Proteome Science, 2006; 4: 11-11 (más artículos en esta revista)

Ontogénico variaciones en el proteoma veneno de la serpiente Bothrops atrox amazónica

BioMed Central
Rafael AP Guércio (raffa@unb.br) [1], Anna Shevchenko (ashevche@mpi-cbg.de) [2], Andrej Shevchenko (shevchenko@mpi-cbg.de) [2], Jorge L López-Lozano ( Ofidismo@prodamnet.com.br) [3], Jaime Paba (jaimepaba@ufpr.br) [1], Marcelo Sousa V (mvsousa@unb.br) [1], Carlos AO Ricart () [ricart@unb.br 1]
[1] Centro Brasileño para la Investigación de Proteínas, Departamento de Biología Celular de la Universidad de Brasilia, Brasilia, 70910-900 - DF, Brasil
[2] Max Planck Institute of Molecular Cell Biology and Genetics, Pfotenhauerstrasse 108, 01307 Dresden, Germany
[3] Gerência de Animais Peçonhentos - Fundação de Medicina Tropical do Amazonas, Av. Pedro Teixeira 25, 69040-000 Manaus, AM, Brasil

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Resumen
Antecedentes

Bothrops atrox es responsable de la mayoría de los accidentes snakebite de la región amazónica brasileña. Estudios anteriores han demostrado que las actividades biológicas y farmacológicas de la B. Atrox veneno altera con la edad del animal. Aquí, se presenta un análisis comparativo del proteoma de la B. Atrox veneno de recogida de especímenes de tres diferentes etapas de la maduración: los juveniles, sub-adultos y adultos.

Resultados

Optimizado condiciones para bidimensional en gel de electroforesis (2-DE) de un conjunto de muestras de veneno se lograron utilizando gradiente de pH inmovilizado (IPG) de los geles no lineal 3-10 pH isoeléctrico centrado durante el paso y gradiente de 10-20% en geles de poliacrilamida La segunda dimensión. Software de análisis con ayuda de las 2-DE geles imágenes demostrado diferencias en el número y la intensidad de los spots de menores, adultos y subadultos venenos. Aunque péptido masiva de huellas dactilares (PMF) no identificar siquiera una pequeña fracción de los puntos, nos permitió grupo de manchas que muestran mapas péptido similar. Los anuncios fueron sometidos a una combinación de espectrometría de masas en tándem y Mascotas y MS BLAST búsquedas en bases de datos que identifican varias clases de proteínas, incluyendo metaloproteinasas, serin proteasas, lectinas, fosfolipasas A 2, L-amino oxidasas, nervio factores de crecimiento, factores de crecimiento endotelial vascular Cisteína y ricos en proteínas secretoras.

Conclusión

El análisis de la B. Atrox muestras de los especímenes de distintas edades de 2-DE y la espectrometría de masa sugirió que altera a veneno proteoma ontogenia. Se identificaron etapa específica y diferencialmente expresado polipéptidos que pueden ser responsables de las actividades de la veneno en cada etapa de desarrollo. Los resultados proporcionan una visión profunda sobre las bases moleculares de la relación entre la sintomatología de snakebite accidentes en los seres humanos y la composición del veneno. Nuestros resultados subrayan la importancia del uso de venenos de cada espécimen en diversas etapas de maduración para la producción de antivenenosos.

Antecedentes

El género Bothrops (familia Viperidae) comprende varias especies de víboras de hoyo que habitan el continente americano desde Mexico a la Argentina [1]. Bothrops atrox especies son responsables de la mayoría de los accidentes snakebite de la región amazónica brasileña [2]. En los seres humanos, los envenenamientos Bothrops atrox causas efectos locales como hinchazón, hemorragia y necrosis local además de los efectos sistémicos, incluyendo alteraciones en la coagulación de la sangre y diversos tipos de sangrado distante de la picadura del sitio [3]. Perturbado la hemostasia y la trombosis arterial son en gran parte causados por proteasas, especialmente metallo-y serina-proteasas que son los principales componentes de venenos de serpiente Bothrops [4].

Entre otros factores, la composición de los venenos de serpientes se ve afectado por la edad de los animales. Un estudio comparativo de la actividad de proteinasas y los perfiles de proteínas de venenos de menores, adultos y subadultos Bothrops atrox especímenes capturados en la selva amazónica brasileña se había informado anteriormente [2]. López-Lozano et al demostraron que los venenos de los juveniles y sub-adultos muestran mayor actividad de coagulación del plasma humano en comparación con los adultos venenos. Además, SDS-PAGE y HPLC veneno de la proteína varió entre los perfiles de las tres etapas de desarrollo analizados. Dos proteínas de 23 kDa y 50 kDa, respectivamente, que estaban presentes en cantidades superiores en adultos venenos, fueron identificados como metaloproteinasas.

Un estudio independiente de B. Atrox especímenes de la selva amazónica colombiana demostró que los recién nacidos y venenos de menores espécimen causado mayor letalidad y poseen mayor hemorrágica y coagulante actividades, que los adultos venenos. Las diferencias en la actividad se atribuyó a la mayor cantidad de proteínas de alto peso molecular, probablemente también metaloproteinasas [5].

En conjunto, estas y otras evidencias indica que los cambios en el proteoma veneno durante el desarrollo ontogénico puede influir en su actividad biológica. Aquí recogemos un análisis comparativo del proteoma de la B. Atrox venenos de menores, sub-adultos y adultos que identificó las proteínas cuya expresión diferencial durante el desarrollo ontogénico puede ser correlacionada con la de informes anteriores propiedades del veneno [2, 5].

Resultados

Con el fin de optimizar 2-DE separación de B. Atrox veneno de las proteínas, lineales y no lineales 3-10 pH gradientes se probaron en el centrándose isoeléctrico (IEF) paso. El gradiente no lineal, desarrollados para mejorar la resolución de las proteínas ácidas, a condición de mejor resolución de los puntos que el pH gradiente lineal ya que muchos spots consistió en mostrar polipéptidos puntos isoeléctricos (pI pI) entre el 4 y el 7 (datos no presentados). Dos tipos de equipo de electroforesis - Multiphor II y IPGphor de GE Healthcare-se probaron para el IEF paso y ambos siempre similares 2-DE mapas (datos no presentados). Por otra parte, para la segunda dimensión, el gradiente de geles (10-20% T) 2-siempre mejor DE mapas de más de 12% T geles, especialmente para las proteínas con masas moleculares alrededor de 14 kDa (datos no presentados).

Los patrones de proteínas manchas visualizado por tinción de plata se combinaron diferentes entre las muestras procedentes de veneno de menores, adultos y subadultos B. Atrox (Fig. 1]. Su imagen asistida por ordenador análisis detectó 110 manchas en los geles de menores, 101 en el sub-86 en los adultos y adultos venenos. Entre las manchas detectadas, 44 se encuentran específicamente en los juveniles, sub-22 en adultos y 22 en adultos. Análisis de la imagen también se identificaron diferencias sustanciales en la abundancia relativa de varios spots en los tres coincide con imágenes (Tabla 1].

La identificación de las proteínas se trataron inicialmente por N-terminal de la secuencia de las proteínas borró a una membrana de PVDF utilizando la degradación de Edman. Debido a la relativamente baja sensibilidad de la degradación de Edman fiable secuencias de péptidos se recuperaron sólo de los más abundantes manchas. Por ejemplo, el grupo de los siete puntos de 23 kDa, más abundante en adultos (grupo D, Fig. 1], presentan la misma secuencia N-terminal (TPEQQRYVELLXVVD), donde X está a favor de una indeterminada de aminoácidos. Esta secuencia es el 73% idéntico al de un fragmento de los 23 kDa metaloproteinasas bothrolysin [sptrembl: P20416] (1 TPEHQRYIELFLVVD 15) y con un interior de la secuencia de los 50 kDa metaloproteinasas bothrostatin [sptrembl: Q98SP2] (188 TPEHQRYIELFLVVD 202), ambas de B . Jararaca. Sin embargo, la secuenciación de Edman no para identificar un polipéptido de 52 kDa que se ha detectado como las más abundantes en el terreno 2-DE mapa de adultos veneno (grupo A, Fig. 1].

En-gel resúmenes de los no identificados fueron más puntos analizados por el péptido masiva de huellas dactilares (PMF). Sólo unas pocas secuencias de longitud completa de B. Atrox proteínas están actualmente disponibles en una base de datos, y, por tanto, no es de extrañar que PMF búsquedas no proporcionó resultados significativos para cualquiera de los 2-DE manchas presentes en los geles. Sin embargo, este enfoque nos permitió grupo de manchas péptido cuya masa huellas digitales fueron similares. Sobre la base de los PMF de datos, todos los puntos se organizaron en 27 grupos. El 2-DE mapas de los juveniles, sub-adultos y adultos que muestran a los grupos que contienen manchas similares PMF espectros se muestra en la Fig. 1. Todos los grupos se han encontrado en el veneno de geles de menores mientras los adultos geles mostradas sólo 13 grupos, que revela cambios significativos de B. Atrox veneno proteoma durante el desarrollo ontogénico.

Un lugar de cada grupo se presentó a la secuenciación de proteínas por espectrometría de masas en tándem seguido de Mascotas y búsquedas en bases de datos MS BLAST (Fig. 2], que permitió identificar tanto a la proteína, o asignar a una clase de proteínas altamente homóloga. De esta manera, metaloproteinasas, L-amino oxidasas, serina proteinasas, cisteína ricos en proteínas secretoras (CRISPs), fosfolipasas A2, lectinas y se identificaron los factores de crecimiento (Tabla 1].

Habida cuenta de que muy pocas secuencias de B. Atrox proteínas están disponibles en una base de datos de secuencias, los mejores partidos de búsquedas en bases de datos MS BLAST correspondió a proteínas encontradas en venenos de otras serpientes, en su mayoría del género Bothrops (Tabla 1]. Desde varias proteínas de venenos de serpiente cuota de alta similitud de secuencia y péptidos analizados por MS / MS cubrir sólo una pequeña fracción de sus secuencias, que no es posible determinar inequívocamente la proteína homólogos de la secuencia de especies. MS / MS análisis de la mancha con aparente MW de 52 kDa (grupo A, Fig. 1 y Tabla 1] que estaba presente en cantidades similares en los adultos, sub-adultos y de menores geles se presenta aquí como un ejemplo. MS / MS secuenciación identificado como un miembro de la clase de P-III-Zn metaloproteinasas. El mejor se ajuste correspondió a la jararhagin y bothropasin, de alto peso molecular metaloproteinasas de B. jararaca, que comparten aproximadamente el 95% de identidad de secuencia. Una de las secuencias determinado (KINPFR) está presente en bothropasin, pero no en jararhagin y otro (BMYELANIVNEIFR) comparte el 100% de identidad con sólo jararhagin, porque hay una sustitución (F → L) en bothropasin. El resto de secuencias peptídicas (Tabla 1] están presentes en ambos bothropasin y jararhagin. Por lo tanto, los 52 kDa terreno está sin lugar a dudas relacionadas con un metaloproteinasas de la categoría P-III clase que se homóloga, aunque es distinto de los dos bothropasin y jararhagin.

Las proteínas del grupo C, cuyas masas moleculares son similares a las del grupo A, se identificaron como metaloproteinasas de la clase de P-III, aunque teniendo los valores más altos pI (7.1-7.5 comparar a pI 5 del grupo A). Ellos comparten dos secuencias peptídicas (BKIPCAPEDVK y BGMVLPGTK) con los polipéptidos del grupo A. Otros dos secuencias (BXXVEVGEECDCGSPR y BLYCCVDSSPANK) acompañado bothropasin sólo parcialmente, y otra secuencia (BXXGTECQAA) ocurre en metaloproteinasas de otras especies de víboras. A diferencia de un grupo, el grupo C, las proteínas son mucho más abundantes en los menores que los adultos, como se muestra en la Fig. 3.

Grupo D, uno de los más prominentes grupos de spots en geles de adultos, compuesto por varios isoformas de aproximadamente 23 kDa y pI pI rango entre 5,3 y 6,4 (Fig 3]. Por otra parte, sólo dos de estos puntos (en muy bajas cantidades) fueron detectables en geles de plata manchadas de menores veneno. Comparación de los tres geles sugirió que la concentración de 23 kDa isoformas aumentaron durante el desarrollo ontogénico (Fig. 3]. N-terminal de las secuencias de estas proteínas se determinaron por Edman degradación de las proteínas y se encontraron homólogas a bothrolysin y bothrostatin metaloproteinasas (véase más arriba). MS BLAST búsquedas con una consulta integrada de la secuencia peptídica propuestas obtenidas por la interpretación de novo de MS / MS espectros producidos como mejor bateó un P-II metaloproteinasas de la clase B. Insularis. El veneno de serpientes metaloproteinasas con masas moleculares 23-25 kDa, que se compone de un único metaloproteinasas de dominio, por lo general son asignados a la clase PI [4, 6]. Algunos PI clase son proteínas producidas por el procesamiento proteolítico de P-II metaloproteinasas, que son más grandes y contienen una desintegrin-como de dominio además de las metaloproteinasas de dominio [7]. Por lo tanto, el procesamiento proteolítico podría explicar la elevada similitud de las proteínas del grupo D con P-II metaloproteinasas de la clase. Los anuncios del grupo D, probablemente, corresponden a los 23 kDa polipéptido previamente purificado de B. Atrox veneno que constituían una única banda en SDS-PAGE [2]. Además ESI-MS experimentos sugiere que hay por lo menos tres isoformas de esta proteína en la B. Atrox veneno [2]. Aquí, 2-DE geles fueron capaces de resolver por lo menos siete isoformas en el veneno de los adultos. Imagen análisis de los geles mostró un notable aumento en el volumen de grupo D manchas de los menores a los adultos.

El grupo L compuesto por lo menos siete isoformas que eran abundantes en la delincuencia juvenil, menos abundante en el sub-adultos y adultos indetectable en venenos. Son homólogas a berythractivase, de 78 kDa P-III metaloproteinasas encontradas en la clase B. Erythromelas que es un activador protrombine que poseen una alta actividad pro-coagulante [8].

Las proteínas del grupo H también fueron identificados como metaloproteinasas y no se detectaron en adultos. Estas proteínas homólogas a BOJUMET II de la B. Jararacusu así como a berythractivase. Aunque las proteínas de los grupos L y M son a la vez homólogas a berythractivase, PMF y MS / MS datos indicaron que estaban, de hecho, diferentes proteínas en lugar de post-translationally modificado las formas de los mismos genes.

Otro grupo de manchas (B) con masa molecular gama de 55-61 kDa contiene varias isoformas presentes en cantidades similares en los tres diferentes muestras de veneno. Sus secuencias son homólogas a apoxin I, L-amino-oxidasa (LAO) de Crotalus adamanteus. LAO son los principales componentes de venenos de serpientes que causa la muerte celular por apoptosis [9].

Las proteínas de los grupos E, N, Q y R se identificaron como serin proteasas. El veneno de serpientes serin proteasas poseen trombina-como actividad y varios de ellos han sido aislados de venenos bothrópicos [4].

Las proteínas pertenecientes a la clase de proteínas secretoras Cystein Rich (CRISP) se identificaron en el grupo F, y se muestran expresión similar en las tres etapas de desarrollo analizados. El CRISPs se encuentran en epididimus células granulares y de los mamíferos y parece actuar de maduración de las células de los espermatozoides y las células del sistema inmunológico, aunque la función exacta de estas proteínas es desconocida [10]. Miembros de la familia CRISP aisladas de venenos de serpientes, como ablomin y trifilin, son los responsables de bloqueo de los músculos lisos contracciones inducidas por despolarización. Inmunológicos cribado utilizando antisuero anti-triflin identificado CRISPs en diferentes venenos de serpiente, aunque la reactividad cruzada fue relativamente baja en el único miembro de la Bothrops (B. jararaca) prueba género [10].

En el rango de bajo peso molecular (12-15 kDa), varias fosfolipasas A 2 (PLA 2) y C-tipo lectinas se encontraron. Dentro de estos grupos, hemos identificado por lo menos cuatro secuencias de la variante de la misma péptido presente en el tramo PLA 2 (VAVLCFR, AAAVCFR, VAATCFR y VAVLYSR), lo que indica un alto grado de polimorfismo de estas enzimas. Otros ejemplos de secuencias polimórficas péptido se observaron en los grupos W (más expresada en los juveniles y sub-adultos) y yo (adulto específicos). MS BLAST búsquedas producido éxitos como la mejor cadena alfa de la C-tipo lectina bothrocetin, aunque la secuencia de los péptidos y las PMF análisis mostró que las proteínas que contienen diferentes. Lectinas de tipo C también fueron identificados como los principales grupos de componentes en U y V. Curiosamente, los grupos H (adultos) y S (menores), a pesar de tener similar pI pI, peso molecular y algunas secuencias de péptidos, en realidad contenía diferentes lectinas tipo C - .

Proteínas homólogas a factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) de Bothrops insularis se detectaron en el grupo X y su abundancia disminuyó durante el desarrollo ontogénico (Fig. 1]. VEGFs venenos de serpiente se sabe que mejorar la permeabilidad vascular y desempeñar un papel importante en las etapas iniciales de envenoming por Bothrops. Se supone que el veneno de serpientes VEGFs, dstimulate la distribución del veneno que favorece tanto a nivel local como sistémico acciones [11].

Grupo Z está representada sólo una detectables terreno que se presente y ausente en los menores de los adultos. Se identificó como una mezcla de un factor de crecimiento del nervio (NGF) y un C-tipo lectina. NGF pertenece a una familia de factores neurotróficos, que son proteínas solubles endógenos que regulan la supervivencia, el crecimiento plasticidad morfológica o síntesis de proteínas para las funciones de las neuronas diferenciadas. Además, cada vez hay más pruebas de que la NGF actividades no se limitan al sistema nervioso, sino que también afectan a las células no neuronales, en especial los de origen de células madre hematopoyéticas. NGF se han descrito anteriormente en las tres principales familias de serpientes venenosas (Viperidae, Crotalidae y Elapidae). La ubicua presencia de NGF en venenos de serpientes sugiere un toxinological importancia de que la proteína en el sentido de la acción tóxica directa, indirecta o de la acción tóxica de una actividad en el contexto de la digestión presa [12].

Discusión

El proteoma composición de los venenos de serpiente altera con la edad y, por lo tanto, la etapa de desarrollo del organismo, que donó la muestra, debe tenerse en cuenta. Con este fin, hemos realizado un análisis comparativo de B. Atrox veneno proteoma en tres etapas de madurez. A nuestro entender, este es el primer análisis del proteoma de venenos de serpientes asociados a la ontogenia, aunque otros estudios proteómicos en el veneno de serpientes han sido publicados previamente [13, 14].

En una típica rutina proteómicos, proteínas están separados por 2-DE, visualizado por la plata o la tinción de azul de Coomassie [15] y manchas de proteínas en gel digerida con tripsina [16]. Una alícuota de la digerir es sometido a PMF MALDI-TOF por espectrometría de masas. Si no se logra la identificación concluyente, tríptico péptidos son extraídos de la matriz del gel y secuenciado por espectrometría de masas en tándem [17]. Sin embargo, en ambos enfoques identificación de proteínas que se requiera que la secuencia exacta de la proteína analizada está disponible en una base de datos. No obstante, sólo un pequeño número de B. Atrox proteínas están actualmente disponibles en una base de datos de secuencia y, por tanto, el ámbito de aplicación de la identificación de proteínas fue muy limitada. Para resolver este problema, que complementan los métodos convencionales de identificación de proteínas, que se basan en la concordancia exacta de los espectros de masas en tándem con la base de datos de secuencias, con similitud de secuencias de las búsquedas. Este último enfoque permitió que confía en la identificación de proteínas desconocidas que sólo alejadas de las proteínas conocidas de otras especies [18 - 20]. Mediante una combinación de estrictas y secuencia de similitud búsquedas en bases de datos, se identificaron los principales componentes de los venenos y trazado cambios en la abundancia de los distintos componentes de la proteína en ontogenetically alterado proteomes.

El polimorfismo natural de las secuencias de proteínas, junto con la falta de una completa y anotada serpiente genoma, que podrían utilizarse como referenceid no permitir la asignación inequívoca de la mayoría de las proteínas relacionadas con homólogos debido a la baja cobertura de secuencia. Sin embargo, el grupo de tareas específicas, sobre la base de secuencias de los péptidos, fue siempre fiable.

Basándose en el análisis de las huellas dactilares en masa péptido que clasifican los puntos de los 2 mapas-DE en 27 grupos. La mayoría de los grupos y las personas con mayor número de puntos corresponde a proteinasas (metallo y serina proteinasas). Este resultado coincide con el hecho de que los venenos de las especies Bothrops son haemotoxic y promover la hemorragia primaria a la extensa inflamación y necrosis local [14].

El proteoma mapas también permitió la identificación de nuevos grupos de potenciales marcadores moleculares ontogenéticas. Por ejemplo, hemos detectado que algunos grupos de proteínas P-incluyendo metaloproteinasas de la clase III (L, M, O y P), serin proteasas (N, Q y R) son más abundantes en los especímenes de menores, mientras que PI metaloproteinasas de la clase (grupo D ) Son más expresados en adultos.

En general, varios grupos de proteínas se identificaron en el proteoma mapas de los menores, que en adultos. Proteome mapas de sub-adultos de los dos puntos que figuran los juveniles y adultos, junto con una fase específica de algunos puntos. Anteriores trabajos sugiere que la B. El horror de los individuos jóvenes venenos más potentes desencadenar efectos biológicos de los adultos venenos [2, 5]. La disminución de la actividad hemorrágica en el B. Atrox venenos durante el desarrollo ontogénico puede explicarse por los niveles más bajos de Zn-metaloproteinasas de la clase de P-III en la comparación de los adultos a los menores. Por otro lado, la mayor concentración de berythractivase, un pro-activador de la trombina, pueden reflejar la mayor actividad coagulante de los menores venenos. El efecto de VEGFs, NGFs y CRISPs, más se expresa en todos los especímenes jóvenes, sin duda también contribuirá a la mayor actividad farmacológica de los menores veneno.

La diversidad en la composición de proteínas y actividad biológica de los venenos de serpiente en período de crecimiento puede estar relacionada con la adaptación de los procesos evolutivos con el tipo y tamaño de la presa [21 - 24]. Young serpientes Bothrops preferentemente comen anfibios, lagartos, aves y mamíferos a cambio cuando se conviertan en adultos [25]. Por lo tanto, los cambios cualitativos y cuantitativos en la B. Atrox veneno proteoma es más probable en relación con la supervivencia de la serpiente por la presa de adaptación.

Conclusión

Hemos establecido proteoma mapas para el veneno de B. El horror en tres diferentes etapas de desarrollo, es decir, juvenil, sub-adultos y adultos. Análisis de los mapas proteoma confirmó que B. Atrox veneno proteoma altera significativamente con la edad del animal. Por otra parte, hemos verificado la existencia de la etapa específica y diferencialmente expresado polipéptidos que pueden ser responsables de las diversas actividades de la veneno en cada etapa de desarrollo analizados.

El proteoma de cualquier muestra biológica se prevé que cambiará de forma dinámica en respuesta a estímulos externos. Los cambios en la B. Atrox veneno proteoma informó refuerzan la necesidad de intensificar los estudios sobre los organismos en diferentes etapas de maduración. Este procedimiento puede dar lugar al descubrimiento de un grupo más amplio de moléculas de interés médico y biotecnológico, así como a una mejor comprensión de la importancia biológica de los rasgos del organismo durante su ontogenia.

Por último, dentro de la misma especie variaciones en la composición de los venenos de serpiente durante la ontogenia impulsa nuevos estudios de la relación entre la sintomatología de los accidentes de mordedura de serpiente en los seres humanos con la composición del veneno, así como el uso de venenos de los especimenes, de distintas edades, para la producción de Antivenenosos.

Métodos
Venenos de serpiente

Ponzoñas se obtuvieron a partir de especímenes silvestres Bothrops atrox sin relaciones conocidas hojarasca, capturado en la región de Manaus (Estado de Amazonas, Brasil), y mantenerse en el Herpetarium de la Gerência de Animais Peçonhentos-IMT-AM, de Manaus. Clasificación de los B. Atrox serpiente especímenes se hizo sobre la base de la longitud total de especímenes silvestres, de acuerdo a Martins y Oliveira (1998) [26]. Por lo tanto, tres clases de tamaño fueron definidos: los jóvenes (≤ 40 cm), sub-adultos (> 40 - 70 cm), y adultos (> 70 cm). Veinte días después de las serpientes fueron capturados y antes de su primera alimentación en cautividad, los venenos son ordeñadas a mano por masajear las glándulas de veneno que los especímenes más largo 50 cm, y con la ayuda de una pipeta Pasteur sobre serpientes de menos de 50 cm. Una sola extracción se realizó para cada espécimen. Tres tipos de muestras se agruparon veneno preparado, de menores, de los venenos de ocho especímenes, sub-adultos, correspondiente a veinte y cinco especímenes adultos, una mezcla de venenos de doce especímenes. El veneno combinaron muestras fueron centrifugadas, filtradas, liofilizado, ponderada y almacenados a -20 ° C.

Bidimensional en gel de electroforesis

Congelación secos combinados veneno muestras (100 μ g de plata manchada geles y 300 μ g de azul de Coomassie manchadas geles) se solubilizado en 370 μ l de 2-DE buffer de muestras (7M urea, 2M thiourea, TDT 1%, 2% Tritón X-100, 0,5% Pharmalyte 3-10) que contienen inhibidores de proteinasa (100 μ M PMSF, 1 μ M pepstatin A y 5 mM EDTA) y se aplica a 18 cm de gel de tiras de IPG (GE Healthcare, Upsala, Suecia), que contiene lineales o no lineales, 3-10 pH Por gradiente en la muestra de rehidratación-gel [27]. Después de 12 h de la rehidratación en la solución de muestra, centrándose isoeléctrico (IEF) se llevó a cabo a 20 ° C utilizando una unidad IPGphor (GE Healthcare), en tres etapas sucesivas: 500 Vh, 1000 Vh y 32000 Vh. Para la reducción y alquilación IPG gel tiras se sumergen durante 30 minutos en una solución que contenga 50 mM Tris pH 8,8, 6 M urea, el 30% de glicerol, 2% SDS y 125 mM TDT y por un período adicional de 30 minutos en la misma solución tampón que contiene 125 MM iodoacetamide y azul de bromofenol en lugar de la TDT. SDS-PAGE se realizó en el 10-20% T gradiente de geles de poliacrilamida en un sistema de proteiforme II (Bio Rad, Hercules, CA, EE.UU.), conectado a un baño de refrigeración Multitemp II (GE Healthcare). Electroforesis se realizó a corriente constante (25 mAmp por gel) a 20 ° C hasta que el colorante frente encuentra en el extremo inferior del gel.

2-DE geles que contienen 100 μ g de veneno estaban manchadas de plata [28] y se presentó al análisis de imágenes. Alternativamente, 2-DE geles que contienen 300 μ g de veneno se tiñeron con el 0,1% (w / v) Coomassie Azul en el 40% (v / v) de metanol, el 10% (v / v) de ácido acético y distained con la misma solución sin Coomassie Azul.

Análisis de la imagen

Plata manchada geles fueron escaneados con un SHARP JX-330 escáner (Tokio, Japón) a 300 dpi de resolución y TIFF, las imágenes generadas se analizaron con la imagen 2D Master Elite software (GE Healthcare). Spot de detección in situ y se pongan en venta se realizaron en el modo automatizado. Spot volúmenes fueron adquiridos sin antecedentes y resta normalizada utilizando el total de la intensidad de las manchas detectadas.

Digestión de las proteínas

Coomassie manchadas manchas fueron extirpados de la preparatoria y en gel-gel digerida con tripsina como se describe en [15].

Péptido masiva de huellas dactilares

Proteína se digiere primero sometido a péptido masiva de huellas dactilares por láser asistida por matriz de desorción / ionización en un Bruker Reflex IV tiempo de vuelo (MALDI-TOF) espectrómetro de masas con fuente de iones Scout 384. Sondas fueron preparadas por secado de las gotas de método, tal como se describe anteriormente [29]. En pocas palabras, 1 μ L alícuota de la digerir fue mezclado en la superficie de AnchorChip ™ 384/600 metas (Bruker Daltonics, Alemania) con una disolución saturada de la matriz (α-cyano-4-hydroxycinnamic ácido) en 1: 2 (v / v ) Solución acuosa del 2,5% TFA: acetonitrilo. La mezcla se deja secar a temperatura ambiente y todo el objetivo fue lavado con 5% de ácido fórmico.

Spots péptido cuyas huellas digitales fueron similares en masa, es decir, comparte más del 75% de los picos con la intensidad relativa de más del 20% de la masa dentro de la precisión de + / - 100 ppm, después de la eliminación de las crestas de la tripsina autolisis productos contaminantes y conocidos de queratina, se Agrupados como se muestra en la Fig 1.

Nanoelectrospray secuenciación por espectrometría de masas en tándem

Si péptido masiva de huellas dactilares no identificó las proteínas, péptidos se extrajeron de las piezas de gel con 5% de ácido fórmico y acetonitrilo y los extractos se agruparon y se seca en una centrífuga de vacío. Los resúmenes se recoge en el 5% y ácido fórmico nanoelectrospray analizados por espectrometría de masas en tándem en un híbrido cuadripolares tiempo de vuelo instrumento QSTAR i Pulsar (MDS Sciex, Canadá) que se describió anteriormente [30, 31].

Búsqueda en bases de datos

Péptido masa huellas digitales se utilizaron para búsqueda en bases de datos usando software Mascotas (Matrix Science Ltd, UK) en contra de la base de datos MSDB (actualizado 15 de mayo de 2005; secuencia de la proteína que contiene 2.011.425 registros) descargados de NCBI. Misa tolerancia se fija en 100 ppm, espectros fueron calibrados externamente y no se impusieron restricciones sobre la masa molecular de proteínas o linaje filogenético. Uninterpreted de masas en tándem espectros fueron registrados por Mascotas contra la citada base de datos para identificar proteínas con péptidos idénticos tríptico entradas a la base de datos. Precursor en masa tolerancia se fijó en 0,1 Da fragmento de iones y masa tolerancia en el 0,05 Da. Hits Se consideró significativo si sus proteínas Resultado superó el umbral Resultado calculado por el software Mascotas asumiendo p <0,05. Coincidentes MS / MS espectros fueron más inspeccionado manualmente considerando la correlación de y-, b-y un fragmento de iones [32] correspondientes a m / z calculado a partir de las secuencias de péptidos. Si todavía no se logró la identificación, los espectros de masas en tándem se interpretaron novo BioAnalyst QS utilizando el software como ha sido descrito previamente [31]. Múltiples secuencia de los candidatos se les permitió por cada interpretarse espectro de masas en tándem y parcial péptido secuencias se incluyeron en la búsqueda. Todos los candidatos secuencias se fusionaron en una sola cadena de búsqueda y MS BLAST búsquedas se realizaron en contra de un no-proteína de la base de datos redundante (nrdb) en http://genetics.bwh.harvard.edu/msblast/ o http://dove.embl- Heidelberg.de/Blast2/msblast.html en virtud de la configuración por defecto. Analizar el script de funcionamiento en el sitio web de MS BLAST se aplicó a identificar y código de color estadísticamente confía hits según MS BLAST sistema de puntuación [20]. Según el seleccionado MS BLAST umbral resultados de confianza estadística, la tasa de falsos positivos de identificación, fue menor al 1%.

Abreviaturas

2-DE: bidimensional en gel de electroforesis, IPG: gradiente de pH inmovilizados, CRISP: Cystein Rich proteínas secretoras, PLA 2: fosfolipasa A 2, VEGF: factor de crecimiento endotelial vascular, NGF: factor de crecimiento del nervio, la FEI: isoeléctrico centrándose, la TDT: Dithiotreitol, PMSF: phenylmethyl sulfonyl fluoruro, EDTA: ácido ethylenediaminetetraacetic.

Conflicto de intereses

Los autores declaran que no tienen intereses en conflicto.

Contribuciones de los autores

RAPG-Participó en 2D-PAGE, secante de proteínas, análisis de datos y redacción del manuscrito.

Anna S - Péptido masiva de huellas dactilares, MS / MS análisis y la búsqueda en bases de datos.

Andrej S-Base de datos de la búsqueda y el análisis de datos. Participó en la redacción del manuscrito

JLLP de recogida de animales, veneno de la preparación de la muestra y debate general de los resultados

J. P-Optimización de las condiciones de 2D-PAGE y computacionales de análisis de imágenes

MVS-Participó en el diseño del estudio, la coordinación y la escritura.

CAOR-Diseño experimental, análisis de datos y la coordinación. Preparación de la versión final del manuscrito.

Todos los autores leído y aprobado el manuscrito final.

Agradecimientos

Esta labor fue apoyada por PADCT / MCT y FINEP (CT-INFRA). Una beca de la CAPES fue otorgado a Rafael A. Pontes Guércio.