivo nuclear T. Evansi específicas ensayos de PCR también se han desarrollado [10 - 12]. El PCR se ha utilizado en los estudios para determinar la prevalencia de T. Evansi en camellos de diferentes regiones en Kenya [3] y en los búfalos en Vietnam (Holland et al., 2001) y T. Equiperdum en mongol caballos [13]. Sin embargo, la PCR no ha sido utilizada sistemáticamente para la detección de T. Evansi en camellos en el Sudán. En este estudio, se describe una forma simple, rápida, sensible y específica para la detección de ensayo de T. Evansi en Sudán dromedario raza de camellos (Camelus dromedarius) utilizando amplificación nPCR.

Resultados

El nPCR basada ensayo sensible y específico que ofrece la detección de todos los T. Evansi cepas obtenidas de ratones infectados experimentalmente infectadas y, por supuesto, los camellos. El exterior par de primers TE1 y TE2 producido una primaria de 810 bp PCR producto de T. Evansi ADN. El primer 810-bp PCR producto fue visualizado en bromuro de etidio-gel manchadas de ≥ 10 pg de ADN T evansi. (Figura 1]. Uso de la anidados primers (T3 y T4), el ensayo de PCR resultado en la amplificación de un producto de 270 bp PCR de los principales productos de PCR. El anidados 270 bp PCR se detectó producto de tan poco como el 10 fg de T. Evansi ADN (equivalente a una única copia del gen nuclear repetitivos de T. evansi). La amplificación anidada aumentado la sensibilidad del ensayo de PCR y se confirmó la identidad de las secuencias de nucleótidos de la amplificación de PCR de productos primarios (Figura 2].

El importe de 1,0 ng de DNA de otros parásitos de la sangre incluyendo Thieleria annulata, Babesia bigemina; ácido nucleico-muestras gratis, muestras de sangre y tejidos no infectados de ratones y los camellos no se llegara a la primaria o la anidados productos de amplificación (Figura 3]. Los productos específicos de PCR se detectó directamente de una variedad de muestras de tejidos infectados, incluyendo, unfractionated lisadas sangre, el bazo, pulmón e hígado homogeneizado de ratones infectados experimentalmente (Figura 4] y de la sangre de los infectados naturalmente camellos (Figura 5]. Usando el par de primers semi-anidada 1 (TE1 y TE4), el ensayo de PCR resultado en la amplificación de un 490-bp PCR producto. Asimismo, la utilización de los cebos par de semi-anidada 2 (TE3 y TE2) produjo un 590-bp PCR producto (figura 6].

Discusión

La importancia económica de T. Evansi infección se debe principalmente a la enfermedad clínica en los camellos en muchas partes del mundo [14 - 18]. PCR se ha utilizado con éxito en la detección de la infección con T. Evansi en búfalos [12, 19], [13] los caballos y en camellos [11]. Hasta la fecha, no hay datos completos sobre el uso de la PCR para la detección de la infección en Sudán dromedario raza de camellos (Camelus dromedarius). A falta de otras técnicas de diagnóstico, los propietarios de camellos y etno-veterinarios confían en el olor de la orina para el diagnóstico de T. Evansi infecciones. El característico olor de la orina se debe a cetonas producido después de desglose de los aminoácidos por el parásito en los animales infectados [20].

Parasitológicos convencionales técnicas seguirán siendo importantes para la comprensión de la biología, la ecología y la epidemiología molecular de las diferentes cepas de parásitos. El ensayo se describe nPCR sencillo, rápido, sensible y específico para el método de detección de T. Evansi naturalmente infectados en camellos (Camelus dromedarius), y puede ser recomendado para su inclusión en los programas de estudio y de control. El nPCR basada ensayo utilizando primers derivados de genes nucleares repetitivos de T. Evansi y reproducen y específicamente detectado todas las cepas del parásito utilizada en este estudio. La selección de estos universal primers se basó en la observación de que el gen ha repetitivos nuclear altamente conservadas las secuencias de nucleótidos [11]. El nPCR ensayo fue un procedimiento simple que detecta de manera eficaz todos los T. Evansi cepas bajo la condición de rigor utilizado en este estudio. El límite de detección de laboratorio indicaron que el nPCR protocolo es capaz de detectar la cantidad de 10 del total de T. fg Evansi ADN genómico.

La especificidad de los estudios indica que la principal específicas 821-bp y el anidados 270-bp PCR productos no se amplifica aún de las concentraciones de 10 ng de ADN de la sangre de otros parásitos incluidos Thieleria annulata, Babesia bigemina y células de la sangre de los ratones infectados y no en virtud de camellos El mismo rigor condición descrita en este estudio. Sobre la base de estos resultados de sensibilidad y especificidad de este estudio, se describe el nPCR deben ser considerados como los más sensibles y específicos de ensayo en comparación con el anteriormente descrito PCR basado en la detección de los ensayos [10, 12, 13, 19]. El segundo paso de amplificación utilizando los cebadores anidados TE3 y TE4 es necesario para confirmar la especificidad del producto amplificado primaria y de aumentar la sensibilidad del ensayo de PCR basada en por lo menos 1000 veces en particular, cuando la concentración de la T. Evansi ADN en la muestra es inferior a 10 pg. El uso de la amplificación anidada para el diagnóstico confirmatorio de T. Evansi esta infección hace que el ensayo de PCR una rápida y de bajo costo y ensayo. La PCR anidada no requiere ensayo de hibridación y esto elimina la peligrosos y radiactivos engorrosos procedimientos de laboratorio de trabajo con 32 o P 33 P en la hibridación ensayos [23]. El éxito fue también de amplificación obtenidos a partir de muestras de tejidos de toda la sangre de ratones infectados experimentalmente, a diferencia de otros ensayos de PCR en que el fraccionamiento de leucocitos de la sangre es necesaria para la detección del ADN del parásito [10]. Preparación de las muestras y extracción de ADN utilizando kit QIAamp extracción es un procedimiento simple, que toma una hora. Los ciclos térmicos para la producción de perfiles de la primaria y la nPCR productos fueron consistentemente 4 horas. Atletismo de la electroforesis en gel de agarosa y generalmente toma una hora. Así, el diagnóstico de confirmación de T. Evansi infección utilizando el ensayo descrito nPCR podría hacerse dentro de la misma jornada de trabajo.

La contaminación cruzada en nPCR reacciones de amplificación también es un problema. El problema de la contaminación podrían minimizarse utilizando ácido nucleico libre de aerosol resistente consejos y habitaciones separadas para la extracción de ADN y amplificación. Negativas y positivas de los controles deben incluirse en cada ensayo de PCR de mantener el límite superior de la sensibilidad y el límite inferior de la especificidad. La rapidez, la sensibilidad y especificidad de la nPCR ensayo facilitaría en gran medida la rápida detección precoz de la infección crónica o con T. Evansi en camellos y otros animales sensibles. La aplicación de la presente PCR anidada en una escala práctica para determinar la prevalencia de T. Evansi en camellos naturalmente infectados en diferentes estados de Sudán está en marcha.

Conclusión

El ensayo describe nPCR, utilizando bien caracterizado T. Evansi primers específicos, ofrece una sencilla, rápida, sensible y específica de detección de T. Evansi naturalmente infectados en camellos (Camelus dromedarius), y puede ser utilizado como una herramienta valiosa en estudios epidemiológicos y programas de control.

Métodos
Recogida de muestras de sangre

Se tomaron muestras de sangre limpia en vacutainers estériles, que contienen etilendiamina tetra acético (EDTA), de ratones infectados experimentalmente infectadas naturalmente y de los camellos. Las muestras de sangre se utilizan para la extracción del total de ácidos nucleicos para su uso como blanco de amplificación de ADN por PCR.

Examen parasitológico y el ratón inoculación

Dos tubos capilares fueron preparados de cada muestra de sangre heparinizado y centrifugada en un microhaematocrit centrifugadoras para 5 12000 g. Los tubos capilares fueron examinados para la presencia de tripanosomas móviles utilizando la técnica de centrifugación microhaematocrit. Cuatrocientos microlitros de sangre infectada de camellos fueron inoculadas en ratones criados en Suiza, que fueron seleccionados para la infección con T. Evansi mojado por baciloscopía punta de la cola-de sangre cada día para la detección de la parasitemia.

La extracción de ADN de muestras de sangre

Toda la sangre se utiliza para la extracción de ADN genómico total de usar disponible en el comercio de sangre kit QIAamp (QIAGEN Inc Chatsworth, CA, EE.UU.), con arreglo a las instrucciones del fabricante. En resumen, 200 μ l de sangre total, 20 μ l de proteinasa K solución madre, y 200 μ l de buffer de lisis se pipeta de 1,5 ml en tubo eppendorf y la mezcla se incuba a 37 ° C durante 30 minutos y luego a 70 ° C durante 10 minutos . 200 μ l de etanol absoluto fue agregado a la muestra y la mezcla fue mezclado por vortexing y spinning. La mezcla se transfirió a la QIAspin columna, y colocarse en un recipiente limpio de recogida tubo de 2 ml y se centrifuga a 8000 g durante 1 minuto. El QIAspin columna se lavó dos veces utilizando 500 μ l de lavado buffers W1 y W2, respectivamente. La columna de QIAamp spin fue colocado entonces en un limpia tubo eppendorf de 1,5 ml y el ADN se eluye con 200 μ l doble de agua destilada precalentada a 70 ° C. Máximo rendimiento de ADN se obtuvo por girar a 12000 g durante 1 min. La concentración de ADN se determinó mediante espectrofotometría a 260 nm de longitud de onda. Cinco μ l del ADN extraído fue utilizado en la amplificación de PCR.

La extracción de ADN de muestras de tejidos

Cinco ml de agua destilada se añadió a 1 g de cada muestra de tejido obtenida de los pulmones, el hígado y el bazo de ratones infectados experimentalmente. La muestra de tejido fue mezclado por la homogeneización. El homogenado fue tratado por congelación y descongelación y, por último, centrifugar a 3000 rpm durante 10 minutos. 200 μ l del sobrenadante se utiliza para la extracción de ADN siguiendo el mismo procedimiento utilizado para la extracción de ADN de la sangre, tal como se describe más arriba.

Primers selección

Primers (TE1 y TE2) se seleccionaron de una región altamente conservada de la secuencia publicada del gen nuclear repetitivo de Indonesia cepa de T. Evansi [24]. Este par de primers fue utilizado para la síntesis de los principales productos de amplificación de PCR. TE1 incluidas bases 91-110 sentido positivo de la línea de T. Evansi gen putativo (5)-AGG ACG CAG AAA TAG CAG-TA (3). TE2 incluido 881-900 bases de la complementaria capítulo: (5)-ATT TAA GTG GGC TTG AGT-AG (3). La PCR usando primers TE1 y TE2 dará lugar a una PCR de 810 bp producto. Para la amplificación anidada paso, oligonucleótidos (TE3 y TE4) fueron seleccionados de la misma secuencia publicada antes citada. TE3 consistió en bases 311-330 de la línea positiva (5)-TAC CTT TTA GAG GAG AGG-GA (3). TE4 fue diseñado a partir de la línea entre bases complementarias 561-580 (5)-TAT CGT GGG GCA GAT TTC AC-(3). Mediante amplificación por PCR usando TE3 y TE4 tendrá como resultado un producto 270 bp PCR, recocido interna de los sitios de TE1 y TE2. El uso de la semi-anidada par de primers (TE1 y TE4), el ensayo de PCR dará lugar a la amplificación de un 490-bp semi-nested PCR producto. El par de semi-nested primers (TE3 y TE2) se espera para producir un 590-bp semi-nested PCR producto. Detalles de diseño, incluidos los cebos posición de los nucleótidos, las secuencias de nucleótidos, y se espera productos de PCR se muestran en la (Tabla 1].

Todos los primers fueron sintetizados en un sintetizador de ADN (Milliigen / Biosearch, una división de Millipore Burlington, MA) y purificado utilizando oligo-pak oligonucleótido de depuración de las columnas (Glen Research Corporation, Sterling, VA.) Según las instrucciones del fabricante.

Reacción en cadena de polimerasa (PCR)

Un balance solución tamponada que contiene 250 μ l 10 × PCR buffer, 100 μ l de cloruro de magnesio, 12,5 μ l de cada dATP, dTTP, dGTP y dCTP fue preparado en tubo eppendorf de 1,5 ml. Los primers se usa a una concentración de 20 pg / μ l, el doble de agua destilada y se añadió al señalar que el volumen de existencias de la solución tampón de 1,5 ml. Dos μ l de los cebos, 5,0 μ l de la meta de ADN y 42 μ l de la solución madre se añadieron 0,5 ml en tubos de PCR y mezclado por vortexing. Una μ l de Taq ADN polimerasa (Perkin Elmer) se usa a una concentración de 5,0 U / μ l. Todas las reacciones de amplificación de PCR se realizaron en un volumen final de 50 μ l. Los ciclos térmicos fueron los siguientes perfiles: una inicial de 2 min de incubación a 95 ° C, seguido por 40 ciclos de 95 ° C durante 1 min, 55 º C por 30 seg y 72 ° C durante 45 segundos, y una incubación final a 72 ° por 10 min. Thermal perfiles se realizaron en un Techne atención primaria de la salud-2 termociclador (Techne, de Princeton, NJ.). Tras la amplificación, 15 μ l de cada producto de amplificación de PCR que contiene se cargaron en geles de agarosa 1,0% SeaKem (FMC Bioproduct, Rockland ME) y electrophoresed. Los geles fueron teñidos con bromuro de etidio y T. Evansi primaria de los productos de PCR se puede identificar fácilmente después de la visualización a la luz ultravioleta.

Nested polymerase chain reaction (nPCR)

Para la amplificación de PCR anidada, 2,0 μ l de la amplificación de los productos primarios producidos por TE1 y TE2 fueron trasladados a 0,5 ml PCR tubo que contiene (2 μ l anidados de los cebos y el 42 μ l de buffer de valores de PCR y de ADN polimerasa Taq fue utilizado en una concentración de 5,0 U / μ l. El par de cebadores anidados (TE3 y TE4) se espera ampliar un producto 270 bp PCR, recocido interna de los sitios de primers PSL1 y PSR2. Todas las amplificaciones de PCR se realizaron en un volumen final de 50 μ l. Los ciclos térmicos perfiles fueron los siguientes: a 2 min de incubación a 95 ° C, seguido por 30 ciclos de 94 ° C durante 1 min, 55 º C por 30 seg y 72 ° C durante 45 segundos, y una incubación final a 72 ° C durante 10 min. Térmica perfiles se realizaron en un Techne atención primaria de la salud-2 termociclador (Techne, de Princeton, NJ).. Después de la amplificación, 15 μ l de cada una de PCR que contienen los productos amplificados se cargaron en geles de agarosa 1,5% SeaKem (FMC Bioproduct, Rockland ME) y electrophoresed. Los geles fueron teñidos con bromuro de etidio y la PCR anidada productos eran fácilmente identificados siguientes visualización a la luz ultravioleta.

Conflicto de intereses

Los autores declaran que no tienen intereses en conflicto.

Contribuciones de los autores

AAM diseñó el estudio y preparó el manuscrito. AIE realizó el trabajo experimental y optimizado la reacción en cadena de polimerasa anidada basada en la detección de ensayo.

Agradecimientos

Los autores agradecen el apoyo financiero del Ministerio de Ciencia y Tecnología (MOST) y el Sudán y Meteorología Standard Organization (SSMO). También damos las gracias a M. Abdalla Fadl Elmoula de asistencia técnica.