Proteome Science, 2006; 4: 12-12 (más artículos en esta revista)

La competencia entre sujetos libres y péptidos en un ELISA basado en el procedimiento de que los ensayos de péptidos derivados de proteínas digiere

BioMed Central
Ori Braitbard (orib@vms.huji.ac.il) [1], Hava Glickstein (havag@pob.huji.ac.il) [1], Janette Bishara-Shieban (janette1905@hotmail.co.il) [2] , Umberto Pace (paces@zahav.net.il) [2], Wilfred D Stein (wdstein@vms.huji.ac.il) [1]
[1] Química Biológica, Silberman Instituto de Ciencias de la Vida, la Universidad Hebrea de Jerusalén, Israel
[2] Las pruebas MDR Ltd, 28 St Pierre Koenig, Jerusalén, Israel

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Resumen
Antecedentes

Se describe un método de ELISA basada en el método que se puede utilizar para identificar y cuantificar las proteínas en muestras biológicas. En este método, péptidos en solución, derivados de proteolíticas resúmenes de la muestra, competir con sustrato inscritos anticuerpos de péptidos sintéticos, también en la solución, generado en contra de los elegidos péptidos. Los péptidos usados para el ELISA son elegidos sobre la base de su ser (i) los productos de la proteolítica (por ejemplo tríptico) digestión de la proteína a ser identificados y (ii) exclusivo de la proteína objetivo, en la medida de lo que uno puede saber de la Publicado secuencias.

Resultados

En el presente trabajo se describen el ensayo de la competencia y definir las condiciones óptimas para el más eficaz de ensayo. Hemos realizado un análisis de la cinética de la interacción entre los cuatro componentes del ensayo: el sustrato de plástico a la que está obligado el péptido, el péptido obligado en sí, el péptido añadido en competencia, y el anticuerpo que sea específico para el péptido y comparamos Los resultados de simulaciones teóricas a los datos reales en algunos modelos.

Conclusión

Los datos sugieren que los péptidos se unen al sustrato de plástico en más de una conformación y que, una vez obligado, el péptido muestra diferentes afinidades de los anticuerpos, dependiendo de la forma en que ha obligado a la placa

Antecedentes

Hemos desarrollado la Peptidomatrix, un método de análisis cuantitativo de las proteínas en muestras biológicas. El objetivo principal del método es que los péptidos, derivados de la digestión proteolítica de todas las proteínas en la muestra, en lugar de las proteínas propias, son ensayadas. El ensayo es un ELISA de competencia y con el fin de obtener datos cuantitativos una curva de calibración con péptidos sintéticos se ejecuta en cada experimento. En un documento (Braitbard et al. Presentado) presentamos la solicitud de Peptidomatrix a la detección de cuatro proteínas de membrana en el cultivo de células y los linfocitos humanos.

Aquí presentamos un estudio de la cinética de la interacción entre los cuatro componentes de la Peptidomatrix: (1) El sustrato de plástico a la que está obligado el péptido, (2) el obligado péptido sí mismo; (3), el péptido añadido en competencia, y (4 ) Que el anticuerpo es específico para el péptido [1, 2].

Ha habido muchos estudios, tanto experimentales y teóricas, ensayos de ELISA, utilizando anticuerpos péptido interacciones. En la mayoría de estos estudios son los propios anticuerpos a la interfaz de plástico sustrato [1 - 13]. Estos documentos tenían objetivos que eran un tanto diferentes de las que nos ocupa. Algunos estudiaron la influencia de la duración de la epítopo en la afinidad [5], otros, la capacidad de diseño de la vacuna de acuerdo con la naturaleza de los péptidos [6], la determinación de anticuerpos en el suero [7] o la comprensión de la estructura de la subunidad De la proteína [8]. Hemos sido capaces de encontrar muy pocos ejemplos en los que un péptido antígeno se une a la sólida de apoyo. [2, 9 - 11]. Una vez más, estos documentos se refieren a cuestiones tales como la naturaleza química de la reacción vinculantes, [11], que no son coincidentes con los nuestros, y en ninguno de estos es un tratamiento completo teórico presentado. Otros estudios implican el uso de la tecnología BIAcore [2, 10] y, aunque muy interesantes en sí mismas, no contribuyen directamente con nosotros en nuestros estudios que usar un plato de plástico cultura sustrato. Hemos tratado de cubrir esta laguna en la medida de lo que podamos.

Para comprender la interacción entre los diversos componentes de nuestra competitividad ELISA, uno debe tener en cuenta que lo que nos preocupa no es el intrínseco afinidad entre ligando y anticuerpos, pero, en cambio, la avidez. Afinidad es la medida de la fuerza intrínseca de la unión de un epitopo a un anticuerpo. Avidez es la medida operativa de la estabilidad general de la compleja entre anticuerpos y antígenos y esta se rige por tres factores principales: (1) La afinidad intrínseca de los anticuerpos para el epitopo, (2) la valency de la combinación entre el antígeno y el anticuerpo Y (3) la disposición geométrica de los componentes que interactúan [12].

Para calcular el avidities en nuestro sistema ELISA competitivo tenemos que considerar la cinética de la interacción entre los cuatro componentes del ensayo: el sustrato de plástico a la que está obligado el péptido, el péptido obligado en sí, el péptido añadido en competencia, y el anticuerpo que se Específicas para el péptido.

El especial de las estructuras de los péptidos y las diferentes posibilidades por las que se fijan a la influencia del sustrato de plástico avidez, y distinguirlo de otros antígenos, como las proteínas o péptidos en su conjunto y que, sin duda un porteador.

Vinculantes entre los anticuerpos y sus ligandos específicos polipéptido es convencionalmente analizados en términos de medir operacionalmente, hiperbólicas vinculante isotermas. Vinculantes entre las moléculas de plástico y el sustrato de placas ELISA se analizaron también, en general, en términos de isotermas de adsorción. Unimos estos dos enfoques y establecer modelos en los que la adsorción de la placa es un simple isoterma o una más compleja. La comparación con los datos experimentales sugieren que los péptidos se unen al sustrato de plástico con más de una modalidad, y que, una vez obligado, el péptido muestra diferentes afinidades de los anticuerpos en función de la forma en que está obligado a la placa.

Resultados

El ensayo utiliza Peptidomatrix péptidos que se eligen como (i) un objetivo específico de la proteína y (ii) entre los productos de la digestión de ese tríptico proteína. Hemos expuesto los transportistas MXR proteína de membrana (es decir, ABCG2 o BCRP) y MRP1 (ABCC1), y la cadena alfa de Na, K_ATPase (ATP1A1) a un virtual tríptico digestión y seleccionados todos los péptidos de longitud de 7 a 15 amino-ácidos. Cada uno de estos péptidos se analizó utilizando el programa BLAST (véase métodos). El péptido deseable contiene sólo 5 partidos que son aminoácidos o menos, y un número mínimo de ellos. Los péptidos son elegidos figuran en el cuadro 1.

El Peptidomatrix ensayo, tal como se describe en la introducción, es un concurso de ensayo (Figura 1): Los péptidos están obligados a pozos de plástico. Anticuerpos específicos para el péptido se añade en solución y se permite que se unen a la adjunta péptido en la presencia o la ausencia de una muestra de digerir. Una curva de calibración se genera en paralelo con cantidades conocidas de libre péptido sintético. La concentración de péptido soluble de la muestra se mide por interpolación.

El ensayo será más sensible cuando el péptido añadido bloques de la reacción entre el anticuerpo y péptidos vinculados a la concentración más baja posible. Por otro lado, tenemos que obtener el más alto posible señal-ruido en el último ensayo ELISA. Para explorar las condiciones óptimas para ello, hemos realizado una serie de experimentos en los que varía el importe de obligado péptido y la concentración de anticuerpos, antes de llevar a cabo la competencia con péptido añadido.

Fig 2A representa la unión de los anticuerpos policlonales (planteadas contra el péptido MXR P2), en cuatro diferentes diluciones, a péptido MXR P2 vinculado a los pozos de la placa de ELISA en el aumento de las concentraciones. El obligado anticuerpos se detectan por una secundaria de anticuerpos (IgG anti-conejo) conjugado con peroxidasa de rábano. En la Fig 3A, el mismo se realizan manipulaciones con péptido MXR P3. En cada caso, la ELISA señal llega a una meseta, como la cantidad de sujetos péptido se incrementa, el tamaño máximo de la señal aumenta con la cantidad de anticuerpos. Los datos fueron provistos (utilizando Sigmaplot) a la ecuación 1, de Materiales y Métodos, una hiperbólica isoterma convencional, con un rendimiento de los parámetros de Amax (máximo de la señal) y Kd (la concentración de péptido obligado en el que la mitad de la máxima aumento de la señal fue obtenida) , Junto con un parámetro D, que representa la señal de la ausencia obligada de péptido. La adición de suero pre-inmune a la mayor concentración no dio esencialmente en el incremento por encima de la señal de fondo (higos 2A]. Figs 2B y 3B muestran las señales obtenidas cuando se añade el aumento de la cantidad de anticuerpos en diferentes cantidades fijas de obligado péptidos MXR MXR P3 y P2. Una vez más, los datos de todas estas cifras se ajustaron utilizando la ecuación 1, de Materiales y Métodos, con la cinética de los parámetros que se enumeran en el cuadro 2.

Figs 2C y 3C muestran ensayos de la competencia presenta como las señales obtenidas cuando elegimos una sola concentración de anticuerpos y se titula añadió que con el aumento de las concentraciones de péptido libre añadido, en dos concentraciones de péptido obligado en la Fig 2, pero en una sola concentración en la figura 3, Con la adición de una titulación usando un péptido no relacionados con la muestra en la Fig 3C.

La figura 4 muestra un análisis de la Peptidomatrix condiciones para la detección de la Na, K-ATPasa. Los paneles A y C muestran un ajuste de dosis crecientes de las concentraciones de péptidos obligado ATP ATP P3 y P1, en dos diferentes concentraciones de anticuerpos. Los parámetros obtenidos por ajuste de curvas de estos datos se registran en la Tabla 3. Paneles B y D de la figura 4 muestran las curvas de inhibición, como en cifras 2C y 3C, utilizando los péptidos elegido para la Na, K-ATPasa, en diferentes concentraciones de los anticuerpos adecuados, con los parámetros registrados en la Tabla 3.

La inspección de estas cifras y cuadros muestra que la señal recibida se incrementa con el aumento de las concentraciones de cualquiera de los sujetos o el péptido adecuado de anticuerpos hasta que alcanza una meseta. La comparación de las curvas de la encuadernación en cantidades cada vez mayores de sujetos péptido o aumento de las concentraciones de anticuerpos, vemos que la derivada Amax, la amplitud de la señal, aumenta en consecuencia. Todo esto es de esperar, ya que tanto el aumento de la cantidad de sitios de unión o de la concentración de la libre ligando aumentará la señal, hasta un máximo, y, por tanto, la saturación, se alcanza.

Con respecto a la inhibición (es decir, la competencia) curvas hay una tendencia similar, con Amax (la señal en ausencia de péptido añadido externamente) de nuevo como el aumento de la función de cualquiera de los adjuntos péptido o la concentración de los anticuerpos. También se espera, desde Amax es la expresión de la máxima unión de los anticuerpos a la péptido, cuando no hay competencia.

No es inmediatamente evidente, sin embargo, si los valores de la media de las concentraciones de saturación, Kd, en las distintas situaciones experimentales, debe aumentar, disminuir o ser invariante. El cuadro 4 se resumen los resultados de todos los experimentos usando el MXR, ATPasa y MRP1 péptidos en términos de las tendencias de aumento o disminución en los valores de Amax y Kd. Como era de esperar, en todos los casos, el parámetro Amax ya sea como aumentos de la cantidad de sujetos péptido o de agregado de anticuerpos se incrementa. Sin embargo, en la mayoría de los casos en las columnas A (cuando es la cantidad de pre-péptido que se adjunta varían continuamente, en cantidades fijas de anticuerpos añadido) y en la columna B (anticuerpos variado en fijo adjunta péptido), el parámetro Kd disminuye a medida que la cantidad De obligado péptido o de agregado de anticuerpos se plantea. En el caso de los experimentos de la competencia (donde es la concentración de péptido libre añadido que es la variable) Amax vez más aumenta con un incremento de la cantidad de sujetos péptido o de agregado de anticuerpos, pero los aumentos en el valor Kd tanto las dos condiciones ( Columnas C y D).

Hemos intentado dar cuenta de estas tendencias en los datos Amax y Kd por la elaboración de un teórico de la ecuación tiene en cuenta la unión de los péptidos al sustrato de plástico, de la unión de los anticuerpos a la obligada péptido y, por último, la interacción entre la libre Péptido y el anticuerpo en experimentos de la competencia. La derivación de las ecuaciones apropiadas figura en el Apéndice.

La unión de los anticuerpos a la adjunta péptido es descrito por la ecuación A2

Esta ecuación predice que la señal obtenida cuando la suma de P obligado péptido, se añadirá un pozo con una máxima capacidad de unión de la tapa y medio de la saturación de la concentración de esta unión de Kp, donde la concentración de anticuerpos es un añadido, con una media Concentración de saturación para el péptido / anticuerpo isoterma de Ka. Fig 5 muestra las predicciones de esta ecuación cuando, en el grupo A, la concentración de péptido obligado es variado continuamente mientras que la de los anticuerpos añadido se fija en diferentes valores. En el grupo B, la concentración de anticuerpos varía continuamente mientras que la cantidad de péptido está obligado por etapas variadas. Arbitraria valores fueron asignados a los demás constantes. Estas líneas teóricas se ajustaron utilizando la ecuación 1 de la sección de Materiales y Métodos para obtener los parámetros enumerados en las secciones AyB de la Tabla 5. Como era de esperar, los valores Amax aumentar con un aumento en cualquiera de los dos obligados péptido o añadido de anticuerpos. El Kd valores son, sin embargo, estos cambios invariante bajo, en contraste con lo que se encuentra experimentalmente. Figs 5C y 5D describir las predicciones teóricas de la correspondiente ecuación (ecuación A5) para el protocolo de la competencia, donde es ahora libre péptido que se añade con el añadido de anticuerpos (a diferentes concentraciones de péptido obligado y añadió anticuerpo, Figs 5C y 5D, Respectivamente).

Cuando escribimos (Véase el apéndice para más detalles). Montar estas líneas a la ecuación 2 de Materiales y Métodos rendimientos de los parámetros enumerados en las secciones CyD de la Tabla 5. En ambos casos, el parámetro Amax aumentos, tal como se encuentra experimentalmente. El valor de Kd, sin embargo, es invariante de nuevo como la cantidad de sujetos péptido se incrementa (en contraste con los resultados experimentales), pero aumenta a medida que la cantidad de anticuerpos aumenta añadido (como se encontró experimentalmente).

En un intento de resolver la discrepancia entre los datos experimentales y las predicciones del modelo, analizamos un modelo más complejo en el que el sustrato de plástico lleva por lo menos dos clases de lugares a los que el péptido puede obligar. Las dos clases tienen diferentes afinidades para péptido (Kp 1 y Kp 2), y el péptido obligados a continuación, muestra una afinidad por un determinado anticuerpo (1 y Ka Ka 2). (Prevemos esta como se muestra en el diagrama de la Figura 7, donde se muestra un péptido como obligatoria en un extremo sólo para el sustrato o en ambos extremos, y el anticuerpo puede entonces vincular con una mayor o menor afinidad por el péptido.) El péptido libre en la solución se une, por supuesto, con una única afinidad Kf, ya que se une a los anticuerpos sin encuadernar. Las ecuaciones que describen este modelo son más compleja ecuación A6 de la obligatoriedad y las curvas de ecuación A7 para la competencia curvas.

La derivación de estas ecuaciones se pueden encontrar en el Apéndice. Las predicciones de las ecuaciones se representan en la Fig 6A y 6B (por ecuación A6) y C y D (de la ecuación A7) y la registrada en el Cuadro 6. Como era de esperar, los valores de Amax aumento, ya sea cuando la suma de obligado péptido o añadido de los aumentos de anticuerpos, pero ahora el valor de Kd cae sustancialmente con un aumento de estos insumos. Este es el resultado encontrado experimentalmente que se enumeran en la Tabla 4. Para el protocolo de la competencia, las predicciones teóricas son ahora de un aumento de la concentración media de saturación para mayor péptido libre cuando sea obligado péptido o añadido de anticuerpos se incrementa. (El efecto es pequeño pero consistente, cuando se asigna el péptido que se modifique). Esto está de acuerdo con los datos experimentales, pero es en contraste con las predicciones de la simple de un modelo de sitio, en el caso de que sea el adjunto del péptido que es el aumento de concentración.

Discusión

Se realizó estos experimentos a fin de determinar cuáles podrían ser las más óptimas condiciones para la realización de ensayos de la Peptidomatrix. Nuestro objetivo era encontrar las condiciones que nos daría la máxima sensibilidad (es decir, nos permite detectar la menor cantidad posible de la meta de proteínas) y, sin embargo, la más alta relación señal-ruido. Peptidomatrix El ensayo se realiza utilizando el protocolo de la competencia representada en la figura 1, los resultados experimentales con este protocolo está dando en Figs 2C, 3C, 4B y 4D y en el material complementario. Es evidente que, tanto en la teoría como en la práctica, la más alta de señal-ruido se obtiene mediante el uso de valores de la meseta obligado péptido y de los anticuerpos añadido. Pero estas son las condiciones que dan la máxima sensibilidad?

Suponiendo que el péptido se une a la de plástico con una sola modalidad, y que el obligado péptido muestra un único sitio a los anticuerpos (de un sitio modelo vinculante) de la parte dispositiva predecir (cuadro 5, secciones CyD) que la media de la saturación de concentración para la competencia Añadido por péptido libre competencia en el ensayo sería invariante con respecto a la cantidad de sujetos péptido, pero aumentará con el añadido de la concentración de anticuerpos. Un bajo Kd en el concurso de ensayo es la condición para una máxima sensibilidad, ya que, en este caso, una pequeña cantidad de péptido añadido el exterior se puede detectar. Así, la condición de adjunto máximo péptido y la baja de anticuerpos añadido sería la situación más delicada, y sin embargo sería una buena relación señal / ruido. Pero, ¿esta de un sitio modelo de dar una explicación correcta de los datos en una situación real? Experimentalmente, nos encontramos con que el aumento de la cantidad de péptido adjunto lleva a una aparente mayor afinidad de los anticuerpos a este péptido obligado, en tanto que el aumento de la cantidad de anticuerpos añadido de nuevo lleva a la aparente mayor afinidad para el péptido adjunto. Esto es en contraste con las predicciones del modelo de un sitio. La solución de los dos modelo de sitio de hecho, conduce a las predicciones de que más de cerca modelo de la situación real, pero, afortunadamente, aún nos dejan con una recomendación similar para las condiciones que dan la máxima sensibilidad y, sin embargo, una alta relación señal / ruido. El aumento de la cantidad de pre-péptido atribuye ahora llevar a un aumento de la competencia por parte de Kd añadido péptido, pero este aumento es pequeño. El aumento de la cantidad de agregado de anticuerpos aumenta la concentración media de la saturación de la libre péptido, y por lo tanto disminuir la sensibilidad del ensayo, sin embargo, este efecto es menor para los dos sitios que para el modelo de un modelo de sitio. Máxima sensibilidad se encuentra cuando se utiliza el máximo posible de revestimiento por pre-péptido añadido y una mínima cantidad de anticuerpos añadido, pero lo suficiente como para dar una señal fácilmente medible.

Un modelo que asume que el péptido se une al sustrato de plástico con, al menos, dos modalitiesand por lo menos dos diferentes afinidades vinculante para el anticuerpo (el modelo de dos sitios), de acuerdo con los resultados experimentales. De acuerdo a esta simulación, el péptido de las moléculas que están vinculados con la más alta afinidad y, por tanto, están obligados en primer lugar, es decir, la más baja en las concentraciones de péptido añadió, son aquellos en los que el anticuerpo se une con menor avidez. Por lo tanto, como la cantidad de sujetos péptido aumenta, la concentración media de la saturación de la adjunta péptido de anticuerpos sustancialmente disminuye (aumenta su avidez), y el péptido libre añadido es menos capaz de competir. Pero este efecto no es muy grande y cuatro órdenes de magnitud cada vez mayor de elevar el adjunto péptido Kd para el péptido añadió que compiten por menos de un 50% (Cuadro 6, sección C). Por otra parte, en una cantidad fija de péptido adjunto, el aumento de la cantidad de anticuerpos por un agregado similar cuatro órdenes de magnitud plantea la Kd para el péptido que compiten cuatro veces. Por lo tanto, para obtener la más alta sensibilidad, junto con la más alta de señal-ruido, que parece ser preferible reducir en la medida de lo posible la concentración de los anticuerpos y de aumentar, más bien, la cantidad de péptido obligado.

Creemos que este fenómeno de la unión de varias conformaciones posibles es un fenómeno universal por la unión de los pequeños péptidos a sustrato de plástico y tenemos que tener esto en cuenta cuando diseñamos un ensayo.

Nada de lo dispuesto en nuestro análisis, excluye la posibilidad de que existe una continua distribución de las afinidades entre el sustrato y el péptido añadido en la isoterma vinculante. Sólo podemos afirmar que, al menos, dos clases de sitios parecen estar presentes.

Conclusión

Hemos llevado a cabo un estudio encaminado a la optimización de la Peptidomatrix y desarrollado un modelo teórico que explica los datos experimentales. Este modelo tiene en cuenta la interacción de los péptidos con la placa de ELISA, la interacción de los anticuerpos con los sujetos y los péptidos y la libre competencia entre ellos.

Métodos
Materiales

Anticuerpos policlonales fueron realizados por costumbre Affinity Bioreagents (ABR, Golden, CO)

Péptidos: péptidos sintéticos se obtuvieron mediante un número de fuentes, ABR, Biosight Ltd (Karmiel, Israel) y el departamento de servicios de la Universidad Hebrea de Jerusalén

Péptido selección

Los péptidos en la que se basa el ELISA son elegidos mediante un triple proceso de selección: En primer lugar, se hace una lista de todos los péptidos que es probable que se presente en un tríptico resumen de la proteína a ser identificados. Las secuencias de las proteínas deseadas fueron recuperados de la base de datos NCBI. Un virtual "digerir" se realizó en la secuencia utilizando el programa Microsoft Word. A continuación, 7-15 péptidos de aminoácidos de largo fueron seleccionados. Cada péptido de esta selección fue comprobado por su carácter único entre todas las cadenas polipeptídicas que conforman el proteoma humano, utilizando el programa BLAST (parámetros: PAM 30 Gap Costas Existencia 5, Extensión 2). A partir de esta lista limitada, hemos elegido la más hidrofílicos péptidos como a los que sería más probable que sea buena antígenos [6, 13]. Varios de estos péptidos seleccionados fueron finalmente elegido para la producción de anticuerpos, y luego utilizada en el protocolo se describe a continuación

Los péptidos elegido para esta investigación se muestran en la Tabla 1.

Anticuerpos policlonales

Los anticuerpos policlonales utilizados a lo largo de este estudio se generaron en conejos por Affinity Bioreagents, Inc (ABR, Golden, CO), todo el suero se utilizó en todos los experimentos. El antígeno para la inmunización fue preparado también por ABR, incluyendo la síntesis de los péptidos, la conjugación de un porteador y de la inyección de conejos. Los conejos fueron sangrados una vez antes de la vacunación y 3 o 4 veces después de la vacunación. Los títulos fueron registrados y las diversas hemorragias mantenerse y utilizarse para el desarrollo de la inmunoensayo.

ELISA competitivo

Maxisorp placas ELISA (NUNC, Dinamarca) fueron revestidos noche a la mañana a 4 ° C, con 0.1-2 μ g / ml de la correspondiente péptido sintético en 0,1 M de carbonato de buffer de pH 9,6 y bloqueado 2 horas a temperatura ambiente con un amortiguador de bloqueo que contiene un 3% de BSA / 0,05% de Tween 20 en buffer fosfato salino (PBS, 0,1 M buffer fosfato, 150 mM NaCl, pH 7.2). Para los experimentos vinculante el suero inmune se diluye en la concentración deseada en el amortiguador de bloqueo. Para los experimentos de la competencia binaria diluciones seriadas de la péptido sintético (de 5 a 0,078 μ g / ml) y un blanco de muestras se prepararon en el amortiguador de bloqueo que contiene los anticuerpos en la concentración deseada. 100 μ l de estas soluciones se han añadido a los pozos y incubados a temperatura ambiente 1-3 horas. Los pozos se lavaron 4 veces con 1 × PBS/0.05% de Tween 20 y 100 μ l de peroxidasa de rábano (HRP)-conjugado 2 ª Ab (anti-conejo) diluido 1:10000 o 1:20000 en el amortiguador de bloqueo se añadieron en cada pocillo . Después de la incubación durante una hora a RT y el lavado que el anterior, el obligado conjugada HRP se detectó mediante la adición de 100 μ l de tetrametilo de bencidina (TMB). La reacción peroxidasa fue detenido después de 5 - minutos en la adición de 50 μ l 0,5 MH 2 SO 4. Densidad óptica a 450 nm se midió utilizando un lector de ELISA. El ensayo fue por triplicado.

La elaboración de una base

Los datos de la placa de lector de ELISA son almacenados en una plantilla de análisis de datos en el programa Sigmaplot (SPSS, Chicago, IL). Una parcela de la OD450 frente a la concentración de los anticuerpos o de la concentración de la péptido libre se dibuja. La trama es luego, utilizando un programa de regresión, a una hipérbola ascendente Adaptar (Equation. 1) o descendente (Equation. 2) hiperbólicas 3-parámetro de la ecuación, como se describe en el texto:

Ecuación 1

Ecuación 2

Amax donde se calculó la máxima amplitud de la curva, D, el mínimo previsto de la ELISA lecturas, que corresponden esencialmente a la señal de fondo, S la concentración de los anticuerpos o el péptido adjunta (en la ecuación 1) o la libre péptido (en la ecuación 2 ) Y Kd es la concentración que da a la mitad de la transferencia entre el máximo y el mínimo lecturas.

Apéndice

Derivación de las ecuaciones que describen la competencia entre los sujetos y libre para el péptido adecuado de anticuerpos:

La primera ecuación describe la unión entre el péptido y el sustrato de plástico. Cuando una cantidad P, de los péptidos que se ha obligado, se añadirá un pozo con una máxima capacidad de unión de la tapa y medio de la saturación de la concentración de esta unión de Kp, para obtener la suma de obligado péptido, BP, de acuerdo con un Hipérbola simple, la ecuación.:

La segunda ecuación describe la unión, de nuevo se describe por una hipérbola, entre los sujetos y el péptido añadido de anticuerpos, que la concentración de anticuerpos libres es un añadido, con una concentración media de la saturación de la adjunta péptido / anticuerpo isoterma de Ka. El término es señal de la señal obtenida de ELISA, una medida de los anticuerpos que se une a la péptido que es obligado para el sustrato de plástico.

Para describir la competencia entre adjunto y libre péptido tenemos que utilizar parámetros vinculantes 3. La primera y la segunda son los que hemos utilizado anteriormente para describir la titulación, el tercer parámetro es la afinidad entre la libre y la libre péptido de anticuerpos (suponemos que la afinidad de los anticuerpos para el libre y de la adjunta péptidos son diferentes). Con una media de la saturación de concentración para el libre péptido / anticuerpo isoterma de Kf, una concentración de péptido libre añadido como M, y una concentración de anticuerpos totales TotA, hemos (A es ahora fueron la concentración de anticuerpos libres añadido:

La sustitución de A3 en A2, obtenemos la ecuación que describe la competencia como:

Que se ajusta a la ecuación hiperbólica Desintegración en la variable F.

La sustitución de A1, y simplificando, obtenemos:

Las predicciones de estas ecuaciones se dan en la sección Resultados. Cuando se compararon estas predicciones teóricas con los resultados experimentales, se observó una falta de acuerdo entre ellos. Así, hemos explorado la posibilidad que tenemos por lo menos 2 sitios de carácter vinculante entre el péptido y el sustrato de plástico (dos valores diferentes para Kp), y, respectivamente, dos valores diferentes para Ka. La ampliación de la ecuación A2 y A4 para incluir la presencia de dos sitios de unión para el péptido al sustrato de plástico, y dos afinidades de estas formas de obligarse a la péptido de anticuerpos, tenemos:

Y para obtener la ecuación de la competencia:

Conflicto de intereses

Los autores declaran que no tienen intereses en conflicto.

Contribuciones de los autores

HG fue el primero en desarrollar el procedimiento Peptidomatrix. J BS seguir desarrollando el procedimiento. OB y HG realiza la mayor parte de los trabajos experimentales descritos en el presente documento. OB escribió el manuscrito y desarrolló el modelo de las dos conformaciones del péptido. UP intelectual proporcionado orientación y la ayuda en la preparación del manuscrito. WDS iniciado el proyecto, desarrollado el análisis matemático, dirigió la investigación y con ayuda de la preparación del manuscrito.