Filaria Journal, 2006; 5: 7-7 (más artículos en esta revista)

Localización de tejido de la colagenasa y leucina aminopeptidasa en las especies bovina filarial parásito Setaria cervi

BioMed Central
Daya R Pokharel (drpokharel@rediffmail.com) [1], Reeta Rai (reeta_rai@rediffmail.com) [1], Pankaj Kumar (pankuana@yahoo.com) [2], CM Chaturvedi () [cmcbhu@yahoo.com 2], Sushma Rathaur (surathaur@rediffmail.com) [1]
[1-221005, India
[2-221005, India

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Resumen
Antecedentes

Al igual que otros helmintos proteasas, filarial proteasas también se han mostrado a exigir para la supervivencia del parásito en el interior de la acogida y de mediar en los diversos procesos fisiológicos como la invasión de tejidos, alimentación, la embriogénesis y la evasión inmune del huésped. Muchas de estas proteasas han demostrado potencial de las vacunas y los agentes quimioterapéuticos filarial activa contra las infecciones. Setaria cervi es un parásito bovina filarial y sirve como un buen modelo para el parásito estudios en la filariasis linfática. Recientemente, un 175 kDa colagenasa y leucina aminopeptidasa (LAP) se han purificado y caracterizado de las especies bovina filarial parásito S. Cervi y demostrado que la vacuna candidata potencial de diagnóstico y marcador, respectivamente, para la filariasis linfática. Sin embargo, sus tejidos y localizaciones putativo papel en la biología de parásitos todavía no se han examinado y por lo tanto siguen siendo poco claras. Por lo tanto, el estudio actual de tratar de localizar y estudiar los papeles putativo de estas dos enzimas en el S. Cervi.

Métodos

El tejido de las distribuciones de 175 kDa colagenasa y leucina aminopeptidasa en S. Cervi fueron examinados por métodos histoquímicos e inmunohistoquímicos, respectivamente. Inmune sueros obtenidos de la jirds inmunizados con colagenasa sirvió como anticuerpo primario, de conejo anti-ratón IgG HRP-anticuerpo secundario conjugado como DAB y como sustrato para la inmunomarcación de la colagenasa. Leu NA-β se utilizó como sustrato para la tinción histoquímicas de LAP.

Resultados

Tanto la colagenasa y PAL estuvieron presentes en el cuerpo de pared, pero que difieren en su patrón de distribución en las distintas capas de la pared corporal. Colagenasa fue localizada principalmente en epicuticle, cutícula, y la hipodermis sincicial nervio cordón PAL región que se concentran más en epicuticle, capas musculares longitudinales y casi ausente o muy ligeramente manchadas sincicial en la hipodermis y nervio cordón región. Ambos colagenasa y PAL mostró sus distribuciones comunes en el intestino, útero y los huevos maduros, el aumento de embriones y mf. Muy fuerte inmunomarcación de la colagenasa en el exterior de la superficie corporal parásito indica su importante papel en la relación anfitrión-parásito que la presencia de LAP muscular en la región sugiere su papel en la remodelación tisular. La presencia de la colagenasa y LAP en el S. Cervi intestino, ovarios, útero, los huevos y mf sugieren que también tienen funciones de colaboración en la muda, la nutrición y la embriogénesis. Los datos obtenidos sobre sus caracterizaciones inmunológicos y su presencia en importantes órganos parásito dan firmes indicios de que son críticas para la supervivencia de filarial parásito y, por tanto, pueden ser buenos candidatos de vacunas y / o marcadores de diagnóstico para la filariasis linfática.

Conclusión

El manuscrito informes por primera vez, el tejido de la distribución de la colagenasa y PAL en las especies bovina filarial parásito S. Cervi putativo y debatir sus funciones in vivo. Nuestros resultados también abierta la posibilidad de examinar las funciones de estos dos proteasas in vivo, que se requieren más experimentos como utilizar sus sustratos naturales y / o inhibidores específicos en cada uno de los tejidos.

Antecedentes

Proteasas de las diversas clases de mecánica se ha identificado en diversos filarial y otros helmintos y codificación de los genes se han aislado y clonado. Estos parásitos proteasas son fundamentales para la existencia parasitaria en el interior del ambiente hostil de los anfitriones. Al lado de su general y el procesamiento de catabolismo proteico funciones, las proteasas se han considerado fundamentales para la alimentación de parásito, la evasión inmune del huésped, embriogénesis, de muda y de tejidos invasión [1 - 6]. Ellos han demostrado ser altamente inmunogénica y, por lo tanto explotados como serodiagnostic marcadores y muchos candidatos a la vacuna contra las infecciones por helmintos [7 - 9]. En comparación con sus homólogos de acogida; parásito proteasas tienen distintas propiedades estructurales y bioquímicos y celulares lugares. Esta heterogeneidad de las proteasas del parásito también ha abierto oportunidades para la quimioterapia contra muchas enfermedades parasitarias [10 - 12]. Así, el estudio de las propiedades bioquímicas y inmunológicas, las estructuras y las funciones de las proteasas del parásito in vivo es un paso esencial para la identificación y el desarrollo de los ideales y de los marcadores de diagnóstico, vacunas y fármacos metas para el control de las enfermedades parasitarias.

Setaria cervi es un parásito filarial búfalos de la India y se asemeja con Wuchereria bancrofti en su periodicidad nocturna y antigénica patrón. Al ser un parásito bovina, su uso como modelo el parásito no está restringido por el éticos y prácticos inherentes limitaciones asociadas a los seres humanos y, por lo tanto, servir como un buen modelo para los estudios de parásitos en la filariasis linfática. Recientemente, dos metalloproteases: a 175 kDa colagenasa y leucina aminopeptidasa (LAP), se han purificado y caracterizado de mujer adulta S. Cervi en autores de laboratorio. El S. Cervi colagenasa fue demostrado tener un importante papel en la evasión inmune del huésped y immunoprotection. Esta enzima específicamente cleaved IgG humanos in vitro y fue inhibida por los anticuerpos en contra de lo planteado en jirds. La enzima también mostró una alta reactividad cruzada con sueros de humanos supuestamente inmune filarial recogidos de las zonas endémicas [13, 14] y mostró similitud antigénica a Brugia malayi [inédito de observación]. Tanto in vitro de anticuerpos dependientes de la citotoxicidad mediada por células (ADCC) ensayo [15] y la vacuna contra el juicio llevado a cabo en contra jirds B. Malayi uso de la colagenasa purificada sugirió que sea una vacuna eficaz contra el candidato humanos filariasis linfática [inédito de observación].

El S. Cervi LAP ha sido caracterizada como un miembro de la familia de la M17 Zn que contienen metalloprotease. Esta enzima es inhibida por Zn-quelante inhibidor de 1, 10-phenanthroline y otros inhibidores de metalloprotease como EDTA, amastatin y bestatin, y mostraron muy alta preferencia hacia el sustrato para-nitroannilide leucina (Leu-pNA). La enzima purificada de los adultos del gusano de extracto soluble mostró una alta especificidad con microfilaremia sueros de individuos infectados por el W. Bancrofti [inédito de observación]. La observación más tarde ha indicado su uso potencial como marcador para el diagnóstico de la infección por filarial. Un ensayo con la vacuna contra LAP está actualmente en marcha y los resultados se aguardan. Vacunas con aminopeptidasa solo o en combinación con otras proteasas han dado muy alta protección contra la Fasciola hepatica y de las infecciones de Haemonchus contortus en ovinos [9, 16, 17]. Por lo tanto, cabe prever que S. Cervi PAL también se proporcionan suficiente protección contra el anfitrión B. Malayi infección en jirds.

Aunque bioquímicos e inmunológicos propiedades de la S. Cervi colagenasa y PAL han sido estudiados en detalle, sus localizaciones y las posibles funciones fisiológicas en el interior del parásito cuerpo todavía no se han examinado y por lo tanto siguen siendo poco claras. Por lo tanto, para hacer frente a los posibles roles en vivo de la colagenasa y PAL, sería útil para establecer su ubicación exacta en el parásito tejidos. Los informes sobre localización de los tejidos en la colagenasa filarial y otros helmintos parásitos son escasos. Sin embargo, la localización de los tejidos relacionados metallo-, cisteína y ácido proteasas se han llevado a cabo en diversas filarial [1, 3] y no filarial parásitos [18 - 20], y han mostrado su presencia principalmente en las microvellosidades intestinales, la cutícula, hipodermis, de ovario , Uterino, y la periferia de la cáscara del huevo y la creciente embriones. Por otra parte, se ha detectado PAL, purificado y caracterizado en muchos otros relacionados con parásitos, por ejemplo, en F. Hepatica [21], Ascaris suum [22 - 24], Schistosoma mansoni y S. Japonicum [25, 26]. En el caso de F. Hepatica, la enzima fue localizado en las células del epitelio intestinal de los adultos fasciolas [21]. Immunolocalisation estudios en S. Mansoni mostró que LAP, localizado en los gastrodermal células que rodean el lumen intestinal y de superficie tegumento y los huevos [25, 26].

En este estudio, por lo que investigó la localización de la colagenasa y PAL en la mujer adulta S. Cervi tejidos incluidos huevos y mf todavía presente en el gusano de ovarios y útero por IHC y tinción histoquímicas, respectivamente, y discutir sus funciones fisiológicas putativo parásito en el cuerpo.

Métodos
Filarial parásitos y preparación de tejidos

Adultos, S. móviles Cervi gusanos se adquirieron a partir de la peritoneal pliegues de los búfalos indios recién sacrificados. Ellos fueron traídos al laboratorio del matadero local en Kreb la solución de Ringer complementado con estreptomicina (100 μ g / ml), penicilina (100 μ g / ml), glutamina (2 mM) y la glucosa (1%). Worms se lavaron seis veces con PBS, que se dividen en dos grupos y picado en fragmentos cortos. El parásito de los tejidos destinados IHC de la colagenasa fueron fijadas en Bouin fijador durante 24 horas a temperatura ambiente e incluidos en parafina bloque hasta su uso. El siguiente grupo de parásitos picado destinadas para histoquímica de LAP fue fijado en formol-calcio a 4 ° C por 24 h, y embebidos en parafina de bloques hasta su uso.

Inmunohistoquímica (IHC) de la colagenasa

Secciones delgadas (5 μ m), de la parafina de los tejidos incrustados S. Cervi destinadas para IHC de la colagenasa se cortaron utilizando un micrótomo y la proliferación de más de 1% de gelatina revestidos diapositivas que fueron cubiertos con agua destilada y calentado a 55-60 ° C. La inmunohistoquímica se realizó tal como se describe en otro lugar [27]. En resumen, las secciones se deparaffinised con tres cambios de xileno y rehidratada clasificado a través de alcoholes y finalmente con agua. La actividad de peroxidasa endógena es inactivada por incubando estas secciones en el 3% de H 2 O 2 en metanol durante 30 minutos a temperatura ambiente. A continuación, las láminas fueron lavadas con tres cambios de PBS y las secciones fueron incubadas con un 2% de suero normal de conejo de bloqueo durante 1 h. El exceso de bloqueo suero fue arrojado fuera y las secciones fueron incubadas más la noche a 4 ° C con anticuerpos primarios obtenidos a partir de jirds (Meriones unguilatus) inmunizados con colagenasa purificada (1:200 diluciones). Las secciones fueron lavadas tres veces con PBS y se incubaron durante 1 h conjugado con peroxidasa de rábano secundaria de anticuerpos (1:2500 diluciones) a temperatura ambiente. El complejo antígeno-anticuerpo se visualiza por incubando con las secciones 3, 3'-diaminobenzidine (DAB) solución (1 DAB mM, 50 mM Tris-HCl, pH 7,6, y el 0,015% de H 2 O 2) en la oscuridad durante 15 -- 30 min. Las diapositivas fueron counterstained Meyer con la hematoxilina clasificado y tratado a través de alcoholes y xileno, y montadas con DPX. Secciones expuestos a preimmune jirds sueros fueron siempre incluye como controles negativos. Permanente diapositivas fueron examinadas utilizando un microscopio de luz (Nikon Eclipse E800, Nikon, Tokio, Japón) y fotografiado con la cámara digital Nikon DXM 1200.

Histoquímicas tinción de leucina aminopeptidasa (LAP)

El parásito tejidos fijados en formol-calcio se cortan en secciones delgadas (5 μ m) y repartidas en diapositivas recubiertos de gelatina como se ha descrito anteriormente para la colagenasa. Las secciones se deparaffinised con xileno y rehidratada clasificado a través de los alcoholes y el agua. PAL histoquímicas tinción se realizó con el método descrito en otra parte [28]. En pocas palabras, la rehidratada secciones fueron incubadas con la solución incubando [L-Leu-β-naphthylamide 0,5 mM, cianuro de potasio (0,00065%), cloruro sódico (0,34%) y sal Fast Blue B (0,05%)] en una cámara húmeda, oscura Para 2 h. A continuación, las diapositivas se enjuaga en forma consecutiva en el 0,85% de solución salina, 0,1 M de sulfato de cobre y de nuevo con solución salina durante 2 minutos cada una. Las secciones fueron counterstained con un 2% de metil verde por 3 min y lavarse con agua destilada. Por último, la counterstained secciones fueron tratados a través de los alcoholes clasificado, xileno y montar en DPX permanente para la preparación de diapositivas. Secciones de controles negativos fueron incubadas en el medio sin incubando el sustrato. Las láminas fueron observadas bajo un microscopio de luz (Nikon Eclipse E800, Nikon, Tokio, Japón) y fotografiado con la cámara digital Nikon DXM 1200.

Resultados
Distribución de la colagenasa en el S. Cervi

Examinamos la localización de 175kDa colagenasa en diversos tejidos adultos de S. Cervi gusanos incluyendo huevos y microfilarias utilizando IHC y evaluaron la inmunomarcación de por lo menos cinco secciones obtenidas de las diferentes regiones del cuerpo de los tres gusanos. Los resultados de inmunomarcación se resumen en la Tabla 1.

La aparición de color marrón oscuro de DAB se consideró como base para la evaluación positiva de la tinción de tejidos en el parásito. Inmunoticción muy fuerte se observó en la cutícula y epicuticle seguido por sincicial hipodermis. La buena tinción se observó en las capas musculares longitudinales, endodermis, pared intestinal, la pared de útero, ovario (germinales y las zonas de crecimiento), y la periferia de los huevos maduros y creciente embrión en el interior del útero. La intensidad de la tinción de la enzima se encontró aumentado gradualmente de ovario inmaduro plenamente crecido-ovario. La tinción de mf es, sin embargo, que se encuentran localizados en ciertas secretario poros y el cuerpo cuando la cavidad Vista en un aumento mayor (fig. 1B-G]. Tinción débil se observó en el proceso de inervación debajo de la pared corporal. No se observó tinción en los espacios entre las capas musculares longitudinales y el tejido en el interior del útero. Ninguna de estas manchas se observó en el control de secciones en las que preimmune jirds suero fue utilizado como anticuerpo primario (fig. 1A].

Distribución de PAL en S. Cervi

A continuación, hemos examinado la distribución de los adultos del gusano de LAP en tejidos incluidos los huevos, el desarrollo de embriones y mf por tinción histoquímicas utilizando L-Leu-β-Naphthylamide como sustrato. El patrón de distribución y la intensidad de la tinción se presentan en la Tabla 1. La rosa de color magenta debido a la reacción de β-naphtylamine y sal Fast Blue B, en presencia de iones Cu 2 + contra marrón rojizo de fondo se consideró como positiva la tinción. Tinción fuerte se observó en epicuticle, capas musculares longitudinales, y las paredes uterinas mf superficie seguido por intestino y endodermis. El joven ovario paredes, periferia de los huevos y embriones en desarrollo mostraron tinción moderada. No enzima tinción se observó en todo el nervio y el cable, el sincicial hipodermis y tejido en el interior del útero (Fig. 2A-F]. Una vez más la intensidad de la tinción de la enzima se encontró a aumentar con la madurez de los ovarios y huevos. La intensidad de la tinción de PAL en mf superficie es mucho mayor en comparación con inmunomarcación de la colagenasa.

Discusión

Hemos investigado el tejido localizaciones de dos importantes enzimas proteolíticas saber. 175kDa colagenasa y leucina aminopeptidasa en las especies bovina filarial parásito S. Cervi por tinción inmunohistoquímica y histoquímicas, respectivamente.

Si bien la comparación de los patrones de distribución de la colagenasa y leucina aminopeptidasa en S. Cervi observamos una marcada diferencia en su patrón de distribución en el cuerpo y la pared mf superficie (Fig. 1 y 2]. Considerando que la colagenasa fue altamente expresado en epicuticle y cutícula región y sincicial hipodermis (fig. 1C], de expresión de PAL es más prominente en epicuticle, capas musculares longitudinales, endodermis y el intestino (Figura 2C]. A diferencia de la colagenasa, la tinción de LAP no era muy fuerte en epicuticle y casi ninguna o débil tinción se observó en la cutícula, los nervios y el cordón sincicial hipodermis regiones (Figura 2B]. Además, sólo el órgano de la cavidad y la superficie de determinados sujetos excretor / secretor poros se tiñeron positivamente para la colagenasa, la tinción de LAP fue generalizada y más fuerte en mf superficie (Fig. 2F y 1G]. Esta diferencia en el patrón de distribución de la enzima en el cuerpo de los adultos del gusano de la pared y la superficie mf indica sus diferentes puestos de trabajo en estas regiones prioritarias. Sin embargo, casi similar para ambos patrones de distribución de las enzimas se señala en el intestino, los huevos maduros, embriones y la pared uterina lo que indica sus funciones de colaboración paralelo o por lo menos en estas regiones. El muro y el desarrollo de ovario fueron los huevos, ya sea negativa o ligeramente manchado la pared uterina que, cada vez más maduro y huevos embriones mostraron buena tinción de los enzimas (Fig. 1 y 2].

La cutícula en todos los nematodos parásitos extracelulares es un hydroskeleton que es relativamente inerte, estructuralmente sólido, y selectivamente permeable [29]. De muda es un proceso polietápico, con la participación de ruptura de las conexiones entre el citoesqueleto de la hipodermis y la vieja cutícula (apolysis), la elaboración de la nueva cutícula, y el derramamiento de la vieja cutícula (ecdisis) [30]. Ambos apolysis ecdisis y requieren la participación de las proteasas de la degradación de las proteínas cuticular. Además, las proteasas también pueden estar involucrados en la tramitación de los pro-proteínas, que posteriormente son incorporadas en la nueva cutícula [29]. Varios tipo de proteasas como la serina, cisteína y / o metalloproteases que se activa durante la muda, se han descrito en filariae [31 - 33] y otros helmintos parásitos como Phocanema decipiens [34], Ancylostoma sps. [35], Haemonchus contortus [18, 36 - 38] y C. Elegans [2, 39].

En filarial nematodos, la muda de larvas de tercera etapa (L3) a la cuarta fase de las larvas (L4) se inicia inmediatamente después de los nematodos entrar en un huésped vertebrado y requieren varios tipos de proteasas. Irreversible inhibidores de la proteasa cisteína retrasar o detener este proceso de muda in vitro en el caso de las larvas L3 etapas de Onchocerca volvulus [32], Dirofilaria immitis [40] y B. Pahangi [1]. En estos nematodos, las larvas L3 resultaron ser viable, pero no pudieron exsheath. Etiquetados cisteína inhibidores de la proteasa o anticuerpos encuentra la catepsina L-como actividad de la proteasa para el espacio lleno de fluido entre el nematodo y la tegumento exsheathing cutícula. Más recientemente, cathepsins L (CPL)-al igual que se clonaron genes de O. Vólvulo (Ov - cpl - 1) y C. Elegans (Ce - cpl - 1) y se muestra a localizar en las cutículas de muda de los gusanos, lo que plantea también tienen un posible papel en el proceso de muda [2]. A metalloprotease conservadas, NAS 37, también se ha demostrado que la participación en la fase final de la muda en C. Elegans [39]. Esto se expresa en la proteasa hipodermis cuatro horas antes de ecdisis durante todas las etapas de larvas y se derrama en la cutícula después de ecdisis. Un ortholog de NAS-37 ha informado de otros nematodos, tales como H. Contortus, que se someten a un proceso similar derramamiento [36].

Aunque, estudios de viabilidad de S. Cervi aún no se han hecho uso de inhibidores específicos de la colagenasa y PAL, su presencia en la superficie exterior de mf indica definitivamente su papel de muda en las larvas. Como la intensidad de la tinción PAL fue mayor y generalizada sobre mf superficie, esta enzima se debe principalmente involucrados para el proceso de muda. Colagenasa, además de su posible papel en la muda de larvas, deben participar en la evasión inmune y la migración en los tejidos de acogida. Ya se ha demostrado que el S. Cervi colagenasa (tanto somáticas y secretadas) puede cleave humanos IgG moléculas precisamente en el sitio papaína división de bisagra región y hidrolizar las proteínas del tejido conectivo como colágeno in vitro. La enzima también se indica para prevenir la mediada por anticuerpos embargo de eosinófilos parásito a la superficie cuando se analizaron en jirds por ADCC ensayo in vitro [15]. Sin embargo, su expresión en el adulto indica que estas enzimas podría tener otras funciones. La alta expresión de PAL a las capas musculares longitudinales de adultos en comparación con colagenasa sugiere que también desempeña un papel importante en la remodelación tisular en estos lugares.

La eclosión de los huevos del parásito representa una fase crítica en el ciclo de vida de un parásito. En general, el proceso de incubación se inicia por una señal apropiada, que pueden ser proporcionados por el Estado anfitrión o el medio ambiente. Estas señales ambientales pueden estimular el embrión de secretar compuestos, por ejemplo, las enzimas incubar [41, 42], que luego se degradan la cáscara del huevo o quiste y, por tanto, facilitar la eclosión. Incubar enzimas han sido identificados en Ascaris spp. [43, 44] H. Contortus [45] y Heligmosomoides polygyrus [46] e incluyen moléculas como las proteasas, lipasas, quitinasas, α-y β-glycosidases y leucina aminopeptidases. A diferencia de otros helmintos, filarias como S. Cervi son ovoviviparous y, por tanto, directamente liberación mf acogida en la circulación de la sangre. La presencia de ambos colagenasa y LAP en el huevo y el embrión de superficie indica claramente su papel en la remodelación de la cáscara del huevo, la embriogénesis y la liberación de mf de útero. Una interesante observación se señaló que las expresiones de ambas enzimas aumentado gradualmente como la maduración de los huevos que indica el progreso de sus funciones en la emergencia y la embriogénesis. Por otra parte, una relación inversa se observó entre el espesor de pared de ovario y de expresión de los enzimas. Esta observación implica que el único tanto de PAL y colagenasa están íntimamente involucrados en la liberación de mf de útero.

La participación de las proteasas en los huevos eclosionan de S. Cervi proporciona la oportunidad de investigar nuevos medios para controlar el proceso de huevos eclosionan. Además de estos dos caracterización de las proteasas en términos de su estructura terciaria puede permitir el diseño de inhibidores específicos con el fin de bloquear el proceso de huevos eclosionan. El uso específico de los inhibidores de la proteasa que no son tóxicos para la acogida, sino que muestran la especificidad de la meta representa una proteasa nuevos enfoques a la quimioterapia. Este enfoque ha sido investigado en Schistosoma spp. Inhibidores específicos que se están diseñadas para bloquear la actividad de una proteasa elastasa con el fin de impedir la penetración de la piel de este parásito [47, 48].

Al igual que otros hematophagus helmintos, S. Cervi parásitos de la sangre y también requieren otras proteínas como fuente de nutrientes para madurar y reproducirse. La expresión de las proteasas en la gastrodermis claramente apoya la opinión de que están íntimamente involucrados en la digestión de proteínas de la alimentación del parásito. En una típica cascada proteolítica que se produce durante el metabolismo de las proteínas en helmintos, colagenasa ser un endopeptidase se puede esperar desempeñar un papel en cleaving de grandes cadenas polipeptídicas PAL antes de la liberación de aminoácidos libres parcialmente digeridas las proteínas en la fase final de la cascada. Desde PAL es casi no funcionales a pH por debajo de 5,0, que podría estar activo en el gastrodermal células y ayuda en la activación y secreción de otras proenzymes de endo-exopeptidases y que se activa a bajo pH y también la liberación de aminoácidos libres absorbida péptido fragmentos.

En el presente estudio, hemos, por primera vez, se estableció el tejido localización de la colagenasa y de mujeres adultas de PAL en S. Cervi incluidos huevos y mf putativo y debatieron sobre sus funciones para la supervivencia y la persistencia del parásito en el hospedador. Nuestros resultados también abierta la posibilidad de examinar las funciones de estos dos proteasas in vivo, que se requieren más experimentos como utilizar sus sustratos naturales y / o inhibidores específicos en cada uno de los tejidos.

Contribuciones de los autores

Este trabajo es parte de la investigación de doctorado de D. Daya Ram Pokharel. Por lo tanto, Daya Ram Pokharel tenía la principal responsabilidad para el estudio (planificación, el análisis de datos y la escritura). Rita Rai participó en la adquisición de los adultos de S. Cervi gusanos y la revisión del manuscrito. Pankaj Kumar él mismo participó y ayudó en la realización de experimentos. Chandra M Chaturvedi siempre que el servicio de laboratorio y supervisó la parte experimental. Sushma Rathaur es supervisor de doctorado y ayudó a planificar el estudio, el análisis de los resultados, y escribir el manuscrito.

Agradecimientos

Daya Ram Pokharel agradece a la Comisión de Subvenciones Universitarias, Nepal para proporcionar apoyo financiero para este trabajo. Los autores agradecen al Prof Lakhotia SC, Laboratorio de Citogenética, Departamento de Zoología, Banaras Hindu University (BHU) por su amable permiso para utilizar Nikon Eclipse E800 microscopio para la fotografía de las secciones del parásito en estudio. También damos las gracias al Sr Hare Krishna Krishna Das Tiwari y Manandhar, Instituto de Ciencias Médicas, BHU, por su ayuda técnica de expertos en la preparación del manuscrito. Autores También agradecemos al CSIR, Nueva Delhi Esquema N º 37 (1189) / 04/EMR- II de asistencia financiera.