Immunity & Ageing, 2006; 3: 4-4 (más artículos en esta revista)

Iterleukin 1 alfa es un marcador de células endoteliales senescentes

BioMed Central
Massimo Mariotti (massimo.mariotti @ unimi.it) [1], Sara Castiglioni (sara.castiglioni @ unimi.it) [1], Daniela Bernardini (daniela.bernardini @ unimi.it) [1], Jeanette AM Maier (jeanette . Maier@unimi.it) [1]
[1] Departamento de Ciencias preclínicos, de la Universidad de la Escuela de Medicina de Milán, Via GB Grassi, 74 Milan, Italia

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Resumen
Antecedentes

Los cambios funcionales asociados con la senescencia endotelial pueden estar involucrados en el envejecimiento humano relacionados con la edad y trastornos vasculares. Desde la citoquina inflamatoria interleuquina (IL-) 1 inhibe de crecimiento endotelial, evaluamos la expresión de la IL-1 α, la IL-1 β y su antagonista, la IL-1 antagonista del receptor (IL-1ra), en la senectud endoteliales in vitro y la tranquilidad. También se examinaron la expresión de la IL-1 α en humanos senescentes y progeric fibroblastos.

Resultados

Se encontró que la sobreexpresión de IL-1 α caracteriza específicamente endotelial senectud. No modulación de esta citocina se observó en la tranquilidad y en el endotelio o senescentes progeric fibroblastos humanos. La expresión de la IL-1 β e IL-1ra también se evaluó y no se encontraron afectados por la senectud.

Conclusión

Nuestros resultados indican que una disfunción de la red de citoquinas asociadas con el envejecimiento y apuntan a una función específica de la IL-1 α endotelial en la senectud.

Introducción

El endotelio es una dinámica, heterogénea, que posee difundido órgano vital secretora, sintética, las funciones metabólicas e inmunológicas. In vivo las células endoteliales (CE) representan una gran población de células que recubren la silente buques. Macrovasculares CE rara vez brecha con un volumen de negocios de alrededor de una vez cada tres años [1], aunque es el aumento de la replicación en las condiciones que favorecen la aterogénesis, como la hipertensión, los niveles elevados de colesterol y de la subdivisión anatómica puntos. In vitro, la CE tiene un número finito de la replicación celular llegar a la senescencia replicativa [2]. Este cese de la división celular se acompaña de un conjunto específico de los cambios en función de la célula beta, la morfología y la expresión de los genes [3, 1] que pueden contribuir a la edad de las enfermedades asociadas, incluyendo la aterosclerosis. Curiosamente, las células del endotelio vascular asociada a la senescencia con fenotipos se han detectado en las regiones de ateroma de la aorta humanos [4] y de las arterias coronarias [5]. En consecuencia, múltiples baloon denudación endotelial en la no arteroesclerótica conejo arterias carótidas promovido la acumulación de células senescentes en la pared arterial [6].

Endoteliales senectud es modulada, en parte, por la citoquina inflamatoria interleuquina (IL-) 1 α [2, 7]. IL-1 y de sus miembros de la familia se expresan en los buques de ateroma humano, principalmente en el endotelio [8]. Cabe señalar que la CE senescencia replicativa y la IL-1 se han relacionado con la aterosclerosis.

A pesar de la senectud y la tranquilidad tienen un común denominador representado por la inhibición de crecimiento de las células, los dos procesos son diferentes, porque senectud se caracteriza por un crecimiento irreversible de la detención, así como por un perfil de expresión de genes específicos [3].

Este documento aborda la relación entre la IL-1 α, β IL-1 e IL-1ra expresión y macrovasculares quiescencia de células endoteliales y senectud. También se examinaron la expresión de la IL-1 α en humanos senescentes y progeric fibroblastos. Llegamos a la conclusión de que la sobreexpresión de IL-1 α es un marcador específico del endotelio in vitro senectud.

Métodos
Cultivo de células

CE vena umbilical humana (HUVEC) se cultivaron en M199 con 10% suero de ternera fetal (FCS), el crecimiento celular endotelial Suplemento (150 μ g / ml) y heparina (5 U / ml), el 2% platos recubiertos de gelatina. Todos los reactivos son de la cultura Gibco. Progeric fibroblastos humanos de los individuos (GM0498, 3 años, de sexo masculino; GM2037, 13 años de edad) y los controles pareados por edad (AG6917, 3 años, de sexo masculino; AG3513, 13 años de edad) fueron de ATCC y cultivadas en D - MEM que contiene 20% FCS. Fibroblastos dérmicos humanos fueron aislados y propagado en D-MEM, con un 10% de FCS, hasta que llegó a la senectud celular [9].

La población doublings (PD) se calcula como log 2 (número de células en el momento de la subcultura y del número de células chapados). El fenotipo senescente se evaluó mediante la evaluación de la senectud-asociados (SA) beta-galactosidasa actividad, tal como se describe [10].

Del Norte blot y RT-PCR análisis

HUVEC fueron lavadas con buffer fosfato salino y lyzed en RNAzol (Gibco). PolyA + ARN se purificó en oligodT columnas, electrophoresed en un gel de agarosa al 1% que contiene 2,2 M formaldehído, capilar borró en membranas de nylon y UV crosslinked. IL-1 α y GAPDH ADNc fueron etiquetados con un juego de azar primer etiquetado (Ambion). Los filtros se hibridó en 0,5 M de fosfato de sodio (pH 7.2) que contiene 7% SDS, 1 mM EDTA y 20% de formamida a 65 ° C durante 20 h, y ampliamente lavado a alta rigor antes de autorradiografía. Los resultados fueron su cuantificación por densitometría. Para establecer si comparables cantidades de ARN se había cargado, la relación se evaluó GAPDH/IL-1 α. Por RT-PCR, 1 μ g de ARN total fue transcrito y revertir mediante amplificación por PCR se realizó utilizando 1 / 50 de final de la reacción RT. Cada ciclo consistió en la amplificación de 30 segundos a 95 ° C, 30 segundos a 52 ° C y 1 min a 72 ° C utilizando 30 pmol de cada primer. La reacción fue detenido después de 15 o 30 ciclos. Una quinta parte de la mezcla de reacción se separó en un gel de agarosa al 1%. Los primers utilizados para la amplificación de IL-1 β son los siguientes: 5'-GACTTGTTCTTTGAAGTCGAT-3 '(sentido) y 5'-TAGAGTGGGCTTATCATCTTT-3' (retroceso). Los primers para IL-1ra son: 5'-ATGGAAATCTGCAGAGGCCTCCGCAGT-3 '(sentido) y 5'-CTGGTCAGCTTCCATCGCTGTGCAGAGGAA-3' (antisentido). La secuencia de los primers GAPDH se ha publicado [2].

Western blot

HUVEC fueron lisadas en 10 mM Tris-HCl (pH 7.4) que contiene 3 mM MgCl 2, 10 mM NaCl, 0,1% SDS, 0,1% Tritón X-100, 0,5 mM EDTA y los inhibidores de la proteína, separados el 15 de % SDS-PAGE y transferidas a nitrocelulosa hojas. Western blot se realizó utilizando anticuerpos policlonales de cabra contra la IL-1 α (Santa Cruz-TebuBio). Secundaria anticuerpos fueron etiquetados con peroxidasa de rábano (Amersham Pharmacia Biotech). El kit SuperSignal quimioluminiscencia (Pierce) se utilizó para la detección de proteínas inmunorreactivas siguiendo las instrucciones del fabricante. Los blots fueron despojadas e incubadas con un anticuerpo anti-actina (Santa Cruz - Tebu-bio) para demostrar que las cantidades de proteínas comparables fueron cargados por carril. Densitométrica análisis se realizó para cuantificar mejor los resultados. Todos los occidentales blots se han repetido al menos tres veces en los extractos de células de diferentes experimentos.

Resultados
IL-1 α proliferando en los niveles vs silente HUVEC

En placas de cultivo, HUVEC crecer hasta que forman un perfecto monocapa. En esta fase, las células dejen de crecer y convertirse en inactivo. Este patrón se correlaciona con la detención de la incorporación de timidina (no se muestra). Dado que la IL-1 α inhibe la proliferación endotelial, evaluamos si la IL-1 α moduladas activamente en HUVEC silente frente a la proliferación, tanto en la PD 20. PolyA + ARN se separaron por electroforesis y del Norte se realizó blot. No se detectaron modulación de la IL-1 α ARN en silente frente a la proliferación de las células (Figura 1A]. En consecuencia, los niveles de proteína de la IL-1 fueron comparables en el silente y la proliferación de las células (Fig. 1B]. Se obtuvieron resultados similares en células HUVEC quiescencia cuando fue alcanzado por la retirada del factor de crecimiento (no se muestra).

IL-1s expresión en células HUVEC en diversos PD

Desde senescencia celular se correlaciona con la disminución de la tasa de proliferando y un antisentido contra la IL-1 α extiende la vida útil del endotelio [2], evaluamos la IL-1 α niveles en HUVEC en diferentes PD. Como se muestra en la figura 1A, un aumento gradual de la IL-1 α mRNA paralelo aumento de la PD, detectada por mancha del Norte realizó en polyA + ARN. En consecuencia, hemos detectado cantidades superiores de IL-1 α en senescentes (PD 45) que en los jóvenes (PD 15) el análisis de las células por el oeste (Fig. 2].

Debido i) la IL-1 α comparte muchas actividades con la IL-1 β y ii) sus actividades se antagoniza por la IL-1 antagonista del receptor (IL-1ra), se determinó la expresión de los miembros de la familia de la IL-1, IL-es decir, 1α, IL-1 β e IL-1ra por RT-PCR en HUVEC en diferentes PD. Para proporcionar una mejor cuantificación, la reacción de PCR fue detenido después de 15 o 30 ciclos. En ambas condiciones, no se encontraron importantes modulación de los importes totales de la IL-1 β e IL-1ra jóvenes y senescentes en las células endoteliales, mientras que confirmó que la inducción de IL-1 α expresión (Fig. 3].

IL-1s en los jóvenes, y senescentes progeric fibroblastos humanos

Para determinar si la relación entre la IL-1s y senectud se produjo también en los fibroblastos, se examinaron los jóvenes y senescentes humanos fibroblastos dérmicos por su expresión de la IL-1 α por los del Norte sobre polyA + ARN y occidental mancha y no encontró diferencias (Fig. 4A y 4B ). Progeria es una rara envejecimiento prematuro, síndrome que se caracteriza por estigmas externos del envejecimiento y la muerte dentro de la fierst dos décadas de la vida [11]. Por lo tanto, evaluó la IL-1 α expresión en fibroblastos dérmicos derivados de progeric personas. Figura 4A y 4B muestran que la IL-1 α mRNA y los niveles de proteína no son significativamente modulada en progeric vs emparejados por edad fibroblastos dérmicos.

Por RT-PCR, que muestran que la modulación no se produce en el estado de equilibrio de los niveles de IL-1 β e IL-1ra (Fig. 5] y senescentes en progeric fibroblastos.

Discusión

Los resultados del presente estudio indican que la sobreexpresión de IL-1 α caracteriza específicamente endotelial senectud. No modulación de esta citocina se observó en la tranquilidad y en el endotelio o senescentes progeric fibroblastos humanos.

IL-1 α comparte muchas actividades con la IL-1 β, ya que actúan uniéndose a un receptor común, el tipo I de IL-1 receptor [12]. Un tercer miembro de la familia, la IL-1 antagonista del receptor (IL-1ra), también se une a la del tipo I de IL-1 receptor y bloquea el receptor, inhibiendo la acción de los agonistas de IL-1s [12]. En senescentes células endoteliales que no detectó la modulación de los niveles de mRNA de la IL-1 β e IL-1ra. Por lo tanto, proponemos que la IL-1 α podría utilizarse como un marcador de senescencia endotelial. IL-1 α causas múltiples respuestas en las células endoteliales vasculares incluyendo la inhibición de la proliferación celular [13], la inducción de moléculas de adhesión que unen a los leucocitos [14] y la promoción de la formación de trombo [15]. De hecho, in vitro, la IL-1 α sobreexpresión se ha relacionado con la vida y endoteliales a varias disfunciones [2]. Cabe señalar que las células endoteliales senescentes se encuentran en la superficie de placas ateroscleróticas [5] y que la IL-1 es producida por el endotelio de las arterias coronarias de edad [8].

El aumento de la producción vascular de las citoquinas pro-inflamatorias pueden contribuir al incremento de los niveles plasmáticos de estos mediadores en el envejecimiento [16, 17]. Proponemos que la upregulation de IL-1 puede estar vinculado a la activación de diversos programas de fisiopatológicos que subyacen en el complejo fenómeno biológico descrito como "envejecimiento vascular". Proinflamatorias estado de las arterias de edad puede pasar las intravascular de un medio ambiente estable hemodinámicamente a un estado pro-coagulante, el estado pro-oxidante que puede favorecer una respuesta exagerada de los vasos lesiones, la promoción del desarrollo de la enfermedad isquémica del corazón en las personas de edad.

IL-1ra polimorfismos alélicos afectar replicativa de vida de los humanos de la CE [10]. El polimorfismo de la IL-1RN * 2 * 2, que disminuye los niveles de IL-1ra, se asoció con un mayor número de senescentes células endoteliales y una inhibición de la proliferación, mientras que la adición de IL-1ra restablecido el potencial proliferativo de las células y extenderse Su vida útil [10]. Porque endotelial es mayor el volumen de negocios en las condiciones que favorecen la aterogénesis lo que dará lugar a un fenotipo senescente, cabe destacar que la IL-1RN * 2 alelo se asocia con la enfermedad aterosclerótica coronaria [18]. Todos juntos, estos datos sugieren que la IL-1ra puede impedir el senescente efectos de la promoción de la IL-1 en el endotelio.

No hemos detectar cualquier modulación de los niveles de estado de equilibrio de la IL-1s en edades comprendidas entre los humanos in vitro y por vía cutánea en progeric fibroblastos. Esto está de acuerdo con un estudio anterior realizado sobre la tasa de mortalidad infantil-90 células, demostrando que los fibroblastos humanos diploides senectud vía es independiente de la IL-1 α mRNA niveles [19]. Por el contrario, expresión de la IL-1 β e IL-1ra se indujo senescentes en fibroblastos de embriones de ratón [20]. Curiosamente, el IL-1ra - / - ratones presentan una mayor mortalidad precoz en comparación con ratones de tipo salvaje y acelerada senescencia se observó en el IL-1ra deficiente fibroblastos [21]. Todos juntos estos datos indican que una disfunción de la red de citoquinas asociadas con el envejecimiento y apuntan a una función específica de la IL-1 α endotelial en la senectud.

Abreviaturas

Interleucina-1 IL-1

IL-1 antagonista del receptor de IL-1ra

Células endoteliales CE

Vena umbilical humana CE HUVEC

Transcripción inversa-reacción en cadena de polimerasa RT-PCR