Genetic Vaccines and Therapy, 2006; 4: 3-3 (más artículos en esta revista)

Inducción de revertant fibras en el ratón mdx utilizando oligonucleótidos antisentido

BioMed Central
Abbie M Fall (afall@cyllene.uwa.edu.au) [1], Russell Johnsen (rjohnsen@cyllene.uwa.edu.au) [1], Kaite Honeyman (khoney@cyllene.uwa.edu.au) [1 ], Pat Iversen (piversen@avibio.com) [2], Susan Fletcher (sfletch@cyllene.uwa.edu.au) [1], Stephen D Wilton (swilton@cyllene.uwa.edu.au) [1]
[1] Experimental Molecular Medicine Group, Centre for Neuromuscular and Neurological Disorders, University of Western Australia, Nedlands, Perth, 6009, Western Australia
[2] AVI BioPharma, Corvallis, Oregon, EE.UU.

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Resumen
Antecedentes

Distrofia muscular de Duchenne es una enfermedad genética mortal causada por mutaciones gen de la distrofina que se traducen en la terminación prematura de la traducción y la ausencia de la proteína funcional. A pesar de la lesión primaria gen de la distrofina, inmunoticción estudios han demostrado que al menos el 50% de los pacientes con DMD, ratones mdx y un modelo canino de DMD tienen raras distrofina-positiva o "revertant" fibras. Bellas epítopo cartografía ha demostrado que la mayoría de los responsables de las transcripciones revertant fibras excluir diversos exones, una de las cuales incluye la distrofina mutación.

Métodos

El ratón mdx modelo de la distrofia muscular tiene una tontería mutación en el exón 23 del gen de la distrofina. Hemos demostrado que los oligonucleótidos antisentido (AO) puede inducir la remoción de este exón, lo que da un marco en el ARNm transcripción de codificación corta pero funcional de la proteína distrofina. Para emular una combinación exonic asociados con revertant fibras, varios exones objetivo de la eliminación por la aplicación de un grupo de AO combinados como un "cóctel".

Resultados

Exones 19-25 fueron sistemáticamente excluidos del gen de la distrofina transcripción utilizando un cóctel de AO. Esto corresponde a una transcripción de genes transformados alternativamente, que se ha detectado en forma esporádica sin tratar ratón distrófico muscular, y se presume que se dé lugar a una isoforma revertant distrofina. La transcripción y la consiguiente menor proteína correctamente localizada fueron confirmados por RT-PCR, inmunohistoquímica y occidental blot.

Conclusión

Este trabajo demuestra la viabilidad de AO cócteles a by-pass distrofina mutación múltiples hotspots a través de la omisión de exón. Multi-la omisión de exón podría ser importante en la aceleración de la omisión de exón una terapia para tratar la DMD, de modo que la misma AO formulaciones pueden aplicarse a diferentes mutaciones en determinados dominios del gen de la distrofina.

Antecedentes

Distrofia muscular de Duchenne (DMD), el más conocido de los nueve tipos principales de la distrofia muscular, es una grave enfermedad de emaciación muscular-que surge de mutaciones en el gen de la distrofina (Xp21.2) (examen [1, 2]]. Distrofina proporciona apoyo estructural a la fibra muscular, y sin esta proteína y su proteína asociada a complejos, membrana de la célula se convierte en peligro la estabilidad, llevando a la degeneración de las fibras musculares [3]. La importancia de distrofina se demuestra en la patología aguda resultante de la ausencia de una proteína funcional [4, 5].

El análisis inmunohistoquímico de las secciones del músculo distrófico utilizando anticuerpos anti-distrofina revela único o grupos de distrofina-positivas fibras llamado revertant fibras [6, 7]. Revertant fibras se observaron en al menos el 50% de los pacientes con DMD [8, 9], con la incidencia en los pacientes de los músculos que van desde 0-70% [8 - 11] y en general menos del 1% de las fibras musculares en el ratón mdx [ 6, 12]. Revertant fibras tienden a aumentar con la edad en la frecuencia [6, 13], en tanto humanos como modelos animales de DMD, lo cual indica un posible ventaja selectiva sobre las fibras de distrofina negativo.

Revertant fibras, observada en los pacientes DMD [9], mdx mouse [6] y Golden Retriever Distrofia Muscular (GRMD) músculo [14], surgen de algunos de origen natural, donde el mecanismo de empalme de la maquinaria se ha redireccionado a los by-pass que causan enfermedades Mutación y un número variable de acompañamiento exones. Estas fibras revertant no obtener una respuesta inmune y, por tanto, representan el potencial de las plantillas orgánicas distrofinas. Estudios por Lu et al [15] indica que, aunque una variedad de combinaciones de la omisión de exón participaron en la aprobación-por el absurdo mdx mutación, el gen parece estructuralmente intacto en la mayoría de los revertant fibras. Antibody epítopo mapeo reveló que la pérdida de 20 o más exones se encontró en> 65% de fibras revertant [15]. Dos de los más cortos más comúnmente transcripciones detectado por RT-PCR surgió del empalme del exón 18 a 35 y el exón 13 a 48 [15].

El ratón mdx tiene un disparate mutación en el exón 23 del gen de la distrofina [16] y ha sido utilizado como modelo animal de distrofina mutaciones y la distrofia muscular. Este modelo tiene, y sigue mejorando nuestra comprensión de la función normal de la distrofina y dystrophinopathy, así como para ayudar en el desarrollo de terapias potenciales. Una alternativa a la sustitución o reparación de los defectos gen de la distrofina es modificar su expresión mediante la aplicación de oligonucleótidos antisentido (AO) de alterar la validez de mRNA de empalme [17 - 19] a fin de producir una proteína funcional. En los últimos años, AO han demostrado ser un instrumento eficaz para alterar la validez de la distrofina en ARNm empalme ratón mdx [18 - 21] y de las líneas celulares humanas [22].

En lugar de la reorientación de la orientación de empalme por uno o dos exones a by-pass cada distrofina mutación, puede ser más eficaz para inducir la omisión de exón múltiples para emular el mecanismo resultante en revertant fibras. Eliminación de varios exones e intrones del pre-ARN mensajero también permitiría a un cóctel de AO para tratar una variedad de mutaciones agrupadas dentro de un objetivo región. Además, en la hipótesis de que las fibras de origen natural tienen algunas revertant selectiva ventaja en la supervivencia durante los vecinos distróficos y células no parecen inducir una respuesta inmune, de origen natural revertant la proteína distrofina puede ser más funcional que la que produce la exclusión de un solo exón .

En el presente trabajo se describen las in vitro de evaluación y optimización de un AO cóctel diseñado para eliminar los exones 19-25, primero utilizando 2'-O-metil phosphorothioate (2OMe) AO y posteriormente phosphorodiamidite morpholino oligonucleótidos (OGP), para inducir múltiples distrofina exón Saltar en el ratón mdx.

Métodos
Animales

Todos los procedimientos fueron aprobados por el Comité de Ética Experimentación Animal (Aprobación ID 4/100/373). Normal control C57BL/10ScSn (C57) y de ratones mutantes C57BL/10ScSn- (Dmd mdx mdx) () Los animales fueron alojados en jaulas, en salas de temperatura controlada (22 º C) con una humedad de 50% y una luz 12:12 Horas - Oscuro ciclo. Los ratones se obtuvieron del Centro de Recursos Animales (CRA), Murdoch, Australia Occidental.

La amplificación del gen de la distrofina procesados alternativamente transcripciones

Superíndice III de un tubo de RT-PCR se utilizó con ~ 50 ng de RNA como plantilla total, en un 12,5 μ l de reacción, mediante la cartilla establece exterior. 1 μ l de solución de RT-PCR se utilizó en una secundaria de PCR anidado utilizando AmpliTaq Gold (Applied Biosystems Inc, de California). Nested PCR se utilizó a lo largo y primer secuencias se muestran en la Tabla 1.

Diseño y síntesis de oligonucleótidos antisentido

2'-O-metil phosphorothioate AO se prepararon en un Acelere 8909 de Ácido Nucleico sintetizador (Applied Biosystems Inc), tal como se describe anteriormente [23]. La OGP han sido facilitadas por AVI BioPharma (Corvallis, Oregon). Con el fin de facilitar una comparación directa entre el PMO y 2OMe químicos, tanto AO químicos eran de la misma secuencia con la nomenclatura basada en la descrita en [19]. Detalles de AO secuencias se muestran en la Tabla 2.

Cultivo de células y transfección

H-2Kb-tsA58 (H-2K) mdx [24] mioblastos se cultivaron tal y como se describe anteriormente [18]. En resumen, cuando el 60-80% confluente, H-2K myoblast culturas fueron tratados con tripsina (Life Technologies) y de semilla en una densidad de 2 × 10 4 por 24 y así en los platos, previamente tratados con 50 μ g / ml de poli-D - Lisina (Sigma) y 100 μ g / ml Matrigel (Becton Dickinson). Culturas fueron inducidas a diferenciarse a myotubes 24 horas antes de la transfección de incubación a 37 ° C, 5% de CO 2 en MEDM conteniendo 5% de suero de caballo. 2OMe AO cócteles complejos con Lipofectin (Life Technologies) en la proporción de 2:1 lipofectin: AO y empleados en un volumen final de la transfección de 500 μ l / y de una placa de 24-así como por las instrucciones del fabricante, con excepción de que la solución era No eliminados después de 3 horas. Morpholino cócteles se entregaron uncomplexed en solución salina normal, en las concentraciones especificadas, en un volumen final de la transfección de 500 μ l /.

Bandstab directa y secuenciación del ADN

PCR productos de interés fueron aisladas en gel de agarosa y re-uso de la amplificación de bandstab técnica descrita anteriormente [25]. Una pipeta de punta fue utilizado para apuñalar a la deseada banda que se visualizan sobre una Transiluminador con luz UV después de la tinción en bromuro ethidum. Esta fue utilizada para inocular una reacción de PCR y otro 25 ciclos de amplificación se realizaron en condiciones idénticas a la anterior PCR secundaria, excepto que la temperatura se redujo en un 5 ° C. El volver a los productos amplificados se purificaron utilizando columnas spin (MoBio) según las instrucciones del fabricante. Secuenciación directa se ha realizado mediante el prisma Big Dye terminator-química (V3.1) y un secuenciador de ADN 377A (Applied Biosystems Inc).

AO inyección intramuscular y preparación de tejidos

Igual cantidad de cada PMO se combinaron en solución salina normal para preparar las dosis de 2 y 10 μ g por 15 μ l de inyección. Un músculo tibialis anterior de cada ratón mdx se inyectó con 15 μ l de la AO preparación, la contra-lateral del músculo se inyectó con un volumen igual de solución salina. Dos grupos de edad fueron tratados, 11 días (cachorros) y 16 semanas (adultos) y los animales fueron sacrificados a los 2, 4 y 8 semanas después de la inyección (n = 4). Los músculos fueron removidos y congelado en el iso-pentano enfriado en nitrógeno líquido, antes de ser preparado para cryosectioned y ARN, las proteínas y los estudios de inmunofluorescencia.

Distrofina inmuno-fluorescencia

Distrofina se detectó en 6 μ m no fijadas criostato secciones usando el Novacastra NCL-DYS2 anticuerpo monoclonal que reacciona con el C-terminal de la distrofina. Inmunofluorescencia se realizó a través de Zenon Alexa Fluor 488 etiquetado kit (Invitrogen), según el protocolo del fabricante con modificaciones menores. El primer paso que se omitió la fijación y el principal anticuerpo se utilizó en una dilución de 1:10 con un molar ratio de 4.5:1 [23]. Las secciones se han visitado con un 70 Olympus IX microscopio invertido y las imágenes fueron capturados en una Olympus DP 70 cámara digital.

ARN preparación, el análisis RT-PCR y Western Blot

ARN fue extraído a partir de 2-4 mg de tejido congelado cryosections de bloques, usando Trizol (Invitrogen), según el protocolo del fabricante. RT-PCR y secundaria de amplificación se realizaron a través de distrofina exones 18-26, 13-35 y 13-50 utilización de los cebos se detalla en la Tabla 1. Los productos fueron fraccionados en geles de agarosa al 2%, teñido con bromuro de etidio y las imágenes fueron capturadas por un Chemi-Smart 3000 gel sistema de documentación (Vilber Lourmat, Marne La Vallee).

Proteína extractos fueron preparados por la adición de 120 μ l de tratamiento de amortiguación (125 mM Tris / HCl pH 6,8, SDS 4%, el 40% de glicerol, 0,5 mM PMSF, 50 mM dithiothreitol, azul de bromofenol (Sigma) y el inhibidor de la proteasa cóctel) por 4 mg mdx Ratón músculo criostato secciones. Las muestras fueron brevemente vortex, sonicated durante 2 segundos 4-8 veces y se calienta a 95 ° C durante 5 minutos, antes de ser fraccionada a los 16 ° C en un 3-10% SDS gel de gradiente a pH 8,8 con un 3% de gel de apilamiento a pH 6,8. Cinco o 10 μ l de los extractos de C57 y 55 μ l de extracto de músculo mdx tratados se añadió a cada pocillo. Las proteínas se transfirieron del gel a Hybond nitrocelulosa (Amersham Biosciences, Castle Hill) la noche a la mañana a los 18 ° C, a 290 mA. Distrofina fue visualizado utilizando NCL-DYS2 monoclonal anti-distrofina (Novacastra, Newcastle-upon-Tyne, Reino Unido) a una dilución de 1:100 por 2 horas a temperatura ambiente, con la posterior detección mediante la detección de proteínas Occidental Breeze kit (Invitrogen). Las imágenes fueron capturadas por un Chemi-Smart 3000 gel sistema de documentación utilizando Chemi-Capt software para la adquisición de imágenes y Bio-1D de software de análisis de imágenes (Vilber Lourmat) [23]. Uno de los músculos mdx extracto se mezclan con 10 μ l de C57 proteína distrofina normal para permitir la detección de la presencia de la proteína del ratón mdx.

Resultados
Revertant fibra natural transcripciones

La aparición de las fibras revertant es incoherente y poco frecuente y se produce en el tejido distrófico como las fibras, ya sea sola o en pequeños grupos de fibras, después de observar el análisis inmunohistoquímico de los músculos mdx no tratados secciones (Figura 1A]. El diámetro de las fibras musculares en el músculo esquelético mdx es menos uniforme que en los normales (C57BLl/10ScSn) músculo (datos no presentados). Figura 1B-D indica la exonic combinaciones que representan alternativamente procesados distrofina transcripciones detectada en ratones normales y mdx muscular después de RT-PCR de amplificación de los exones 13-35 (Cuadro 1 primer conjunto 3). Más de 100 in vitro e in vivo de las muestras fueron objeto de este ensayo de RT-PCR, con sólo trece diferentes empalmados alternativamente transcripciones identificados, y 3 en representación de todos, pero en el marco de mRNAs. Seis de los trece transcripciones encontrados, señalan con un asterisco en la Figura 1A, se ha informado anteriormente [15, 26].

Desarrollo de la AO 2OMe inducir a saltar de los exones 19-25

A pesar de la evidente orientación de donantes y aceptor de cada uno de los sitios de empalme exones, el exón coherente inducción de la exclusión no está garantizado. Intra-exonic splicing potenciador (ESE) los motivos fueron el objetivo y algunos de estos resultaron ser susceptibles de reorientación de empalme. La probabilidad de éxito de la orientación después de la omisión de exón cualquier ESE región aumentó cuando más de una serina / ricos en arginina (AR) vinculante sitio fue cubierto por la AO. ESE buscador Release 2,0 [27] se utilizó para predecir los posibles sitios de unión. ESE buscador es un programa basado en humanos, y dado que se reconoce que hay diferencias entre el empalme humanos y de ratón, el programa fue utilizado sólo como guía. Varios AO fueron evaluadas individualmente para cada exón antes de seleccionar los compuestos que figuran en el cuadro 2. Todos AO figuran en el cuadro 2 inducida por saltar de la orientados único exón en diversos grados (Figura 2]. Exones 20 y 24 fueron más difíciles de eliminar de los ARNm maduros que otros, y la consecuente eliminación no se logró con un solo AO (datos no presentados). Sin embargo, cuando dos aparentemente ineficaz AO se utiliza en combinación, firme y coherente el exón 20 y 24 se produjeron saltos (Figura 2].

AO perfeccionamiento y optimización de múltiples omisión de exón es claramente influenciada por la composición de los componentes individuales. Dos diferentes AO orientación exón 23 fueron evaluados durante la optimización de los 19-25 cóctel. Individualmente, tanto AO inducido igualmente altos niveles de exón 23 saltos (Figura 2], pero cuando se combinan en cócteles, diferentes eficiencias fueron observados constantemente (Figura 3]. La inclusión de los 20 mer M23D (2-18) en el cóctel, no dio lugar a múltiples reproducible exón remoción (Figura 3a], mientras que la inclusión de los 25 mer, M23D (7-18) en la mezcla AO, Inducida coherente saltos de más de un rango de concentraciones (Figura 3b]. Este patrón de exón transfección resultantes de la eliminación de los dos cócteles diferentes AO fue altamente reproducible y la AO cóctel que contiene M23D (07-18) fue utilizado para posteriores estudios.

Evaluación de la 2OMe 19-25 cóctel

Amplificación a través de los exones 18 al 26 generó una longitud completa de productos de 1357 bp que era visible sólo en el tratamiento de muestras en AO cóctel transfección concentraciones de 5 y 10 nM y en el control sin tratar (Figura 4]. En la mayoría de las muestras tratadas en toda su extensión amplificación faltaba. Productos en representación de las transcripciones que faltan otras combinaciones de los exones se observaron y su identidad fue determinada por la secuencia de ADN (Figura 4].

Estudios de la titulación 2OMe 19-25 AO cóctel mostró coherente inducida por la omisión de exón después de transfección con un total AO concentración de 200 nM, (aproximadamente 20nM de cada AO) (Figura 4a]. Sin embargo, diferentes culturas myoblast mdx (ambos H2K-mdx mdx mioblastos y primaria) demuestra variable de respuesta a las AO cóctel. Densidades de células se mantuvieron coherentes, pero el exón 19-25 saltar podría ser inducida a bajas concentraciones de transfección en algunos experimentos donde revertant transcripciones fueron detectados en las células no tratadas (Figura 4b]. En general, cuando ocurren naturalmente revertant transcripciones fueron detectados en las muestras no tratadas, inducible exón 19-25 saltar se observó después de la aplicación de un cóctel AO, en concentraciones inferiores a 200 nM. Esta tendencia es común a ambos condicional inmortalizada de células y células primarias mdx.

La duración de la omisión de exón, después de una única in vitro se evaluó la ejecución de AO. El cóctel de orientación 2OMe AO exones 19-25 inducida sostenido y fuerte saltos de hasta 5 días después de transfección. Sin embargo, fue importante la muerte de las células causados por el reactivo de transfección (Lipofectin) y los resultados no son consistentes después de los cinco días de tiempo punto (datos no presentados).

La AO secuencias utilizadas en el cóctel 2OMe fueron re-PMO compuestos sintetizados como para comparar la eficacia de esos químicos. Las proporciones de cada uno de los compuestos son los mismos para ambos químicos, sin embargo el PMO transfectadas cóctel fue sustancialmente mayor en la concentración debido a la mala absorción de estos compuestos in vitro descargadas. La RT-PCR producto que representa la omisión de exón es detectable a niveles bajos (después de 7 días) transfección en concentraciones superiores a 5 μ M (datos no presentados). Subsiguientes inyecciones intramusculares de la AO cóctel en el ratón mdx fueron realizados utilizando sólo el PMO química como nos informó recientemente de que OGP cuentan con importantes ventajas sobre los 2OMe química in vivo [23].

Estudios in vivo

Total RNA, extraído de ratones mdx músculo secciones (2-3 mg) a los 2, 4 y 8 semanas después de una única inyección intramuscular de 2 o 10 μ g de la PMO cóctel, se analizó por RT-PCR anidada a través de la amplificación distrofina exones 18 -- 26 (Cuadro 1 primer set 1). En representación de los productos de amplificación acortado transcripción desaparecidos exones 19-25 se observaron en todas las muestras de los músculos inyectados con 10 μ g de la PMO cóctel. Muscular de los ratones inyectados en 11 días o 16 semanas de edad que figura la transcripción acortado a las 2 y 4 semanas después de una única inyección (Figura 5a]. A más eficiente conjunto de los primers interior fue utilizado para amplificar una completa transcripción longitud de 1250 pb, con la transcripción inducida representada por un producto de 110 bp. La espera 110 bp producto no se detectó en ningún músculo inyectado sólo con la dosis de 2 μ g aun cuando había cortes de tejido teñido positivo para distrofina (datos no presentados). Tinción inmunohistoquímica con NCL-Dys2 confirmó que la inyección de 10 μ g de la PMO 19-25 cóctel inducida generalizada distrofina expresión a los 2, 4 y 8 semanas después de la inyección en los cachorros y adultos ratones mdx (Figura 5b]. Distrofina apareció expresión máxima a las 4 semanas después del tratamiento. Distrofina tinción fue localizado a lo largo de la aguja en la pista de las secciones de los cachorros, mientras que la distrofina en la tinción de edad ratones mdx fue irregular, y las más generalizadas. Distrofina inmunoticción no parece diferir sustancialmente con la edad del animal. Immunofluorescent tinción patrones son similares a los observados con la eliminación de la única exón 23 [23]. RT-PCR (Figura 5a] mostró la supresión de varios exones con pequeñas trazas en representación de los productos de procesado como alternativa transcripciones.

En consonancia con la observación de que the19-25 fue el principal transcripción inducida distrofina ARNm, el Western Blot de extractos de los tratados muscular demostró un leve banda de la proteína inducida en las muestras de ratones adultos y cachorros de 4 semanas de tratamiento (Figura 5c]. La distrofina detectados en los músculos inyectados con el 19-25 cóctel parece ser de menor peso molecular que la C57BL/10ScSn y el exón 23 suprimido productos. Para confirmar que la aparente diferencia en el peso molecular no es un artefacto de la carga de proteínas, 15% de proteína muscular normal extracto se mezcla con 85% de proteína cruda mdx muscular en la carga de amortiguación. Los niveles de proteína eran demasiado bajas para ser detectadas en 2 o de 8 semanas, a pesar de la distrofina fue observado por immunofluorescent tinción de secciones musculares.

Inducida revertant fibras

Para determinar si otros múltiples saltos hechos ocurrieron como consecuencia del tratamiento con cócteles AO, de largo alcance a través de RT-PCR exones 13-50 se realizó en las muestras tratadas y no tratadas de ambos cachorros y adultos ratones mdx en la semana 2 y 4 puntos del tiempo ( Figura 6]. La frecuencia de revertant transcripciones parece ser mayor en los tratados con PMO cóctel muestras que en farsa-músculo inyectado. Sólo una de las 4 muestras no tratadas contiene una forma natural en el marco revertant transcripción desaparecidos exones 20-49, mientras que los ocho de las muestras tratadas figuran las transcripciones adicionales más corto. La transcripción saltar exones 20-49 se encuentra también en una de las muestras tratadas PMO cóctel, con la mayoría de las inducidas acortado transcripciones que se encuentran en situación-marco (Figura 6]. Ya sea debido a su tamaño, la calidad de la ARN, o la eficiencia de la síntesis de ADNc y de amplificación, la longitud completa de productos de 5720 bp no fue generada por este ensayo y la reacción fue sesgado en favor de la alternativa más corta de amplificación de los productos transformados.

Discusión

Un estudio de la DMO gen de la distrofina reordenamientos que se traducen en una alteración funcional de la proteína, pero en parte, se identifica fácilmente prescindibles dentro de los dominios de la proteína distrofina [28]. Hay muchos casos asintomáticos de la DMO, donde los pacientes sólo han sido diagnosticados tardíamente en la vida. Inglaterra et al [29] informaron de una DMO caso identificado a los 60 años de edad, con una deleción de los exones 17-48 que abarca el 46% de los genes. El marco de lectura propuesto por el artículo Mónaco et al [4, 5] es válido para más del 90% de distrofina mutaciones. Sin embargo, hay excepciones y se ha informado de que en el marco de las supresiones superior a 36 exones están generalmente asociados con una grave fenotipo clínico [30 - 32]. Sin embargo, otros informes de leves, aunque variable con fenotipos en el marco de grandes supresiones, implicar la pérdida de hasta el 66% del gen de la distrofina [33]. Parece que la mayoría de los exones de codificación de barras de dominio pueden ser borrados sin pérdida sustancial de la función. La pérdida de un solo exón de que cualquiera de los códigos de dominio crucial vinculante o interrumpe el marco de lectura tendrá consecuencias catastróficas en función de la distrofina [29, 33, 34]. AO deben ser diseñados y optimizados para eliminar el exón que contiene la mutación, y / o en torno a los exones, para restaurar o mantener el marco de lectura. Si bien la DMD y la mayoría de los pacientes carecen de la DMO de larga duración distrofina, la más breve expresión de distrofina isoformas (Dp260, Dp140, Dp116 y Dp71) ocurre en diferentes muscular y no tejidos musculares, con variaciones entre pacientes dependiendo de la posición de la lesión primaria en El gen de la distrofina [35].

El objetivo de la omisión de exón múltiples es inducir una previamente identificados, de origen natural revertant distrofina transcripción [26]. Revertant fibras surgen de la omisión de exón eventos espontáneos que se producen en niveles bajos en ambos normal y distrófico muscular [17]. Hemos centrado en la identificación de la fibra revertant transcripciones entre los exones 13 y 35 (~ 29% del gen de la distrofina) en el modelo de ratón mdx. Se ha propuesto que la distrofina en revertant fibras empalmados alternativamente surge de las transcripciones que falta tanto el exón mutado y un número variable de exones adyacentes [15, 36]. Empalme es un proceso muy complejo, con muchos elementos cis y trans contribuyen a la selección de, y la eficacia con que se reconocen los sitios de empalme y los exones se unen durante el pre-procesamiento de mRNA. La fuerza de los 3 'y 5' sitios de empalme, sucursal punto secuencias, exonic splicing enhancers y silenciadores, el exón longitud, la estructura secundaria y todos juegan un papel en la pre-mRNA de procesamiento [37 - 40]. Splicing alternativo ahora se ha reconocido como un importante mecanismo para la generación de la diversidad de proteínas en eucariotas superiores [41]. Splicing alternativo que se producen de forma natural en el gen de la distrofina transcripción, pero el papel de muchas isoformas aún no se ha dilucidado [42].

Parece que revertant fibras surgen de algunos mecanismo de splicing alternativo, como lo demuestra la presencia de las isoformas de distrofina más corta, sin embargo la baja frecuencia sugeriría algún error en el empalme, cuando un evento localizado dentro de las fibras de rescates distrofina expresión. Aunque muy pocos en número a ser de cualquier beneficio terapéutico, la presencia y persistencia de estas fibras distrofina positivo implica que no se trate de obtener una respuesta inmunitaria.

El concepto de un cambio localizado en el empalme de la maquinaria en general o de una alteración de la relación que conduzca a proteínas SR splicing alternativo que pasa por el gen de la distrofina lesión parece poco probable. Es tentador especular que tal vez algunos novela microRNA se expresa en la revertant fibras, dando lugar a la omisión de exón naturales en una sola célula, con racimos de distrofina fibras positivas sugiriendo un origen clonal. MicroRNAs han estado implicados en una variedad de células de los procesos, incluyendo la apoptosis, la traducción andsplicing [43, 44]. Independientemente del mecanismo utilizado para inducir revertant distrofina, es posible que la adición de AO es de alguna manera el aumento de la producción o acción de algunos microRNAs.

Sustancial optimización se realizó en el montaje de la AO cóctel, con un número de AO evaluados antes de seleccionar la combinación se muestra en el Cuadro 2. Aunque no existía un pre-mRNA motivo de que podría ser objeto de inducir fiable y sostenido de la omisión de exón, en general ya AO resultaron ser más eficaz [45]. Distrofina el exón 19 del ratón se ha estudiado previamente y puede considerarse un exón fácil eliminar de la distrofina ARNm [46]. Diez AO dirigidas a la aceptor, ESE y de los donantes todos los sitios de empalme inducida exón 19 saltos. En contraste exones 20 y 24 resultó mucho más difícil de desplazar el ARNm maduro. Cinco AO estaban dirigidas a exón 20, y seis en el exón 24. Individualmente, estos AO ha demostrado ser ineficaz para inducir saltar de la meta exón, pero las combinaciones descritas aquí son más eficaces. Se podría especular que esto indica algunos exones tienen múltiples motivos necesarios para el exón reconocimiento por parte de la maquinaria de empalme y más de un objetivo debe ser enmascarado para reorientar empalme. En estos casos, puede ser necesario aplicar múltiples AO a un solo exón objetivo de la escisión ARNm.

La AO evaluados para el exón 23 destitución demostrado ser crucial para el cóctel 19-25. Individualmente ambos AO, M23D (02-18) y M23D (07-18), eliminado el exón 23, pero la 25mer fue el más eficaz de los dos AO. Se observó que una sola AO podría influir en la eficiencia de la AO cóctel con respecto a la omisión de exón múltiples. Con el fin de inducir el exón 19-25 saltar con el AO cóctel que contiene M23D (02-18), es necesario ajustar los coeficientes de cada AO en la mezcla (datos no presentados). Sin embargo, si la igualdad de todos los importes molar AO se utilizaron entonces el M23D (02-18) cóctel no fiable inducir exón 19-25 saltar. Tras la inclusión de M23D (07-18) en la mezcla, coherentes y fiables múltiples omisión de exón se indujo (Figura 3]. Además de la optimización de todos los demás AO en la mezcla podrían realizarse, pero desde consecuente generación de la transcripción deseado se logró, se decidió llevar a cabo posteriores in vitro e in vivo, los experimentos con el cóctel que contiene M23D (07-18).

Administración de la AO cóctel que contiene M23D (07-18) parece aumentar la incidencia de la distrofina revertant transcripciones en mdx myogenic células y tejidos. ARN extraído de los músculos tratados y no tratados fue objeto de RT-PCR a través de los exones 13-50. Cada muestra se había tratado una o más procesados alternativamente transcripciones gen de la distrofina, mientras que los productos más cortos eran poco frecuentes en las muestras no tratadas.

Las sutiles variaciones en la banda de proteína de migración observado en la zona occidental blot (Figura 5c], indica el tamaño de las diferencias entre la duración normal de distrofina (427 kD), el exón 23 suprimido (420 kD) y la eliminación de los exones 19-25 (389 kD). El concepto de múltiples transcripciones es coherente con la observación de "fuzzy" Western-Blots sobre bandas de músculo que se trata fraccionado específicamente para aumentar la resolución y el tamaño de la diferenciación. La omisión de exón múltiples eventos que pueden ocurrir en muchas posiciones en el gen de la distrofina mdx transcripción y todavía pasa por la mutación sin sentido.

Recientemente hemos demostrado que la OGP son más eficaces que 2OMe AO inducir a saltar en el exón 23 del gen de la distrofina transcripción [23]. OGP exposición muy baja toxicidad en células tratadas [47] y se ha informado al mínimo no antisentido efectos [48]. Inyecciones intramusculares de OGP no produjo reacciones adversas evidentes en o alrededor del sitio de la inyección (datos no presentados). RT-PCR, inmunohistoquímica y occidental blot confirmó que todos los inducidos de saltar exones 19-25 fue mucho más eficaz in vivo con OGP que con 2OMe AO (datos no presentados).

Distrofina estaba todavía detectables 8 semanas después de una única inyección intramuscular de la PMO cóctel en 11 días de edad y 16 cachorros semana de ratones adultos, aunque las diferencias en los patrones de inmunoticción eran evidentes. El patrón de tinción de distrofina en los cachorros parecían fuertemente localizada en el lugar de inyección y consistentemente positiva, mientras que el patrón en ratones adultos es más irregular y generalizada. Esto puede haber sido debido a la cantidad de degeneración: la regeneración que se han producido en los ratones mdx adultos, y al hecho de que los cachorros se inyecta antes de la extensa necrosis que se produce en aproximadamente 18 días de edad [49].

En algunos casos, la supresión de un solo exón no sería suficiente para hacer frente a la mutación causante de enfermedad y un cóctel de dos o más AO serían necesarios para restaurar el marco de lectura. Por ejemplo, el sitio de empalme intrón 6 mutación en el GRMD canino modelo de DMD conduce a la omisión del exón 7, con un posterior cambio en el marco de la distrofina ARNm [50]. El mínimo cambio de restaurar el marco de lectura requiere de la eliminación de los exones 6 y 8 y fue informado recientemente por McClorey et al [51]. Del mismo modo, cualquier tontería mutación en los exones 6, 7 u 8 del gen de la distrofina humana que exigen la eliminación de todos los exones 3 by-pass a la mutación y aún mantener el marco de lectura. Por estas razones, la omisión de exón múltiples y de la aplicación de AO cócteles será un requisito absoluto para hacer frente a algunas mutaciones DMD

Conclusión

La eliminación de los exones 19-25 en el ratón mdx proporciona múltiples pruebas de que la omisión de exón es factible y que los grupos de mutaciones en el gen de la distrofina podría corregirse con un cóctel de AO. Una vez que un conjunto amplio de AO están diseñados teóricamente podrían beneficiarse más de 75% de todos los pacientes con DMD. Una de las principales limitaciones es el de obtener la aprobación normativa para el uso clínico de tantos diferentes compuestos [52, 53]. The cost of safety and toxicology testing alone could render exon-skipping a non-viable approach for all amenable dystrophin mutations, in particular, those defects occurring outside the recognised deletion hot-spots. AO cocktails to induce multiple exon skipping could significantly lower the number of preparations required to address clustered dystrophin mutations in different families [ 53 ].

Competing interests

The author(s) declare that they have no competing interests.

Contribuciones de los autores

AF carried out the molecular genetic studies, immunohistochemistry, participated in its design and coordination and helped to draft the study, RJ carried out the Western Blots, KH helped to draft the study, PI designed and supplied the PMOs, SF and SW conceived the study , participated in its design and coordination and manuscript preparation. All authors read and approved the final manuscript.

Agradecimientos

The authors would like to acknowledge funding from National Medical & Health Research Council of Australia (303216), National Institute of Health USA (RO1 NS044146–02), Muscular Dystrophy Association of USA (MDA3718), Parent Project Muscular Dystrophy USA, Medical and Health Research Infrastructure Fund of Western Australia and Aktion Benni and Co.