BMC Cancer, 2006; 6: 131-131 (más artículos en esta revista)

Somáticos BVS alteraciones genéticas en el MEN2 asociada a carcinoma medular de tiroides

BioMed Central
A Christian Koch (ckoch@medicine.umsmed.edu) [1], Frederieke M Brouwers (brouwerf@mail.nih.gov) [3], Alexander O Vortmeyer (vortmeyera@ninds.nih.gov) [4], Andrea Tannapfel (Andrea.tannapfel @ rub.de) [5], Steven Libutti K (libuttis@mail.nih.gov) [6], Zhengping Zhuang (zhuangz@ninds.nih.gov) [4], Karel Pacak (karel @ mail . Nih.gov) [3], Hartmut PH Neumann (neumann@Medizin.Ukl.Uni-Freiburg.De) [7], Ralf Paschke (ralf.paschke @ medizin.uni-leipzig.de) [1]
[1] División de Endocrinología y Nefrología, de la Universidad de Leipzig, Philipp-Rosenthalstr. 27 04103 Leipzig, Alemania
[2] de la División de Endocrinología de la Universidad de Mississippi Medical Center, 2500 N Str Estado, Jackson, MS 39216, EE.UU.
[3] Reproductive Biology and Medicine Branch, National Institute of Child Health and Human Development, National Institutes of Health, Center Drive, Building 10, Bethesda, MD 20892, USA
[4] Surgical Neurology Branch, National Institute of Neurological Disorders and Stroke, National Institutes of Health, Center Drive, Building 10, Rm 5D37, Bethesda, MD 20892, USA
[5] Instituto de Patología, Ruhr-Universität Bochum den un BG Kliniken Bergmannsheil, Bürkle-de-la-Camp-Platz 1, 44789 Bochum, Alemania
[6] Subdivisión de Cirugía, Centro de Investigación del Cáncer, Instituto Nacional del Cáncer, 10 Center Drive, Room 4W-5940, Bethesda, MD 20892, EE.UU.
[7] de la División de Nefrología e Hipertensión, Albert-Ludwigs-Universitaet de Friburgo, Hugstetter Str. 55 79106 Freiburg, Alemania

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Resumen
Antecedentes

RET mutaciones germinales son responsables de la neoplasia endocrina múltiple tipo 2 (MEN2), autosómica dominante, síndrome de cáncer hereditario que se caracteriza por carcinoma medular de tiroides (MTC), feocromocitoma, hiperplasia paratiroidea y / adenoma. Estudios recientes sugieren un "segundo éxito" mecanismo resulta en la amplificación de mutantes RET. BVS alteraciones somáticas de genes están implicados en la patogénesis de MEN2 feocromocitomas. La hipótesis de que las alteraciones somáticas BVS genes también son importantes en la patogénesis de MEN2 asociadas-MTC.

Métodos

Se analizaron 6 MTCs y 1 C-hiperplasia de las células (CCH) espécimen de 7 pacientes con MEN2A y RET germinal mutaciones en los codones 609, 618, 620, o 634, utilizando microdissection, análisis de microsatélites, phosphorimage densitometría, BVS y análisis de mutaciones.

Resultados

En primer lugar, hemos buscado un desequilibrio entre alélica mutante y de tipo salvaje RET utilizando marcadores polimórficos de la D10S677, D10S1239, y RET de tejido tiroideo de estos pacientes. Las pruebas de amplificación de RET por esta técnica se pudo demostrar en 3 de 6 MTCs. A continuación, el análisis realizado LOH utilizando D3S1038 y D3S1110 mapa para que la BVS gen locus en 3p25/26. BVS gen de supresión estuvo presente en 3 MTCs. Estos 3 MTCs tenido también un desequilibrio entre alélica mutante y de tipo salvaje RET. Los análisis de la mutación de genes de la BVS frameshift mostraron una mutación somática en 1 MTC que también demostró LOH en 3p25/26. En los otros 2 con MTCs alélica desequilibrio de RET y supresión de genes somáticos BVS, BVS mutación somática no pudo ser detectado. El CCH espécimen hizo ni revelar RET desequilibrio ni alteraciones de genes somáticos BVS.

Conclusión

Estos datos sugieren que una mutación germinal RET es necesaria para el desarrollo del CCH, que alélica desequilibrio entre la mutante y de tipo salvaje RET tumorigénesis puede provocar tensiones, y que las alteraciones somáticas BVS gen no podrá desempeñar un papel importante en la tumorigénesis de MEN2A asociadas-MTC.

Antecedentes

Carcinoma medular de tiroides (MTC) se desarrolla a partir de la C parafollicular células de la glándula tiroides y se produce de forma esporádica, así como en el síndrome hereditario neoplasia endocrina múltiple tipo 2 (MEN2). El gen responsable de la MEN2 es el protooncogen RET, localizado en el cromosoma 10q11.2 [1, 2]. Los pacientes con mutaciones en línea germinal RET invariablemente desarrollar MTC, a pesar de que hay algunos pacientes con mutaciones germinales RET que han vivido más allá de los 70 años de edad sin MTC [3, 4]. Por lo tanto, los pacientes con mutaciones en línea germinal RET por lo general se dividen en diferentes grupos de riesgo (bajo, intermedio y alto riesgo para el desarrollo de MTC). Las llamadas de bajo riesgo o nivel I incluyen las mutaciones en los codones 609, 768, 790, 791, 804, y 891 [1, 5 - 8]. Hiperplasia de las células C parafollicular ha sido considerado como el precursor del Comité de Transporte Marítimo de la lesión [9, 10]. La acumulación de pruebas indica que una "segunda pasada" o eventos genéticos adicionales pueden ser necesarias para compensar las células sensibles en la tumorigénesis de los pacientes con mutaciones germinales RET. Un desequilibrio entre alélica mutante y de tipo salvaje RET puede representar el paso decisivo de la tumorigénesis de MTC y feocromocitoma [11 - 15]. BVS alteraciones somáticas de genes están implicados en la patogénesis de MEN2-feocromocitomas asociados, posiblemente a través de la acumulación de proteína RET [16]. Por lo tanto, la hipótesis de que las alteraciones somáticas BVS gen también pueden desempeñar un papel en la patogénesis de MEN2 asociadas-MTC.

Métodos
Pacientes y tejidos

Siete pacientes con MEN2A y RET germinal mutaciones en los codones 609 (4 pacientes, Leipzig), 618 (1 paciente, San Luis), 620 (1 paciente, San Luis), o 634 (1 paciente, NIH) fueron sometidos a tiroidectomía total en La Universidad de Washington en St Louis, MO, los Institutos Nacionales de Salud en Bethesda, y la Universidad de Leipzig, Alemania. En 6 pacientes, se diagnosticó MTC, 1 paciente había hiperplasia de las células C (Cuadros 1 y 2]. Ninguno de los pacientes tenían evidencia clínica de síndrome de la BVS y se analizó para germinal mutaciones en el gen BVS.

Dos ejemplares (casos 1 y 2 en la Tabla 1] fueron previamente analizados por el desequilibrio de la mutante y de tipo salvaje RET alelo (ver Ref. [12]].

Congelados o parafina de los tejidos incrustados y microdissected fue analizado por la pérdida de heterozigosidad (LOH) de los marcadores polimórficos de la cartografía a la BVS gen locus, como ha sido descrito previamente [16].

De tejido se obtuvo de estos 7 pacientes internos en virtud de una Junta de Revisión (IRB)-protocolo aprobado en los Institutos Nacionales de Salud. Todos habían MEN 2A con una mutación germinal en RET. La sangre fue extraída para la extracción de ADN. Tiroides especímenes incluidos MTC se eliminaron en el momento de la cirugía y congeladas a -80 ° C. Se extrajo el ADN de muestras de tejido tumoral y linfoblastos por métodos estándar.

Seis micras secciones se obtuvieron a partir de tumor congelado brevemente y teñidas con hematoxilina y eosina (H & E). Si no se dispone de tumor congelado, tejidos embebidos en parafina y se preparó para microdissection. En virtud de la luz directa visualización microscópica utilizando un aguja de calibre 30, una modificación microdissection procedimiento se realizó, como ha sido descrito previamente [17]. En todos los casos, se obtuvieron también muestras de tejido nontumor control de la misma diapositivas.

Alélica desequilibrio de los genes RET locus y de la pérdida de heterozigosidad de la BVS gen locus

Se realizó análisis de desequilibrio de RET, usando marcadores polimórficos / primers D10S677, D10S1239, y RET para la RET locus, y la pérdida de heterozigosidad estudios utilizando marcadores D3S1038 y D3S1110 mapa para que la BVS gen locus 3p25/26 en presencia de [alfa - 32 P] dCTP (0,1 μ Ci / μ l) (Dupont). Condiciones de PCR utilizando AmpliTaq Gold ADN polimerasa (Perkin Elmer Roche) en un Hybaid Omnigene termociclador fueron las siguientes: desnaturalización inicial a 95 ° C durante 10 minutos, luego 35 ciclos, cada uno con 1 minuto de desnaturalización a 95 ° C, 1 min de Recocido a 55 ° C durante RET marcadores, a 60 ° C durante BVS marcadores, y 1 min de extensión a 72 ° C; PCR se completó con una extensión final a 72 ° C durante 10 min. Los amplicones se resolvieron en un gel de poliacrilamida 6%. Geles fueron secados y expuestos a la película Kodak XAR. Todas las reacciones de PCR se realizaron por triplicado.

BVS análisis de mutaciones de genes

Exones 1-3 de la BVS gen se ampliaron de ADN genómico utilizando la reacción en cadena de polimerasa condiciones descritas en otra parte [18]. Mutación de escaneado por electroforesis en gel de conformación sensibles (CSGE) se realizó en los productos PCR descrita por Ganguly et al. [19]. Análisis de secuencias de ADN se realizó con un ciclo de la secuencia kit con marcado tinte terminadores (PE Advanced Biosystems, Inc, Foster City, CA). Secuencias fueron analizadas en un ABI 377 automatizados secuenciador de ADN.

Resultados

Se estudiaron 6 carcinoma medular de tiroides y 1 C-hiperplasia de las células espécimen de 7 pacientes con MEN 2A y conocido RET germinal mutaciones alélicas de desequilibrio en la RET y locus de alteraciones genéticas somáticas en la BVS gen locus en 3p25/26 incluidos LOH y mutaciones ( Tabla 1]. Alélica desequilibrio entre el mutante y de tipo salvaje RET alelo podría ser demostrado en 3 MTCs (Fig. 1]. El mismo 3 tumores también ha LOH de la BVS gen locus (Fig. 2].

Para investigar más a fondo si la inactivación de la BVS gen supresor tumoral juega un papel en la tumorigénesis de MEN 2A relacionadas con el MTC, se realizó el análisis de mutaciones de genes de la BVS y encontraron mutaciones en al menos 1 de la C-7 especímenes de células (Figs. 3 y 4, Tabla 1]. Los análisis de la mutación de genes de la BVS frameshift mostraron una mutación en 1 MTC. Este tumor ha LOH simultáneamente en la BVS gen RET y locus (caso 1 en el Cuadro 1]. Otro tumor (caso 2) tuvo LOH en el gen RET y BVS locus pero no BVS mutación somática. En los casos 3 y 4, el análisis de mutaciones de la BVS no puede ser completamente realizado (exón 1 se analizó y negativos de las mutaciones; exones 2 y 3 no puede ser analizado) debido a problemas técnicos y no salió más del ADN. Los casos 5 y 6 (MTC), así como caso 7 (CCH) no tenía ni LOH en RET o BVS ni mutaciones somáticas de la BVS.

Discusión

En este estudio, mostramos que la BVS mutación somática y supresión están implicados en la progresión tumoral y no tumoral inicio de MEN 2A relacionados con la MTC. En ambos esporádicos y formas familiares de MTC, pérdidas alélicas en 1p, 3, 4, 9q, 10q, 13q, 22q y se han comunicado [20 - 24]. Específicas de los genes supresores de tumores o los oncogenes cromosómicas en estos lugares, sin embargo, rara vez han sido analizadas.

En feocromocitomas esporádicos, mutaciones somáticas de la BVS RET o se encuentran en menos del 10% de los tumores, lo que sugiere un posible papel en la tumorigénesis, mientras que la prevalencia y la función de tales mutaciones hereditarias en feocromocitomas como las que se producen en MEN 2 no es conocida. En un estudio reciente, hemos detectado inactivación de las mutaciones somáticas de la BVS y LOH en 3p25/26 en varios MEN 2A relacionados con feocromocitomas [16]. En todos estos MEN 2A-feocromocitomas asociados, así como en el presente estudio de muestras de células C del tiroides, ordinario de tipo salvaje BVS alelos fueron detectados en el tejido normal de control que confirma la presencia de dos alelos de tipo salvaje y exclusión de la presencia de la enfermedad BVS .

BVS enfermedad consiste en una variedad de tumores incluyendo feocromocitoma [25, 26]. Sin embargo, el MTC no es parte del síndrome de la BVS, aunque se encontró MTC (que casualmente) en 2 pacientes con mutación germinal BVS [27]. BVS mutaciones en el gen conducen a la expresión constitutiva de muchos genes inducidos por la hipoxia, en la parte relacionada con el aumento de los niveles de hipoxia-inducible factor de transcripción (HIF) 1-alfa en las células normales, que es rápidamente degradada y ubiquitinated [28]. BVS proteína, un adaptador de ubiquitinase, juega un papel en el control del ciclo celular, la diferenciación, la formación de la matriz extracelular y el volumen de negocios, y de la angiogénesis. Por lo tanto, las mutaciones en la BVS puede conducir a una ausencia o reducción de la BVS función de la proteína con la reducción de la degradación de las proteínas incluidas RET proteína. Además de otros eventos, RET secundario a la acumulación de proteínas de ausencia o reducción de la BVS proteína, puede causar aún más la transformación de determinados parafollicular C-células.

Aunque una "segunda pasada", que generalmente consiste en la supresión de tipo salvaje BVS alelo, es necesaria la apertura del crecimiento tumoral en los pacientes con mutaciones BVS germinal, que puede no ser suficiente [26, 29, 30]. Del mismo modo, en pacientes con MEN2, una mutación germinal RET es necesario para la formación del Comité de Transporte Marítimo y feocromocitoma, pero puede no ser suficiente, ya que hay pacientes que nunca han desarrollado MTC o feocromocitoma durante su vida o desarrollados MTC tarde en su vida [3, 4, 31 - 33]. En este sentido, la BVS somáticas detectado alteraciones genéticas en 3 de 6 MTCs de MEN2A los pacientes y no la alteración genética somática BVS en 1 paciente con MEN2A y CCH. Además, todos los 3 MTCs con LOH en la BVS gen también había desequilibrios alélicos de RET. Sin embargo, en sólo uno de estos MTCs, una mutación somática BVS se encontró además de LOH en la BVS gen. En nuestro único caso de los CCH, no hay desequilibrio entre la mutante y de tipo salvaje RET y se ha detectado ninguna alteración genética somática BVS. Por lo tanto, mutaciones somáticas adicionales, incluyendo la BVS genes pueden ser necesarios para poner fuera de la tumorigénesis en pacientes con mutaciones germinales RET. CCH focos heterogéneos de ADN han incluido LOH supresiones de TP53, RB1, y WT1 [34]. Polimorfismos G691S/S904S de RET Recientemente se han encontrado para afectar el desarrollo de la MTC y la edad de inicio de síntomas de MEN2A en pacientes con una mutación germinal RET [35 - 37]. Elisei et al. [36] encontraron una estadísticamente significativa mayor frecuencia alélica del polimorfismo G691S en MTCs de que se encuentra en los controles normales. Cebrian et al. [37] llevó a cabo una asociación de estudio en 135 pacientes esporádicos MTC y 533 controles y descubierto una fuerte asociación entre la enfermedad y los haplotipos específicos de RET. RET mutaciones somáticas como el M918T en el MTC feocromocitoma o de los pacientes con una mutación germinal RET parecen representar un fenómeno de la progresión tumoral [38 - 43]. Cromosómicas desequilibrios en el MTC incluyen deleciones de los cromosomas 1p, 3q26.3-q27, 4, 9q13-q22, 13 q, y 22q [24]. Marsh et al. [24] encontró la pérdida total o parcial de los cromosomas 3, incluso la región de la BVS como el locus desequilibrio predominante (40% de los casos). Bialélicas inactivación de la BVS debe conducir a la pérdida de proteína de la BVS. El uso de inmunohistoquímica, la BVS es la proteína detectables en el folículo y diferenciado de tiroides tumores derivados de epitelio folicular, pero es débilmente o no detectables en nonneoplastic y células neoplásicas C [44]. Dado que, en nuestro estudio, ni desequilibrios alélicos de RET ni alteraciones de genes somáticos BVS ocurrido en el CCH espécimen (presumiblemente la lesión precursora de la MTC), le sugerimos que esas alteraciones genéticas somáticas BVS y no desempeñar un papel en la progresión tumoral, que en la formación de tumor MEN2 relacionados con la MTC. Esta interpretación se basa en un único caso de los CCH y requeriría la confirmación de los estudios de mayor tamaño.

Conclusión

La formación de tumor en estos seleccionados MEN 2A relacionados con MTCs puede haber ocurrido en primer lugar, una mutación germinal RET, dando lugar a la hiperplasia de las células C, y en segundo lugar, una amplificación en caso de mutante RET, que, sin embargo, no puede ser detectado consistentemente por los métodos utilizados por Nosotros (análisis de marcadores polimórficos). BVS somática posterior eliminación y mutación de genes seleccionados en las células C puede conducir a la ulterior transformación y progresión tumoral. Sin embargo, dado el pequeño tamaño de la muestra, es posible que la formación y la progresión del tumor en un número importante de tumores se pueden producir por otros mecanismos.

Abreviaturas

MTC - carcinoma medular de tiroides; CCH - c hiperplasia de las células; MEN2 - neoplasia endocrina múltiple tipo 2, LOH - pérdida de heterozigosidad; BVS - von Hippel Lindau

Conflicto de intereses

Los autores declaran que no tienen intereses en conflicto.

Contribuciones de los autores

CAK diseñado este estudio, llevado a cabo experimentos relacionados con el banco de este estudio, interpreta los resultados, redactó el documento, y finalizado el manuscrito después de las aportaciones de los otros autores.

FBM ayudado a llevar a cabo experimentos relacionados con la bancada de este documento. AOV siempre microdissection de material utilizado para este estudio, ayudaron en la interpretación de los resultados y la redacción del documento mediante el suministro de insumos críticos intelectual. AT proporcionado material para este libro, y ayudó a redactar el documento. SKL proporcionado material para este libro, y ayudó a redactar el documento.

ZZ ayudado en la interpretación de los resultados de este estudio. KP ayudó proporcionando el material necesario para la redacción de este documento y el documento. HPHN ayudado en la realización de experimentos y banco de la redacción del documento. RP creó aportación intelectual en la redacción del documento. Todos los autores leído y aprobado la versión final del manuscrito.

Historia previa a la publicación

La historia previa a la publicación de este documento puede accederse en:

Agradecimientos

Damos las gracias a Jeffrey Moley, MD, de la Universidad de Washington en San Luis, para el suministro de muestras del Comité de Transporte Marítimo (aquí: los casos 1 y 2), y Catherine Stolle, PhD, de la Universidad de Pennsylvania Escuela de Medicina, para el análisis de muestras para la BVS mutaciones . También damos las gracias a Celso Gómez-Sánchez, MD, de la Universidad de Misisipí, para el apoyo técnico.