Journal of Immune Based Therapies and Vaccines, 2006; 4: 2-2 (más artículos en esta revista)

Un nuevo método para identificar y caracterizar los mimotopes péptido de la proteína de choque térmico 70-antígenos asociados

BioMed Central
Blanca Arnaiz (arnaizb@hotmail.com) [1], Laura Madrigal Estebas-(Laura.Madrigal-Estebas @ nuim.ie) [2], Stephen Todryk (stephen.todryk @ clínico-medicine.oxford.ac.uk) [ 3], James Tharappel C (jthrppel@gmail.com) [1], Derek G Doherty (Derek.G.Doherty @ nuim.ie) [2], Ursula Bond (ubond@tcd.ie) [1]
[1] Moyne Instituto de Medicina Preventiva, Departamento de Microbiología, Universidad de Dublín, Trinity College, Dublín 2, Irlanda
[2] Instituto de Inmunología y Departamento de Biología, Universidad Nacional de Irlanda, Maynooth, Co Kildare, Irlanda
[3] Centro de Vacunología Clínica y Medicina Tropical, Churchill Hospital, Oxford OX3 7LJ, Reino Unido

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Resumen

La proteína de choque térmico, la Hsp70, se ha demostrado que desempeñan un papel importante en la inmunidad tumoral. La vacunación con el péptido Hsp70 complejos (Hsp70-PC), aislado de las células tumorales autólogas, puede inducir la respuesta inmunitaria protectora. Hemos desarrollado un novedoso método para identificar péptidos sintéticos imitan de Hsp70-PC y poner a prueba su capacidad de activar células T. Péptidos (denominado "recognisers") que se unen a Hsp70-PCs de los humanos carcinoma de mama línea celular, MDA-MB-231, fueron identificados por bio-paneo azar péptido M13 fago mostrar biblioteca. Péptidos sintéticos recogniser posteriormente fueron utilizados como cebo en un bio-invertir paneo experimento para identificar las posibles Hsp70-PC imitar péptidos. La capacidad de la mímica y recogniser péptidos a los linfocitos humanos principales respuestas contra los antígenos de células tumorales se puso a prueba al estimular los linfocitos autólogos con péptido-cargado monocitos derivados de las células dendríticas (DCS). Cebado y la posterior estimulación, ya sea con la recogniser o imitar péptido dado lugar a interferón-γ (IFN-γ) la secreción de los linfocitos. Por otra parte, países en desarrollo cargados con Hsp70, Hsp70-PC o el recogniser o imitar el péptido a prueba los linfocitos para responder a las solubles en extractos de células de mama. Estos resultados ponen de manifiesto la posible aplicación de péptido sintético de imita-Hsp70-PC, como moduladores de la respuesta inmune contra tumores.

Fondo

Tanto T-B-y la respuesta inmune celular a tumor derivado de las proteínas se han identificado en muchos pacientes con cáncer, pero las respuestas son en general insuficientes para dar lugar a la limpieza del tumor. Uno de los retos en el tratamiento del cáncer es mejorar este anti-tumor respuesta inmune, tal vez mediante la identificación de nuevos antígenos de tumor con un mayor potencial inmunogénico. Tales antígenos tienen el potencial de ser biomarcadores tumorales en las pruebas serológicas y los objetivos en la lucha contra el tumor desarrollo de una vacuna. Actualmente hay muchos serológicamente definido proteínas marcadores tumorales conocidas y en algunos casos, las correspondientes secuencias de péptidos han sido identificadas [1]. Prometedores resultados se han observado tras la vacunación con péptidos antigénicos derivados de la «cáncer de testículo" antígeno MAGE-3, NY-ESO-1 y la diferenciación melanocyte antígenos Melan-A/MART-1/tyrosinase y gp100 [2, 3] .

Tumores derivados de proteínas de choque térmico (HSP) los preparativos han demostrado obtener anti-tumoral en la respuesta inmune tanto ratones y el hombre [4]. En ratones, la inmunización con extractos de células tumorales se mostró a conferir protección inmunológica frente a un problema posterior con el mismo tumor. Cuando estos extractos fueron fraccionados, las proteínas de estrés, Hsp70 y gp96 fueron identificados como los agentes de protección [5 - 7]. Otros experimentos mostraron que se trata de los péptidos complejos, con estas proteínas que son responsables de la generación de tumores específicos de la respuesta inmune [8 - 11].

Estudios recientes han demostrado que chaperones, como proteínas de choque térmico gp96, Hsp90, Hsp70 y calreticulin puede ser asumida por las células dendríticas por endocitosis mediada por receptores, en que entren en el MHC de clase I itinerario presentación de antígenos y son intersectoriales presentados a las células T [ 12 - 19]. Además, ambos gp96 y altamente purificada Hsp70 se ha demostrado directamente a estimular y monocitos a las células dendríticas secretan citoquinas, de manera similar a la LPS. Ellos también de regular HLA y otros co-estimuladoras moléculas, mejorando así la presentación de cualquier acompañado péptidos asociados a las células T [20]. Esta doble función de «adyuvante-cum-antígeno piscina ', hacer gp96-Hsp70 y péptido complejos, (denominado gp96-PC y PC-Hsp70), buenos candidatos para las vacunas tumorales. A este respecto, algunos muy emocionantes y los ensayos clínicos cruciales para estimular la respuesta inmune utilizando autólogo gp96-PC y PC-Hsp70 purificada de tumores resecados se están llevando a cabo con algunos resultados alentadores en pacientes con melanoma [21]. Autólogo gp96-PCs están siendo probadas para el tratamiento de linfoma, carcinoma renal, colorrectal, gástrico, páncreas y los cánceres de mama, mientras que Hsp70 de PCs se están probando para el tratamiento de la leucemia mieloide crónica (LMC; Antigenics Inc, Nueva York, NY).

Un nuevo enfoque para el desarrollo de vacunas contra el tumor ha sido el aislamiento de péptidos imita a epítopos oncogén conocido de los productos o los antígenos específicos del tumor. Un ejemplo clásico de esto es el anti-idiotype anticuerpos 105AD7 que inhibe la unión de los anticuerpos monoclonales 791T/36 a su antígeno gp72 TAA [22, 23]. Estudios posteriores han revelado que 105AD7 imita la de un epítopo ampliamente expresada la proteína celular CD55 [24]. Un gran número de anti-idiotype anticuerpos han sido identificados y muchos de ellos han sido utilizados con o sin modificaciones en la inmunoterapia del cáncer [25 - 27]. Bio-péptido paneo de pantalla bibliotecas de fagos utilizando anticuerpos frente a antígenos de tumores han dado lugar a la determinación de epítopos imitar (mimotopes) [28 - 34]. Tal seleccionado 'mimotopes' puede obtener muy específicos la respuesta inmune humoral contra los péptidos y / o los antígenos del tumor original. Aunque los cebos utilizados en los estudios mencionados fueron relativamente pura, porque es bien sabido ahora que las sucesivas rondas de rigor bio-seleccionará paneo / enriquecer y ampliar ligandos incluso a partir de una mezcla de cebos. Por ejemplo, de administración intravenosa fago mostrar la biblioteca ha sido utilizado con éxito en vivo bio-paneo en algunos sistemas modelo animal para determinar los tejidos-péptido ligandos específicos [35, 36] y ver refs. [37, 38] para comentarios.

Hemos elaborado un nuevo enfoque para generar péptidos que imitan la antigenicidad de las células tumorales de origen Hsp70-PC, en primer lugar por una selección aleatoria péptido M13 fago mostrar biblioteca utilizando como cebo Hsp70-PC extraídos de los humanos cáncer de mama línea celular, MDA-MB -231 A identificar putativo Hsp70-PC vinculante fagos (recogniser fagos). Después de varias rondas de bio-paneo, una serie de 'recogniser péptidos "fueron identificados. Posteriormente, hemos utilizado seleccionado sintéticas "recogniser péptidos' como cebos en una" marcha atrás "bio-paneo experimento para identificar fagos que interactúan con los péptidos recogniser. Nuestra hipótesis sugiere que estos fagos pueden mostrar péptidos que se imita putativo estructurales de la Hsp70-PC. Uno de los' recogniser péptidos »utilizado en el reverso bio-paneo llevado al enriquecimiento de una sola clase de codificación de todos los fagos para imitar el mismo péptido. Pusimos a prueba la capacidad de imitar este péptido para estimular los linfocitos humanos, ya sea directamente o autólogo presentada por los monocitos derivados de las células dendríticas (DCS). Nuestros resultados muestran que el CD14 - PBMCs cebado con el péptido imitar cargaron en países en desarrollo, la producción de IFN-γ a un segundo estímulo con el mismo péptido. Por otra parte, CD14 - PBMCs cebados con países en desarrollo cargados con Hsp70-PC de MDA-MB-231 células in vitro, producen IFN-γ posterior a la estimulación con el péptido imitar. Nuestros resultados también muestran que CD14 - PBMCs cebados con países en desarrollo cargados con imitar el péptido, producen IFN-γ cuando es soluble con extractos de células de cualquiera de MDA-MB-231 (tumorogénico) o MCF-12A (no tumorogénico) las líneas celulares de mama. Estos resultados sugieren que el péptido sintético imitan inmunológicamente se asemeja a péptidos presentes en los extractos de proteínas de las líneas celulares de mama y, más concretamente, se asemeja a péptidos complejos, con Hsp70. De este modo, el enfoque esbozado en este documento para la detección de Hsp70-PC imita debería resultar muy útil en la identificación de tumores específicos péptido imita modulador inmune con propiedades.

Materiales y métodos
Líneas celulares

El cáncer de mama línea celular MDA-MB-231 es un generoso regalo del doctor Boucher-Hayes, Beaumont Hospital, Dublín, y se cultivó en RPMI-1640 suplementado con 10% de suero de ternera fetal (FCS). La mama normal línea de células MCF-12A fue adquirido de CIAT-LGC (Teddington, Reino Unido) y cultivados en DMEM complementado con lo recomendado por el proveedor. Los medios de comunicación también contenía 2 mM L-glutamina, 1 × antibiótico / antimicótico solución (Sigma Chemical Co) y 100 U / mL nistatina suspensión.

Extractos de células y purificación de proteínas Hsp70 y Hsp70-PC

Para preparar extractos de células tumorales, el MDA-MB-231 o MCF-12A células fueron trypsinised y cosechada. Las células fueron lavadas dos veces en helado de PBS y la célula "pellets" resuspendido en 1 ml de PBS y zadas por 5 ciclos de congelación / descongelación seguido por ultrasonidos. El material insoluble se pildoradas por centrifugación (20500 × g durante 30 min.). Los sobrenadantes se aliquoted y almacenarse a una temperatura de -20 ° C. La Hsp70 y Hsp70-PC fueron purificados a partir de 10 8 MDA-MB-231 o MCF-12A células como anteriormente se ha descrito [7]. El purificado proteínas fueron analizadas por SDS-PAGE, immunoblotting y el uso del ratón monoclonal anti-Hsp70 y biotina anti-ratón secundaria de anticuerpos (Sigma Chemical Co) en un streptavidina-peroxidasa de rábano basa sistema de detección de quimioluminiscencia.

Bio paneo y la biblioteca de amplificación y la selección

Alrededor de 10 11 partículas de fagos de 12 mer fago M13 mostrar biblioteca (PHD-12; New England Biolabs Inc, MA) se utilizaron para cada bio-paneo experimento. Aproximadamente el 10 μ gs de Hsp70-PC (100 μ g / ml) fueron inmovilizadas en un solo bien de un 96-así Maxisorb (Nalge Nunc-Inc) placas de microtitulación. El bloqueo, vinculante y el lavado de estrategias se llevaron a cabo según las instrucciones del fabricante con las siguientes excepciones. Hemos usado (a) o bien el 1% de albúmina sérica bovina (BSA) o caseína para bloquear uniones no específicas alternando el bloqueo de estos sustratos entre sucesivas rondas de bio-paneo para prevenir la selección de fagos se reconoce el bloqueo de sustancias, (b) la competencia con la elución cebo Hsp70-PC en las rondas tres y cuatro y (c) bio-paneo en solución para las rondas dos y cuatro, con biotina Hsp70-PC streptavidina y una matriz para evitar la selección de plástico vinculante fagos. En este último caso, 10 μ g de Hsp70-PC se utilizan con biotina NHS-Biotina (Sigma Chemical Co, Poole, Reino Unido), con arreglo a las instrucciones del fabricante y se incuba con fagos 10 11 partículas a lo recomendado por el fabricante, ya sea con el bloqueo de los reactivos . La Hsp70-PC obligado partículas de fago se ha recuperado, ya sea a través de un Estreptovidina-agarosa (Pierce Chemical Co ILL) o columna Estreptovidina-Dynabeads (Dynal Co, Noruega), seguido de lavado y elución competitiva, tal como se describe más arriba. Después de cada ronda de bio-paneo, el eluido fagos se ampliaron a título alto de acuerdo a instrucciones del proveedor. A la resta de cribado utilizando el péptido agotado Hsp70-PC [7] se realizó después del tercer bio-paneo a eliminar los fagos que reconoce la Hsp70 parte de la Hsp70-PC cebo. La fracción no encuadernado se amplifica y se utiliza en la cuarta ronda bio-paneo. Las partículas de fagos a partir de la cuarta ronda eluido se chapada a la baja densidad para permitir el aislamiento de fagos único clones. La inserción de ADN de los fagos amplificado clones fue secuenciado y la Hsp70 vinculante-PC 12-mer recogniser secuencias de péptidos se deduce. Para identificar las posibles Hsp70-PC imitar péptidos, los péptidos recogniser (incluidos los tri-Glycine linker) se resumieron (véase más adelante) y se utiliza como cebo en el mismo bio-paneo procedimiento que en el caso anterior con la salvedad de que la resta paso con Hsp70 no era incluido. Especial atención se tomó para asegurar la unión de los péptidos cebo a la matriz. Después de 4 rondas de bio-paneo, el fago muestra eluye imitar péptidos se analizaron como se indica más arriba.

Péptidos

El C-terminal de péptidos amidated, TMG (recogniser), DSP (mímica), y WHK (mímica), con un período de tres glicina-spacer brazo y con o sin una terminal N'-biotina etiqueta fueron sintetizados en el Centro de Biotecnología Avanzada (Imperial College, Reino Unido).

M13 fago ELISA

Biotinylated DSP o péptidos TMG (200 pmoles) están obligados a 200 mg streptavidina-revestido bolas magneticas (Dynal Co, Noruega), con arreglo a las instrucciones del fabricante. Tras el bloqueo con BSA 0,5% y 0,1 mm d-biotina en PBS, las bolas se incubaron durante tres horas con una selección de clones M13 fago (10 11 ufp) o bien mostrando el TMG péptidos o DSP. Sin fagos fueron retirados por el lavado repetido con exceso de PBS que contenía 0,05% de Tween-20 (PBS-Tween). El obligado fagos fueron detectados por incubación con HRP conjugado anti-M13 anticuerpo monoclonal (anti-M13-HRP; Amersham Biosciences, UK; 1:2500) según las instrucciones a los proveedores, salvo que las bolas se transfirieron a los pocillos de una placa microtiter con anterioridad a color desarrollo. Como los controles, solo bolas sin péptidos fueron procesados por el mismo procedimiento.

Aislamiento de linfocitos y monocitos y la generación de países en desarrollo inmaduro

Buffy escudo paquetes de mujeres sanas donantes se obtuvieron a partir de los irlandeses Servicio de Transfusión de Sangre. PBMCs fueron preparados por Lymphoprep (Nycomed, Oslo, Noruega) gradiente de densidad de centrifugación. Monocitos fueron aisladas por la selección positiva de células CD14 + CD14 utilizando microbolas (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Alemania). Inmaduros países en desarrollo (SIRD) fueron generados por el cultivo de monocitos por 6 días en RPMI-1640 el medio suplementado con 10% de endotoxina libre de suero de ternera fetal, 2 mM L-glutamina, 80 U / mL cada una de la penicilina y la estreptomicina, 2 μ g / mL de anfotericina B en presencia de 60 ng / mL humana recombinante de granulocitos macrófagos factor estimulante de colonias (GM-CSF) y 150 ng / mL recombinante humano IL-4. Mediano y citoquinas fueron reemplazadas cada 2 días. El CD14 - PBMC, que consisten principalmente de los linfocitos (células B, células T, células NK y las células NKT) fueron criopreservados para su uso posterior como las células de respuesta.

In vitro la estimulación de los linfocitos ensayo

Estimulación de linfocitos se realizó mediante una modificación de un procedimiento de publicación [39]. Aproximadamente 10 4 células dendríticas inmaduras (SIRD) fueron incubadas con 100 μ l de medio con 10 μ g / ml LPS y los péptidos (25 μ g / mL DSP, TMG o WHK), MDA-231 o MCF-12A extractos celulares (proteínas totales de concentración 110 μ g / mL en cada caso), o Hsp70-Hsp70 o PC (tanto en la 5 μ g / mL) o los medios de comunicación por sí sola. Después de 24 horas de incubación, las células fueron pildoradas y los medios de cultivo se analizaron para IL-12 por ELISA (véase más adelante). El SIAC se resuspendido en RPMI, γ-irradiado con una dosis de 5000 rads y se lavan en RPMI. El SIAC irradiados fueron incubadas con CD14 - PBMCs en una proporción 1:10 en un volumen final de 100 μ l de RPMI completarse. Después de 48 horas de incubación, los sobrenadantes se analizaron para IFN-γ por ELISA. Estas células (designado como "priming CD14 - PBMCs) fueron cultivadas por otros 10 días de 200 μ l de la misma complementado con los medios de comunicación humana recombinante de IL-2 (25 ng / mL) y con los medios de comunicación cambia cada 3 días. El día 9, un nuevo lote de SIRD de la misma donante se incubó con péptidos, extractos celulares o los medios de comunicación, sino en la ausencia de LPS. Después de 48 horas, la cultura sobrenadantes se analizaron para IL-12. A raíz de γ-irradiación y lavados, estos cargados SIRD fueron incubadas con el priming CD14 - PBMCs en una proporción de 1:10 (IDC: CD14 - PBMCs). Después de 2 días de incubación de la cultura sobrenadantes se analizaron para IFN-γ contenido de ELISA.

Medición de la liberación de citoquinas

El IFN-γ, publicado por el CD14 estimulada - PBMC se midieron por ELISA, utilizando anticuerpos pares (DuoSet humanos IFN-γ, R & D Systems, Oxon, Reino Unido). IL-12p40 producción de SIAC se detectó utilizando DuoSet humanos IL-12p40 anticuerpos, R & D Systems).

Resultados
Identificación de recogniser imitar y péptidos de Hsp70-PC a través de bio-paneo de un fago M13 mostrar biblioteca

Fracciones proteicas enriquecido en Hsp70-PC se obtuvieron a partir de MDA-MB-231 células por medio de ADP-agarosa cromatografía de afinidad. Western blot usando anti-Hsp70 anticuerpos y Coomassie Blue tinción de la correspondiente SDS gel demuestran que el más destacado de la proteína eluye la columna con la ADP es constitutiva (Hsp73) y / o la inducible (Hsp72) las formas de Hsp70 (Fig. 1A y 1B, carril 3), confirmando los resultados similares de otros [7]. Para aislar péptidos que "reconocer" Hsp70-PC, la columna eluido fracción fue utilizada como cebo para biopan azar péptido M13 fago mostrar biblioteca. Cuatro rondas de bio-paneo se realizaron como se describe en los materiales y métodos sección y como se indica en la Figura 2. Tres bio-paneo experimentos se realizaron con Hsp70-PC como cebo. En cada caso, aproximadamente 400-1000 fagos se mantienen después de cuatro rondas de paneo. Un total de veinticuatro fago clones fueron seleccionados al azar para su posterior análisis. Se aisló el ADN de los fagos y fue secuenciada con el fin de identificar el péptido está representada por cada clon fago. La secuencia del péptido en cada caso fue nombrado en función de los tres primeros aminoácidos en su secuencia. Como se muestra en la Tabla 1, una amplia variedad de secuencias de péptidos se identificaron en cada bio-paneo experimento, algunos de los cuales eran comunes a dos de los tres bio-pannings. En un caso, los fagos que muestra el TMG péptido fue seleccionado en los tres bio-pannings (Tabla 1].

Para identificar fagos que puede interactuar con el recogniser péptidos y, por tanto, pueden llegar a ser estructural imita la original de Hsp70-PC, un bio-invertir paneo se llevó a cabo utilizando recogniser péptidos sintéticos. Péptidos que contiene las secuencias representadas por la NNY, IER y TMG fagos (Tabla 1] han sido sintetizados y utilizados como cebos. Tras cuatro rondas de bio-pannings un grupo de clones de fago se recuperaron y sus autoridades nacionales designadas fueron secuenciados. El representante secuencias de péptidos en fagos enriquecido la piscina se muestran en la Tabla 2. Ambos IER y NNY péptidos seleccionado un número de fagos con diferentes secuencias de péptidos. En teoría, estos fagos debe mostrar que las estructuras de 'imitar' el cebo utilizado para identificar el correspondiente recogniser péptidos. Ambos IER y NNY cebo péptidos seleccionados en una alta proporción de fagos que muestra el péptido SVS. Sin embargo, posteriores búsquedas en la literatura reveló que este péptido ha sido previamente identificadas en bio-paneo experimentos usando cebos no relacionadas [40, 41]. A diferencia de la IER y NNY péptidos, el TMG péptido seleccionado una sola clase de péptidos que se designa DSP (Cuadro 2]. Desde el TMG péptido fue seleccionado en los tres independientes bio-paneo experimentos y enriquecido una sola potencial imitar la secuencia del péptido nos centramos nuestro análisis en el TMG / DSP recogniser / imitar par.

El péptido específicamente DSP interactúa con fagos que muestra el TMG péptido

La especificidad de la interacción entre la DSP y TMG péptidos fue examinado por ELISA (véase Materiales y Métodos). Como se muestra en la Fig 1C, fagos que muestra el DSP péptido específicamente obligar a una síntesis de péptidos con biotina TMG (Fig. 1C, TMG). Por el contrario, mostrar los fagos TMG péptido obligar a una síntesis de péptidos con biotina DSP (Fig. 1C, DSP). A falta de péptidos con biotina, poca o ninguna señal detectable fue obtenida tras la incubación de cualquiera de los fagos solas con streptavidina revestido con bolas magnéticas (Fig. 1C, DSP negativo, negativo TMG). Por otra parte, in situ tinción histoquímica reveló que tanto el TMG y la DSP péptidos pantalla frente al citoplasma de coloración en MDA-MB-231 células lo que sugiere que estos péptidos reconocer e interactuar con los componentes celulares (datos no presentados).

La DSP y TMG péptidos tienen propiedades estimulantes inmunes

A continuación examinó si TMG, DSP o un péptido no vinculados WHK (Tabla 2] puede estimular la liberación SIRD a IL-12 y / o linfocitos para producir IFN-γ. El SIAC se incubaron con los péptidos DSP, TMG WHK o en la presencia o ausencia de LPS. La cultura sobrenadantes se realizarán las pruebas de IL-12 por ELISA. Figura 3A muestra que la IL-12 se detectó la secreción sólo cuando se incluyó LPS, pero no en su ausencia cuando se SIRD estimulado con los péptidos por sí solas.

CD14 - PBMCs fueron incubadas con TMG, DSP WHK péptidos o bien directamente en la solución o después de la carga en los monocitos autólogo derivado del SIAC. Los sobrenadantes se eliminaron para el análisis de IFN-γ producción de ELISA después de 2 días. Estas células fueron cultivadas por otros 10 días en la presencia de IL-2, tras lo cual se les re-estimulado, ya sea con los respectivos péptido en solución o un segundo lote de la SIAC de la misma donante cargado con los péptidos. Después de otros 2 días, los sobrenadantes se realizarán las pruebas de la presencia de IFN-γ. Los resultados (Fig. 3B] muestran que no IFN-γ fue puesto en libertad, ya sea en respuesta a la primera o segunda estimulación con cualquiera de los péptidos SIRD cuando fueron excluidos. Sin embargo, CD14 - PBMCs aunque débilmente respondió a una primera estimulación con SIRD cargado con cualquiera de las dos o DSP TMG péptidos y significativamente, no a todos a WHK. Por otra parte, cuando las células se re-estimulado con SIRD cebado con los correspondientes péptidos (DSP o TMG), mucho más elevados niveles de IFN-γ se produjeron. Una vez más, la respuesta a la WHK péptido es débil (Fig. 3B]. Estos resultados fueron reproducibles en cuatro experimentos, en cada caso utilizando células de un donante sano e indican que tanto la DSP y TMG péptidos son capaces de estimular los linfocitos humanos para liberar IFN-γ, de un mecanismo que requiere de países en desarrollo, pero que parece para ser independiente de IL-12 de producción.

Países en desarrollo cargados con Hsp70-Hsp70 o PC de MDA-MB-231 células pueden prime linfocitos humanos para responder a MDA-MB-231 extractos de células

El consecutivos de estimulación de las células CD14 con países en desarrollo, como se ha descrito anteriormente, se repitió la salvedad de que los antígenos diferentes piscinas se utilizaron en la primera y segunda rondas de estimulación. Activación de Linfocitos sólo se producirá si los países en desarrollo presentan el mismo o muy similar antígeno (s) en los dos estímulos [39]. Nos examinó por primera vez consecutiva la estimulación de CD14 - células con Hsp70-PC y extractos de proteínas de MDA-MB-231 células.

CD14 - PBMCs fueron incubadas con los monocitos autólogos irradiados derivados de países en desarrollo pulsos con Hsp70, Hsp70-PC o proteína soluble total de extractos de MDA-MB-231 células. Las células fueron cultivadas durante 10 días en presencia de IL-2, tras lo cual se les re-estimuladas con pulsos con SIRD proteína soluble extractos de MDA-MB-231 células. Después de otros 2 días de incubación, se pusieron a prueba sobrenadantes de IFN-γ producción. Como se muestra en la Figura 4, CD14 - PBMCs, cebados con Hsp70-pulsado SIRD y desafió con SIRD pulsos con MDA-MB-231 extractos de células (células tumorales: TC) en el segundo estímulo [Fig. 4 Hsp70 (1) / TC ( 2)], producido IFN-γ (pg / mL) a niveles del 60% y 46% de la producida por las células cebadas y desafió con MDA-MB-231 total de células extractos [TC (1) + TC (2)], en dos donantes de sangre, respectivamente. Significativamente más altos niveles de IFN-γ son secretadas cuando las células fueron cebados con Hsp70-PC y desafió con SIRD pulsos con TC [Fig. 4 Hsp70-PC (1) / TC (2); el 98% y 68% los niveles producida por las células cebados y desafió con MDA-MB-231 total de células en los extractos de los dos donantes, respectivamente]. Poco o nada de IFN-γ fue puesto en libertad cuando CD14 - PBMCs recibido sólo una exposición única de pulsos con SIRD TC (Fig. 4; TC (1), ni cuando CD14 - PBMCs fueron incubadas con SIRD estimuladas con LPS solo para la primera y la estimulación El reto del SIAC cargados con el extracto soluble de células (datos no presentados).

Países en desarrollo cargados con DSP o TMG péptidos pueden prime linfocitos humanos para responder a MDA-MB-231 extractos de células

Para determinar si la imitan DSP péptido endógeno se asemeja a cualquier péptidos o proteínas presentes en los extractos de MDA-MB-231 células tumorales, la estimulación consecutivos de CD14 - las células con antígenos diferentes piscinas se realizó tal como se describe más arriba. CD14 - PBMCs a prueba inicialmente con SIRD cargado con la DSP péptido y posteriormente estimulado con SIRD TC cargadas con extractos secretada IFN-γ a 56% y 27% los niveles de CD14 producido cuando - son a la vez las células cebadas y estimulado con el TC en los extractos de los donantes y una B, respectivamente, [Fig. 5A; DSP (1) + TC (2)]. Baja los niveles de IFN-γ fueron producidos por CD14 - células estimuladas en primer lugar con TMG y, a continuación, con extractos TC [Fig. 5A; TMG (1) + TC (2)]. Poco o nada de IFN-γ se detectó cuando CD14 - PBMCs recibido una sola exposición al TC [Fig. 5A, TC (1)], ni se IFN-γ producido cuando PBMCs fueron incubadas con SIRD estimulada por LPS solo en la primera estimulación y, a continuación, desafió con SIRD cargado con comunidades terapéuticas en el segundo estímulo (datos no presentados).

Para determinar si la estimulación de células T de los péptidos fue tumor de células específicas, el experimento se repitió pero esta vez utilizando un extracto de células de una organización no tumorogénico mama línea celular, MCF12A (Fig. 5B no células tumorales: NTC). CD14 - primero PBMCs estimulados con SIRD cargadas con el péptido DSP y luego desafió con NTC extracto de proteínas totales, producidos IFN-γ en un 46% y 32% los niveles de CD14 producido cuando - son a la vez las células cebadas y estimulado con NTC extracto de proteínas totales en los donantes A y B, respectivamente (Fig. 5B; DSP (1) + NTC (2)). En cambio, cuando cebados con SIRD cargado con TMG y estimulado con SIRD NTC cargado con extracto de proteínas totales, la relativa IFN-γ niveles fueron 6,3% y el 28% en donantes A y B, respectivamente (Fig. 5B: TMG (1) + NTC (2)). Hubo poco detectables IFN-γ producido por las células estimuladas por una sola exposición a NTC extracto de proteínas totales [Fig. 5B, NTC (1)], ni cuando CD14 - las células fueron incubadas con SIRD estimulada por LPS solos en el primer estímulo y, a continuación, El reto del SIAC cargados con las preocupaciones no comerciales en el segundo estímulo (datos no presentados).

SIRD cargado con Hsp70-Hsp70 o PC puede prime linfocitos humanos para responder a DSP péptido

CD14 - PBMCs fueron estimuladas con pulsos SIRD DSP con el péptido, Hsp70-Hsp70 o PC y posteriormente estimulado con SIRD pulsos con el péptido imitar DSP. Como se muestra en la Figura 6, CD14 - PBMCs de dos donantes, cebados con Hsp70-PC responder de manera muy eficaz a un segundo estímulo de SIRD cargado con la DSP péptido [Hsp70-PC (1) + DSP (2)] en relación con la observada DSP cuando el péptido se utiliza tanto en la primera y la segunda estímulos [DSP (1) + DSP (2)]. Cuando las células fueron estimuladas con Hsp70, agotamiento de los péptidos asociados a la primera estimulación y, a continuación, desafió con SIRD cargado con la DSP péptido en el segundo estímulo, IFN-γ secreción se observa también sin embargo en menor grado que la observada con HSP-70 - PC [Hsp70 (1) + DSP (2)]. Reiterando la conclusión anterior (Fig. 3A], una sola estimulación de CD14 - PBMCs con el péptido DSP no es suficiente para obtener detectable IFN-γ producción [DSP (1)], ni se IFN-γ producido si PBMCs fueron incubadas con SIRD estimulada por LPS solos en el primer estímulo y, a continuación, desafió con SIRD cargado con la DSP péptido en el segundo estímulo (datos no presentados).

Tomados en conjunto, nuestros datos sugieren que el péptido imitar DSP se asemeja a péptidos inmunogénicos y / o proteínas componentes de ambos tumorogénico y no tumorogénico líneas celulares de mama y tiene la capacidad de estimular humanos CD14 - PBMCs in vitro. Por otra parte, la DSP Mayo péptido estructuralmente se asemejan a péptidos complejos, con Hsp70.

Discusión

Fago mostrar las bibliotecas, desde su descubrimiento en 1990 [42], se han utilizado para identificar ligandos de alta afinidad a una variedad de moléculas pequeñas y grandes. Recientemente, Tiwari y colegas [28] han utilizado dos diferentes péptido fago mostrar las bibliotecas a fin de detectar posibles péptidos que imitan el anticuerpo vinculante epítopos del dominio extracelular del antígeno HER-2/neu. El empleo de anticuerpos monoclonales anti-HER-2/neu como cebo y cuatro rondas de bio paneo, los tres péptidos seleccionados fueron capaces de obtener la respuesta inmune humoral en ratones y para inhibir la unión de los cebos a HER-2/neu [28] antígeno, con lo que ilustra péptido sintético que imita puede obtener inmune actividades estimulantes.

El objetivo principal de este estudio fue probar una "prueba de principio", que imita orgánicas sintéticas de las Hsp70-PC podrían identificarse mediante el uso de dos etapas bio-paneo de azar péptido fago mostrar las bibliotecas. Estudios anteriores han demostrado que la HSP-PCs de ratones y seres humanos pueden inducir específico de células T respuestas [7, 21]. Los péptidos imitar, en principio, en caso de que estructuralmente se asemejan a la Hsp70-PC utilizado como cebo la inicial y puede tener propiedades funcionales similares a Hsp70-PC tales como la capacidad de estimular células T. La Hsp70-PCs preparados utilizados en este estudio se obtuvo de afinidad en una selección ADP-columna de agarosa. Hsp70-PC, aislado de este método, se ha demostrado que contienen una amplia gama de péptidos y de poseer inmune-estimulante actividad [7, 43]. De este modo, el material de partida para la bio-paneo fue la piscina de péptidos complejos, con Hsp70. Este método elude la necesidad de que la depuración de cada uno de los péptidos de la Hsp70-PC y selecciona la fracción de la abundancia. Similar bio-paneo enfoques han tenido éxito en la identificación de tejido-específico péptido ligandos [(25); ver ref. [37] para una revisión].

Una variedad de fagos que muestra única péptidos fueron identificados por los bio-paneo método. Parece haber un alto grado de enriquecimiento de secuencias específicas siguientes cuatro rondas de bio-paneo; ciertos péptidos seleccionados fueron comunes al menos a dos bio-pannings y uno de los péptidos (TMG) se recuperó en los tres bio-pannings. La diversidad de péptidos pueden ser identificados en parte debido a la complejidad de la Hsp70-PC fracción utilizado como cebo. El péptido TMG fue seleccionado en tres independientes bio-paneo experimentos, lo que sugiere que el motivo reconocido por TMG puede ser consistentemente abundantes en las tres piscinas de Hsp70-PC.

Tres de los' recogniser 'péptidos, que se identifican en múltiples bio-paneo experimentos, se utiliza entonces invertir en un bio-paneo experimento para identificar las secuencias que interactúan con estos péptidos. Dos de estos péptidos recogniser, NNY y IER, seleccionados de una amplia variedad de aglutinantes, uno de los cuales, SVS, era común entre los dos seleccionados piscinas. Tras bio-paneo experimentos no guardan relación con un péptido de cebo, consistente seleccionado la SVS péptido (Arnaiz, James Bond y datos no publicados). Curiosamente, este mismo fago péptido se habían identificado en dos no guardan relación bio-pannings para interactuar con péptidos (i) murino cerebelosa neuronas granulares y (ii), un virus de la encefalitis japonesa dotación de proteínas de anticuerpos neutralizantes [40, 41]. La selección coherente de SVS no guarda relación con cebos tal vez sugiere que este péptido puede reconocer algunos estructura común entre todos los cebos, por ejemplo, el enlace peptídico columna vertebral. A diferencia de los péptidos y NNY IER, el TMG seleccionado un único péptido que aparece después de cuatro rondas de bio-paneo. Debido al alto grado de selectividad de la TMG péptido y el hecho de que este péptido fue identificado en tres independientes bio-paneo experimentos, nos centramos nuestro análisis en este TMG-DSP 'recogniser de imitar' par.

La capacidad de los péptidos sintéticos para activar los linfocitos se examinó mediante un ensayo in vitro. Los resultados muestran que los linfocitos fueron estimulados, pero necesaria de dos consecutivos IDC mediada por la exposición a cualquiera de imitar el péptido DSP o el péptido recogniser TMG. A diferencia de LPS, estos péptidos no estimular la SIAC para producir IL-12. Por lo tanto, podemos concluir que (a) la activación de linfocitos debe ser dependiente de la absorción del péptido de SIAC y su representación a los linfocitos y (b) no es el resultado de cualquier adyuvante-como agente contaminante presente en el péptido preparación. El DSP péptido estimulador de linfocitos mostró la actividad, mientras que otro péptido WHK no produjo estimulación. Sorprendentemente, se hizo observar la estimulación de linfocitos con el péptido recogniser TMG. La razón por la activación de linfocitos no se limita a sólo imita la actualidad es poco clara. Las diferencias observadas en la eficacia entre los péptidos pueden ser reflejo de las diferentes proteolíticas transformación y / o la preferencia de los diferentes HLA clase I moléculas para la presentación de 9-mer péptidos con aminoácidos específicos en las posiciones de anclaje. Una búsqueda de la base de datos completa SYFPEITHI [44] para HLA clase I ligandos con el péptido secuencias reveló un mayor riesgo para DSP y TMG que WHK para ser presentado por el HLA clase I molécula (datos no presentados). Por otra parte, sobre la base de nuestro modelo de recognisers imita y se ha descrito anteriormente, es muy posible que los péptidos estructuralmente equivalente a recogniser péptidos también pueden estar presentes en la piscina de Hsp70-PC, por ejemplo, el receptor de EGF (una posible 'recogniser' molécula) se activa por autocrina o paracrina del factor de crecimiento y los bucles es conocido por ser excesivamente expresada en al menos el 50% de todas las neoplasias epiteliales [45] como es su ligando, EGF, (una posible 'imitar' molécula). En apoyo de esta opinión, nos encontramos con que ambos TMG DSP y péptidos, pero no específicamente WHK obligar a MDA-MB-231 que indica que las células ya sea péptido pueden interactuar con los componentes celulares dentro de estas células (Arnaiz y Bond, resultados no publicados).

Para determinar si la DSP representa un péptido de imitar cierto antígenos tumorales presentes en las células tumorales y, en particular, los antígenos tumorales en la Hsp70-PC piscina, que empleó un ensayo en el que los linfocitos son estimulados en dos rondas consecutivas con diferentes antígenos piscinas. Nos parece que las células tumorales contienen extractos de determinados antígenos en común con los presentes en la Hsp70-PC fracción, ya que con éxito estimular células T previamente cebados con Hsp70-PC de las mismas células tumorales. Además, observamos que Hsp70 solo, en ausencia de péptidos relacionados, puede prime células T de responder a los extractos de células tumorales. Así Hsp70 además de chaperoning péptidos en el procesamiento de antígenos vía de IDC, también puede desencadenar IFN-γ la producción de una manera similar a la de LPS [46 - 49]. Estos resultados están de acuerdo con los datos anteriores que muestran que la Hsp70 puede aumentar la capacidad de los vehículos blindados para la captación de antígenos [50, 51] y puede activar las células T in vitro, in vivo [10, 52]. Por lo tanto, se podría contemplar un grupo de antígenos (péptidos) está acompañado por adyuvante moléculas como Hsp70 que también puede facilitar su absorción por los vehículos blindados a través de HSP-receptores específicos (por ejemplo, CD91) en el caso de daño tisular o necrosis. Estos péptidos pueden ser entonces re-presentan a células T, a través del MHC de clase I de procesamiento de antígenos vía (cross-priming). Por lo tanto, la reconstitución de péptidos con proteínas de choque térmico como la Hsp70, podría ser una estrategia importante para garantizar una mejora de las células T respuesta a péptidos [16, 53].

Usando la misma técnica, también muestran que el péptido DSP se asemeja a los antígenos presentes en los extractos de células total de cualquiera de tumorogénico (MDA-MB-231) o no tumorogénico (MCF-12A), carcinoma de mama líneas celulares. De este modo, el DSP péptido puede simular un antígeno común en ambas líneas celulares. El TMG péptido mostraron niveles más bajos de estimulación de linfocitos tras una segunda exposición a cualquiera de los extractos de MDA-MB-231 o MCF-12A líneas celulares. También muestran que los linfocitos incubados con SIRD inicialmente cargado con Hsp70-PC pueden ser re-estimulado con SIRD DSP cargado el péptido, una vez más lo que sugiere que este péptido se asemeja a péptidos antigénicos asociados con la Hsp70 en estas líneas celulares.

Conclusión

En conclusión, hemos desarrollado un bio-paneo para enriquecer el enfoque de las bibliotecas de fagos mostrar el potencial de péptido imita Hsp70-PC y una in vitro la activación de linfocitos de ensayo para validar su potencial como antígenos específicos del tumor imita. Tales péptidos podría modificarse o combinarse con otras moléculas para desarrollar potenciales vacunas tumorales. En este primer estudio hemos identificado dos péptidos con actividad estimulante de linfocitos. Prevemos nuevos ajustes a la bio-paneo de protocolo, como pre-adsorbing el fago pantalla a una biblioteca no tumorogénico Hsp70-PC para enriquecer la fracción de cierto tumor-específicos recogniser péptidos y / o el uso de la espectroscopia de masas en tándem de secuencia directa y identificar los péptidos relacionados con Hsp70-PC. En este último caso, sus equivalentes sintéticos pueden ser probados directamente en las células T estimulación. Alto rendimiento ensayos podrían desarrollarse con relativa rapidez a la pantalla un gran número de sintético recogniser / imitar péptidos identificados a través de las estrategias descritas aquí. Tal imita podría modificarse para aumentar su eficacia inmunológica, ya sea intrínsecamente a la secuencia de nivel o mediante el uso de un cóctel de imita seleccionados para un determinado tumor sobre la base de su IFN-γ respuesta. Por otra parte, el concepto esencial de la estrategia de cribado pueden aplicarse a muchos otros potenciales biomarcadores de drogas y descubrimiento de aplicaciones.

Declaración de intereses

Los autores declaran que no tienen intereses en conflicto.

Autores de las contribuciones

L BA y ME llevó a cabo la in vitro inmuno-estimulante ensayos. ST y DD contribuido a la elaboración y supervisión de la inmuno-estimulante ensayos. TCJ y UB concebido y diseñado los métodos para el aislamiento de los péptidos imita de HSP-PC e identificó todos los péptidos descritos en el manuscrito.

Agradecimientos

Queremos dar las gracias a los miembros de la Fianza y Doherty laboratorios de apoyo y sugerencias útiles, mientras que esta investigación se está llevando a cabo. Este trabajo es apoyado por una subvención de la Junta de Investigación en Salud (RP33/2000) a los Dres. Bond y Doherty y en parte por una subvención de BioResearch Irlanda a los Dres. Y James Bond.