Journal of Negative Results in Biomedicine, 2006; 5: 6-6 (más artículos en esta revista)

Capsaicina resistentes arterial baroreceptors

BioMed Central
Patrick J Reynolds (pjreynolds@msn.com) [1], Fan Wei (fanw@ohsu.edu) [2], Michael C Andresen (andresen.ohsu @ gmail.com) [1]
[1] Department of Physiology and Pharmacology, Oregon Health & Science University, Portland, Oregon 97239-3098, USA
[2] Vollum Institute, Oregon Health & Science University, Portland, Oregon 97239-3098, USA

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Resumen
Antecedentes

Aórtica baroreceptors (BRs), consisten en una clase de craneal afferents derivadas de las principales arterias más cercano al corazón cuyos axones forman el nervio depresor aórtico. BRs se mechanoreceptors que son en gran parte dedicada a los reflejos cardiovasculares autonómica. Tal craneal afferents han ligeramente mielinizadas (de tipo A) o no mielinizadas (de tipo C) axones y compartir similitudes notables celular a aferente primaria de las neuronas espinales. Nuestro objetivo era probar si vanilloid receptor de los agonistas (TRPV1), la capsaicina (CAP) y resiniferatoxin (RTX), alteración de la presión de descarga de las propiedades de la aorta BRs periféricas.

Resultados

Periaxonal aplicación de la PAC 1 μ M disminución de la amplitud de la onda C en el potencial de acción compuesto en la realización de <1 m / seg a lo largo de la aorta nervio depresor. 10 μ M PAC elimina la C-ola, dejando intacta la A-ola en la realización de la serie A-δ (<12 m / seg). Estas todo el nervio resultados sugieren que los receptores TRPV1 se expresan a lo largo de los axones de C-A-, pero no la realización de la BR axones. En un arco aórtico - aórtica nervio preparación, intralumenal perfusión con 1 μ M PAC no tuvo ningún efecto sobre la presión de la gestión de las relaciones con regularidad el cumplimiento, solo BRs fibra (de tipo A) - incluido el umbral de presión, la sensibilidad, en el umbral de frecuencia, o máximo La gestión de frecuencias (n = 8, p> 0,50), pero inhibido por completo la gestión de un irregular desempeño BR (tipo C). PAC en altas concentraciones (10-100 μ M) BR depresión de la sensibilidad en regular el desempeño de BRs, un efecto atribuido a la no adopción de medidas concretas. RTX (≤ 10 μ M) no afectó la aprobación de la gestión de propiedades regularmente el desempeño de BRs (n = 7, p> 0.18). A PAC-sensibles BR había significativamente menor desempeño regularidad expresada como el coeficiente de variación de la PAC resistentes fibras (p <0,002).

Conclusión

Llegamos a la conclusión de que TRPV1 funcionales están presentes en canales de tipo C, pero no de tipo A (A-δ) mielinizadas arco aórtico BRs. PAC ha inhibidor inespecífico acciones que probablemente no van a estar relacionados con TRV1 vinculante ya que tales efectos se ausente con el agonista altamente específico TRPV1 RTX. Así, la PAC debe ser utilizado con precaución en concentraciones muy elevadas.

Antecedentes

Información sensorial de los órganos viscerales entra en el sistema nervioso central a través de piscinas separadas de primaria afferents que ya sea en la sinapsis de la médula espinal o del tronco cerebral [1, 2]. Craneal primaria que afferents primera sinapsis en el cerebro de células tallo han órganos en los ganglios nodose (GN) y comparten muchas general morfológicos, celulares y moleculares con las propiedades somáticas y viscerales neuronas sensoriales, que envían la información a la médula espinal y cuyos cuerpos celulares se encuentran en La espinal ganglios de la raíz dorsal (GRD) [3]. Sobre la base de la estructura periférica de sus axones y las velocidades de conducción, espinal y craneal neuronas sensoriales se dividen en dos grandes subdivisiones que mielinizadas (A-fibra) o unmyelinated (C-fibra) fenotipos [4]. Uno de los principales canales de membrana de proteínas asociadas con el tipo C-neuronas sensoriales es la vanilloid receptor TRPV1 (o VR1) [5], a pesar de la ligera mielinizadas, A-δ espinal las neuronas sensoriales también pueden expresar TRPV1 [6 - 8]. Las encuestas sugieren que el ARNm de TRPV1 se expresa en más del 80% de GN, así como DRG neuronas [9]. La importancia funcional de las neuronas NG TRPV1 en general, es poco claro, aunque en gastrointestinal vagal afferents está asociado con la mucosa gástrica de ácido exposición [10].

Arterial baroreceptors (BRs) son un grupo específico de neuronas aferente craneal que han estructuralmente primitivo mecánicamente sensibles terminaciones dentro de la capa adventicia de las arterias centrales de las grandes, como el arco aórtico [11, 12]. Aórtica BRs con A-y C-tipo axones han distintivo presión de descarga de propiedades [13]. La rata aórtica depresor del nervio puede ser aislada in vitro en un arco aórtico y preparación altamente estable grabaciones hechas de fibra único arco aórtico BRs [14]. Aquí, nuestro objetivo es poner a prueba bajo condiciones muy controladas in vitro si el complejo de potenciales de acción y presión de descarga de las relaciones de la aorta BRs se vieron afectados por la activación TRPV1. El uso de dos ligandos selectivos, la PAC y la resiniferatoxin (RTX), los datos sugieren que mielinizadas, periódicamente el desempeño de tipo BRs PAC son altamente resistentes a la PAC, sino que debe ser utilizado con precaución en concentraciones muy elevadas, incluso con un tipo BRs.

Resultados
PAC bloques C-volley fibra de la aorta tronco del nervio depresor

El nervio del tronco de la aorta depresor del nervio (AND) se ejecuta por separado como un axón paquete de la arbors sensorial de la persona BRs en el arco aórtico hasta la fusión con el tronco vagal cerca de la GN. Cortar ambos extremos de la Y (periférico y termina arco aórtico) y despojándolos de su vaina exterior siempre de suficiente longitud para estimular el nervio y el registro llevado a cabo todo el potencial de acción compuesto del nervio [15]. En la más baja intensidad de la estimulación, los choques a la Y suscitó una pronta a llegar, muy corta duración potencial de acción compuesto. El aumento de la intensidad del estímulo eléctrico de choque añadido un amplio, llevado a cabo lentamente, compuesto de pico tras la brusca, a principios de la espiga (Figura 1]. Estimulación supramáxima activado estos dos intensidades, distintas volleys con los primeros que lleguen pico correspondiente a la conducción calculado velocidades de entre 8 y 12 m / seg (n = 6) que se encontraron dentro de la A-δ fibra gama de conducción (Figura 1A]. Los que llegan tarde y, a menudo, más complejo volley (Figura 1B] presentaron menor amplitud y duración mucho más larga - a menudo 20-40 mseg - y de la vanguardia de la tarde correspondió a una ola calculado la velocidad de conducción no superior a 1 m / seg en todos Los casos (n = 6). Esas respuestas fueron evocados estable en experimentos de control de los períodos de más de> 30 min. Además de 1 μ M PAC (Figura 1A] en un punto a lo largo del tronco Y entre el estímulo y la grabación electrodos reducido sustancialmente la C-volley fibra de amplitud y retrasó su llegada en el tiempo después de 15 minutos de exposición. Para facilitar la comparación, se ENG señales plena ola rectificado y luego integrado a expresar de forma de onda complejas magnitudes (Figura 1B]. En promedio (n = 4), 1 μ M PAC no alteraron significativamente la A-volley integral de fibra (0,68 ± 0,17 vs 0,88 ± 0,18, p> 0,05), pero significativamente deprimido la C-volley fibra (1,38 ± 0,16 vs . 0,51 ± 0,16, p <0,02). Así, la aorta C-BR fibra axones en el tronco y son sensibles a la PAC y la A-axones son fibras resistentes a la PAC.

Sola fibra baroreceptor respuestas a la PAC

Con el fin de probar la presión de activación de la fibra óptica aórtica BRs muy bajo condiciones controladas, los aislados Y junto con el arco aórtico en una preparación in vitro [14, 16, 17]. Split único activo que contienen fibras BR unidades fueron disecados de los nervios del tronco y sometidos a lentos en pista aumenta la presión en el arco aórtico el nervio durante la grabación de alta. La más común de la presión de descarga de relación de la fibra óptica BRs mostró una muy apretada banda de descarga muy regular (Figura 2]. Tal BRs había relativamente bajo umbral valores absolutos (Pth), una fuerte subida de la frecuencia en el umbral de cero a 15-20 espigas / seg (Fth) y las tasas máximas de 50-60 Hz (Fmax). El coeficiente de variación calculado (COV) para regular el desempeño de BRs fue de 3,2 + / - 1,4%, n = 9. Estas características son típicas de descarga de mielinizadas BRs aorta [13, 18]. La media de la presión de perfusión se celebró en 80 mmHg en el control de la aguda reiniciar [19] y en estas condiciones la presión de descarga de las relaciones eran superponibles largo de los períodos de control total de al menos 15 min. Perfusión de la luz del arco aórtico con 1 μ M PAC no alterar ningún aspecto de la presión de descarga de las propiedades de tales periódicamente el desempeño de BRs incluso después de 15 minutos (Figura 2]. En promedio (n = 10), la aprobación de la gestión de propiedades regularmente el desempeño de BRs se inalterada por 1 μ M PAC (Figura 2]. PAC no alteró Pth (p = 0,79), Sth (p = 0,80), Fth (p = 0,84) o Fmax (p = 0,57). Así, en las concentraciones de la PAC que la onda C interrumpido la transmisión axonal Y en el tronco, las respuestas de regular el desempeño de BRs a presión no se vieron afectados. Este 1 μ M concentración de la PAC está cerca de la K D (2 μ M), informó GRD para las neuronas [20].

Las pruebas de rutina de activo único BR fibras utilizadas ramped pruebas de la presión a 160-180 mmHg, en un intento de récord C-fibra BRs. C-BRs fibra generalmente requieren relativamente mayor presión de activación que para regular el desempeño de tipo BRs [13, 18]. Una sola fibra BR tiene un relativamente alto Pth (106 mmHg) y la irregularidad de la gestión bajo control de las condiciones (Figura 3]. Aprobación de la gestión se inició a cerca de cero, y sólo de forma gradual el aumento de la presión como ramped superior. El desempeño irregular producido una banda dispersa de puntos como el aumento de la presión. En los niveles superiores de disparar, la gran irregularidad de COV produjo un 9,9% - más de tres veces mayor que el grupo ordinario de la gestión y un valor altamente improbable que pertenecen al grupo de regular el desempeño de BR (p <0,02). La baja tasa de desempeño irregular y más el escaso valor de la pendiente de sensibilidad (Sth) son característicos de la rata de tipo C BRs [13, 18]. Además de 1 μ M PAC a la perfundido (Figura 3] rápidamente la depresión de la presión de descarga relación a partir de las 5 min de exposición (Figura 3]. La BR fracasado en la gestión para mantener altas presiones, pero cerca de la gestión umbral fue en general similar a la de control. Por 10 min en la PAC, la gestión de este BR ya no es sostenida por encima de 125 mmHg. A los 15 min en 1 μ M PAC, la BR fue casi inexcitable y sólo dispararon una dispersión de los potenciales de acción de arco aórtico presiones por encima de su nivel de umbral de control (Figura 3]. Esta inhibición de la gestión se ha revertido parcialmente tras 30 minutos de la PAC sin lavar. Así, la PAC elimina la respuesta a la presión de este irregular desempeño de BR.

La capsaicina, pero no RTX no específicos deprime BR desempeño en altas concentraciones

Los informes sugieren que la PAC ha adicionales, no específicos efectos en concentraciones que están mucho más allá de la saturación de los sitios de unión específicos en TRPV1 [20]. Dada la alta especificidad de estos vinculantes para los agonistas TRPV1 [20], hemos considerado las concentraciones 100 veces mayores que las conocidas como potencialmente receptor Kd inespecíficas. Hemos probado mucho mayores concentraciones de la PAC en otra PAC-resistentes, de tipo BRs (# 10 μ M, n = 6). En concentraciones> 10 μ M, PAC modificado la presión de descarga de las relaciones en una forma claramente distinta de la observada en el desempeño de la PAC de forma irregular sensibles BR (Figura 3]. 100 μ M PAC aumentado sustancialmente la Pth y deprimida y la pendiente máxima de descarga de la presión de descarga regularmente el desempeño de las relaciones de BRs (Figura 4]. En la mitad de las neuronas a prueba, estos efectos persistentes invertido mal con la depresión duradera a través de largos períodos de perfusión en la PAC sin solución (> 30 min).

El ultrapotent RTX puede ser eficaz en> 100x concentraciones más bajas de la PAC [21]. En este sentido, la prueba de presión sobre las acciones RTX-BR evocó la gestión. RTX en concentraciones entre el 1 nM a 10 μ M no tuvieron efectos significativos sobre la presión de la gestión de las relaciones con regularidad el cumplimiento, de tipo BRs sola unidad. En promedio (n = 7, Figura 5], 1 μ M RTX no alteró Pth, Sth, Fth, o Fmax (p> 0,18, n = 7). En uno BR, RTX concentración se aumentó a 10 μ M RTX (Figura 5, a la izquierda), un nivel que es más de 1000 veces mayor que la esperada sin ED50 "inespecíficos" los efectos sobre la presión de descarga de las relaciones. Este hallazgo contrasta con la franca depresión de la A-BR tipo de presión de descarga de las relaciones encontradas con altas concentraciones de la PAC (Figura 4].

Discusión

Y la rata es un único tronco de nervio periférico, ya que sólo contiene la aorta BR aferente axones [22 - 24]. Esta delgada y nerviosa paquete (~ 100 μ m de diámetro) consta de hasta el 80% de las fibras C-axón total de la población [11, 25, 26] sin la axones eferentes encuentran en la periferia del nervio vago o somáticas troncos. Esta característica anatómica significa que, experimentalmente, ENGs evocados por la estimulación eléctrica son las respuestas a una modalidad relativamente uniforme de primaria visceral afferents - en este caso BRs - y no debe ser influenciado por las contribuciones de antidromically activado eferentes (no sensorial) axones de conducción similares Velocidad que puede ser una complicación en las grabaciones de una sociedad mixta (aferente y eferente) nervio del tronco. La estrecha correspondencia en nuestro PAC resultados entre la población ENG respuestas y nuestra única fibra BR estudios es coherente con esta homogeneidad. Nuestros estudios sugieren dos importantes conclusiones acerca de estos craneal y visceral afferents su expresión de TRPV1. En primer lugar, la aorta BRs poseen CAP-CAP-resistentes y sensibles terminaciones nerviosas periféricas y el sitio de acción es de suponer cerca o dentro de la mechanoreceptive campos en el arco aórtico pared. En segundo lugar, muy altas concentraciones de la PAC, pero no RTX (> 10 μ M) tiene más acciones inhibitorias sobre estas neuronas que no son compatibles con los efectos específicos.

Un tipo de fibras BR fueron muy resistentes a las acciones de la PAC, tanto a lo largo de sus axones periféricos, así como en el proceso de transducción de la presión en sus terminaciones periféricas en el arco aórtico. La PAC resistente componente de las mediciones durante todo el nervio Y dentro de la conducción fue un δ clase de axones BR - simplemente designados de tipo A. Tal tipo A-BRs probablemente típica de una amplia asociación para craneal aferente visceral sensibilidad de las neuronas con la PAC. Recientemente se informó de que las neuronas nodose A-fibra con velocidades de conducción no respondió a la exposición a somáticas C-PAC, que las neuronas se PAC fibra sensible [27]. Además, la transmisión sináptica aferente era bloquear a algunas neuronas en el sistema nervioso central a las neuronas en el núcleo del tracto solitario (NTS) [27, 28]. Juntos, nuestro presente nervio periférico estudios junto con nodose ganglionares y NTS estudios indican que se expresa en TRPV1 de tipo C, visceral aferente primaria de las neuronas en su órgano de la membrana celular, así como en sus terminaciones sensoriales periféricas y centrales terminales sinápticos.

En el presente estudio, sólo se ha registrado de una única fibra BR con el irregular desempeño patrón compatible con un unmyelinated BR [29, 30]. Axón longitud es insuficiente para medir la velocidad de conducción, pero sin embargo, la presión de descarga de las respuestas a este muy irregular BR fueron bloqueados por 1 μ M PAC - un resultado que concuerda con grabaciones Y todo nervio y estudios previos de rata Y C-fibra BRs [29 -- 31]. Al igual que otros agentes de la modulación de la BR, con la perfusión lumenal PAC rápidamente influenciado BR descarga propiedades a pesar de la ubicación de la BR terminaciones dentro de la adventicia [14, 16]. A pesar de estas limitaciones de la sola fibra BR grabaciones, la Y ENG resultados fortalecer a la asociación de tipo C-PAC BRs con sensibilidad y de tipo BRs PAC con la resistencia coherente con otros estudios [27].

PAC ha sido informado de que "no específicos" acciones en las neuronas y otros tipos de células que no es probable que la participación de la activación de TRPV1 [20]. Toxicidad crónica está probablemente relacionado con la activación prolongada de TRPV1 que puede dar lugar a la sobrecarga de calcio [32], pero cabe señalar que estas acciones requieren tóxicos que afectan la neurona expresar TRPV1. En nuestro caso de "no específicos" acciones, suponemos que de tipo A BRs falta TRPV1 expresión, pero, no obstante, han deprimido la gestión por las altas concentraciones de la PAC - que es, un TRPV1-acción independiente de la PAC. Las concentraciones de las sustancias entregado a la luz aórtica parecen fielmente llegar a la BR terminaciones en la espera concentraciones [14]. El perfil de concentración-respuesta para nuestros pledget aplicación de la PAC aplicados a la axón tronco sugiere que este método de ejecución puede ser muy ineficiente y concentraciones en el lugar de acción puede ser mucho más bajo que las concentraciones aplicadas [15]. Así, el 10 μ M C-PAC bloqueado en la conducción de fibra Y dentro de los 10 minutos, pero parecía ser específicos en que una de las fibras no son bloqueados [33]. Sin embargo, 1 μ M PAC muestran similares C-axonal selectiva bloque, pero requiere de 30 minutos en algunos ADNs.

Para BR sola fibra de alta, el patrón cualitativo de bloqueo de la PAC era muy similar a otros agentes específicos que modulan BR transducción [14, 16, 34, 35]. En el PAC-BR sensibles, los límites superiores de la gestión de frecuencias cambiado sustancialmente durante la PAC. Las relaciones no cambio a lo largo del eje de presión, tal como se contempla bloqueo de los canales de sodio con TTX en BRs [14, 16]. Menos selectiva que TTX agentes que se sabe que actuar en los dos canales de sodio y potasio, como los anestésicos locales [14, 16, 36]. Del mismo modo, los cambios en los gradientes de iones extracelulares [16, 37] umbral de los parámetros de cambio, así como la pendiente de sensibilidades BRs. Así, en el caso de la PAC-BR sensibles respuestas, la transducción de la presión parece permanecer intacto desde el umbral de la pendiente y la sensibilidad a la presión constante hasta el final fueron desarrollados bloque. Sin embargo, en A-BRs tipo, la alta concentración de la PAC producido múltiples cambios a nivel mundial en la gestión de las relaciones de presión, los cambios que sean compatibles con los objetivos múltiples de la acción. Curiosamente, RTX, una alta afinidad ligando para VR1, hizo modificar periódicamente el desempeño de BRs incluso a altas concentraciones relativas [20]. El impacto mayor en la gestión BR características a muy altas concentraciones concebiblemente podría ser una consecuencia de la PAC de perturbación interacciones lípido-proteína, como canales de iones [20]. Así, la no adopción de medidas concretas de la PAC de Mayo deprimir una gama de canales de iones indirectamente en la A-tipo BRs falta TRPV1 expresión.

Nuestro conjunto de los nervios y la velocidad de conducción grabaciones proporcionar información a la población de primaria Y BR afferents. En este sentido, no solo en nuestra BR BR estudios de fibra debe tener una conducción más allá de la velocidad de 12 m / seg - un valor que corresponde a la ligera mielinizadas A δ clase de fibras [4, 38]. El amplio ENG perfil de la fibra C-volley Y sugiere que no mielinizadas fibras rango en la conducción de la velocidad de 1 m / seg a tan bajas como 0,2 m / seg. Dentro de estos límites, Y BRs conducta similar dentro de los rangos de δ A y C-fibra fibras nociceptivas de la DRG [39]. Presumiblemente, BR neuronas que se encuentran entre las neuronas que expresan TRPV1 ARNm en el NG [9, 40]. VR1 proteína está presente en las porciones medial de la BR NTS en el que las neuronas sensoriales tienen terminaciones sinápticas [41, 42]. PAC evocados somáticas perfeccionamiento activo sólo en las corrientes NG neuronas registrada en rodajas con la conducción con las velocidades en la gama C-fibra y fibra A-NG neuronas son resistentes a la PAC [27]. En conjunto, la evidencia sugiere que TRPV1 sólo está presente en craneal visceral afferents primaria con C-axón tipo de fibra y resistente a la PAC que han BRs tipo A-la realización de los axones y la falta de expresión TRPV1.

En general, de tipo aórtico BR parece carente de neuronas funcionales TRPV1. C-aórtica tipo BRs expresar TRPV1 en sus axones periféricos y en sus terminaciones arco aórtico y parecen ser parte de un grupo más amplio de craneal afferents visceral que se sabe que son sensibles a la PAC y centralizada para proporcionar respiratorias y gastrointestinales, así como la regulación cardiovascular [43, 44]. Curiosamente, la activación de la aorta y la BRs arterial baroreflex anti-nociceptivo evocar respuestas en los animales y en los seres humanos [45, 46]. En última instancia, la función de TRPV1 está claro en craneal visceral afferents pero concebiblemente puede contribuir a la vigilancia de daño tisular [47].

Conclusión

Llegamos a la conclusión de que TRPV1 funcional de los canales no están presentes en la A-δ mielinizadas BRs en su arco aórtico o terminaciones periféricas axones. PAC, a diferencia de la ultrapotent TRPV1 agonista RTX, no había más acciones concretas para inhibir la descarga de la presión activada aórtica tipo A-BRS en concentraciones muy elevadas. Así, la PAC parece haber acciones tóxicos en altas concentraciones que son independientes de TRV1 expresión y deben utilizarse con precaución en los experimentos en que la concentración no está bien controlada.

Métodos

Todos los procedimientos fueron realizados con animales, con la aprobación de los animales de Atención Institucional y el empleo de conformidad con el Comité de los EE.UU. Servicio de Salud Pública sobre Política Humanitaria de Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio (PHS Política) y los Institutos Nacionales de Salud de Guía para el Cuidado y Uso de Animales de laboratorio (NIH Guía). Experimentos utilizados hombre adulto ratas Sprague-Dawley (B & K, Inc, Kent, Washington, 250-450 g).

El aislamiento de la izquierda del nervio depresor aórtico

Las ratas fueron anestesiados con pentobarbital sódico (ip 35-50 mg / kg). Los métodos de disección de la multa para aislar a la izquierda Y así como la eliminación de la Y con el arco aórtico intactos se han descrito en detalle previamente [25]. En resumen, después de una incisión en la línea media ventral del cuello, la tráquea fue intubado y conectado a un ventilador. El pecho se abrió en la línea media a lo largo del esternón y de la pared torácica se retractó de exponer el corazón y el arco aórtico. A partir de la GN al arco aórtico, la Y se microdissected menores de 20-60x de aumento de estereoscópica (Wild 6A, Heerbrugg, Suiza). En todo el tronco del nervio experimentos, se seccionó la Y cerca del arco aórtico y cerca de la GN registró in situ [15] con la estimulación del nervio distal y el registro de toda la evocados-nervio, compuesto potencial de acción a través de los electrodos de bajo gancho de petróleo. Para el registro único de la gestión de la BR in vitro Y preparación arco aórtico, el arco aórtico cannulated y fue eliminado con la Y para el montaje de una cámara de perfusión de la grabación.

Compuesto potenciales de acción en Y

Aislamiento de suficiente longitud de Y con el fin de medir la velocidad de conducción de la más rápida realización de las fibras es difícil [15]. En este caso, los pares de electrodos bipolares (con revestimiento de teflón-Pt-Ir cables) se colocaron en el rostro y caudal cortar extremos de la Y tronco. El camino para la conducción de distancia entre ellos se midió con un micrómetro ocular de la estereoscópica a las 36 × magnificación. El nervio electrodos y luego se cubre con una mezcla de vaselina y caliente el aceite mineral para el aislamiento. Eléctrica estímulos fueron entregados a través de un par de electrodos y la otra pareja registrada evocados potenciales de acción compuestos. El estímulo de los electrodos se conecta a un ordenador controlado por estimulador programable (AMPI Master-8) a través de un estímulo unidad de aislamiento. PAC o vehículo fue entregado al axón en un paquete expuestos región entre los dos conjuntos de electrodos usando pequeños trozos de algodón empapado solución [15]. Umbral estímulo intensidades se establecieron en cada preparación. Choques fueron 0,1 mseg en la duración de pulso. Supramáxima estímulo constantemente activado intensidades similares electroneurogram (ENG) en las ondas Y cuando el nervio es estimulado una vez cada 30 segundos. Compuesto potenciales de acción fueron capturados para su análisis utilizando un osciloscopio digital (Hewlett-Packard 54645A, Agilent Technologies, Palo Alto, CA) o el ordenador (Datawave Technologies, Longmont, CO). Los componentes de los potenciales de acción compuestos se compararon antes y después de tratamiento agonista VR1 por completo ola rectificación seguida de la integración (Figura 1]. Estas integrales mide la onda componente seleccionado más de un intervalo de 10 mseg centrado en la A-ola y durante un intervalo de 50 mseg centrado en el complejo C-ola. El tiempo de aparición en el ENG corresponden a la gama de velocidades de conducción.

In-vitro-BR presión de descarga de grabación

El arco aórtico con atribuye Y se colocó dentro de una temperatura regulada (36-37 ° C) para proporcionar una cámara estable controlado preparación altamente reproducible en la que se entregaron estímulos de presión a través de las cánulas de acero inoxidable del sistema de perfusión. El arco fue continuamente perfundidos (3 ml / min) con una solución salina fisiológica tamponada (PBS). PBS figuran en la siguiente mM: 120 NaCl, 5 KCl, 1,2 K 2 HPO 4, 1,2 MgSO 4, 1,2 CaCl 2, 25 NaHCO 3, y 10 de glucosa, y está en burbujas de aire con un 95% de O 2 -5% de CO 2 Mezcla de gases. Todos los medicamentos fueron agregados a la perfundido. Arco aórtico presión fue medida a través de un puerto manómetro lado, se muestra en un gráfico y grabador FM registrado en cinta magnetica. Arco aórtico presión se mantuvo en una constante no pulsátil 80 mmHg entre ensayos.

BR sola fibra pruebas de la presión

Para estudios de la fibra óptica, los nervios y todo se dividieron a los filamentos de multa por sucesivos micro-disección utilizando agujas desechables 30G (Bectin Dickinson, Franklin, NJ). Esas divisiones que contiene una o varias fibras de activos se colocaron en un par de multa Pt-Ir electrodos que se conecta a un diferencial de alta ganancia de preamplificador (RAP 113, Princeton E, G & G). Dependencia de la gestión las respuestas se registraron durante lento en pista pruebas de la presión (<2 mmHg / seg). Para cada prueba (control de drogas y ensayos), una serie de tres rampas de presión en intervalos de cinco minutos, se aplicó a la arco y la plena curva de la respuesta de la presión se registró. Para los análisis fuera de línea, la presión se tomaron muestras a 100 Hz y la frecuencia instantánea de pico se calculó a partir de los pulsos de una ventana de tiempo de amplitud discriminador (DIS-1, Bak Electrónica, Mount Airy, MD) por un programa de software en un PC basado en ordenador Sistema. Final de los análisis de datos y comparaciones se centraron en la tercera (15 min), los ensayos para cada condición.

BR descarga propiedades - distinguir los tipos

Corta longitud que se dividieron para las grabaciones de la fibra óptica y no permiten mediciones de la velocidad de conducción en estos BR unidad de estudios. Sin embargo, varias de las características de la distribución de los intervalos interspike y la presión de descarga de las relaciones distinguir dos clases de patrón de descarga, regulares e irregulares, que se asocian con A-y C-tipo BRs, respectivamente [13, 29, 31, 48 - 50 ]. Un individuo de tipo BRs fuego en muy interspike intervalos regulares mientras que C-fibra BRs en contraste fuego muy irregular [51]. Frecuencia de descarga se calcula como la inversa de la interspike intervalo, que es la tasa instantánea de descarga [14]. La variación de esta frecuencia de descarga instantánea sirve como indicador clave de discriminar entre los tipos de fibras BR [13]. Variabilidad en interspike intervalo se expresa como el coeficiente de variación (COV) de la aprobación de la gestión intervalos para cada unidad de BR y calculada como el cociente de la desviación estándar de la tasa dividida por la tasa media de descarga. Los COV se calcula a partir de segmentos de la presión de control de la gestión de las relaciones durante un determinado rango de 10 mm Hg (de 140 a 150 mmHg) durante la rampa de presión. Para la mayoría de las unidades, estas presiones están dentro de la gama de presiones de meseta cerca de máximo en la gestión de frecuencias. COV Este índice se utiliza para distinguir periódicamente el desempeño irregular de BRs.

Análisis - presión de las curvas de descarga

Para caracterizar BR presión de descarga de las relaciones, frecuencia instantánea se dibujan frente a la presión arterial media (OriginLabs, 7,5 origen, Northampton, MA) y los parámetros característicos de descarga se derivan de las parcelas de cada unidad. A-tipo BRs exhibió una fuerte subida de cero a un conjunto de frecuencias de la gestión ordinaria, una vez que superó una adecuada activación de la presión, la presión umbral (Pth) [13, 18]. Promedio entre los diez primeros puntos, que la frecuencia de descarga en el umbral (Fth) fue muy consistente en los ensayos repetidos en el tiempo. La presión de frecuencia por encima de Pth relación fue muy lineal. La pendiente de la relación suprathreshold define la sensibilidad a la presión (Sth o ganancia), y puede ser medida con un ajuste por regresión lineal (r 2> 0,9) durante un intervalo de 20-40 mmHg antes de llegar a una meseta de la frecuencia máxima de descarga (Fmax , Calculado como la media de frecuencia a través de 20 mmHg y espigas 200-250). C-BRs tipo, en cambio, tienen en general más altas y más bajas Fth Pth, Fmax, Sth y superior, así como COV. Características parámetros de descarga (Pth, Fth, Sth, y Fmax) fueron derivados de las parcelas de cada unidad. Parámetros de las pruebas de 15 minutos para cada condición se compararon con los controles de análisis de la varianza. Valores de P inferior a 0,05 se consideraron significativas.

VR1 agonistas

PAC fue disuelto en DMSO y luego mezclado con PBS a una solución concentrada de valores que contiene 300 μ M PAC. Esta solución madre se PAC diluido con PBS a la final de las concentraciones perfundidos a través de la luz arco aórtico. Controles de los ensayos incluidos con la aplicación de vehículo por sí solo a la mayor concentración empleada (0,1% DMSO). Las relaciones dosis-respuesta son difíciles de obtener con la PAC debido a la lentitud del tiempo curso de la recuperación y la probabilidad de desensibilización [33]. Puesto que eran los más interesados en establecer si BRs fueron sensibles a los agonistas TRPV1, probamos BRs en una concentración de la PAC 1 μ M, de una operación de concentración elegido para ser suficientes para saturar TRPV1 y, sin embargo, aún se mantienen dentro de la "selectiva" concentración rango descrito por otros [52]. Además, para poner a prueba esta hipótesis, hemos ampliado la PAC concentración de hasta 100 μ M de prueba para "no específicos" efectos de la PAC en algunos experimentos. RTX inicialmente se disuelve en una solución concentrada de valores como una mezcla de alcohol metílico (<1%) y PBS que contenía 50 μ M RTX. RTX Esta solución madre se diluye con PBS a la prueba final concentraciones. Controles de los ensayos incluidos con el vehículo solo. Se aplicaron más de una operación de concentración RTX rango de 1 a 10 μ nM M. RTX concentración de 1 nM se presume de ser un saturar concentración de TRPV1 [53] y> 1 nM se aplicaron a la prueba para su posible "no específicos" RTX efectos.

Conflicto de intereses

Los autores declaran que no tienen intereses en conflicto.

Contribuciones de los autores

PR WF y llevó a cabo estudios de la única fibra más su análisis y participó en la redacción del manuscrito. MA concebido y diseñado en el estudio y lleva a cabo todo el nervio grabaciones. MA analizó la grabación digital, así como el manuscrito redactado. Todos los autores leído y aprobado el manuscrito final.

Agradecimientos

Queremos dar las gracias Neelwant S. Sandhu de asistencia en los primeros análisis de este trabajo y la financiación de los Institutos Nacionales de Salud HL-41119 (MCA).