Molecular Cancer, 2006; 5: 14-14 (más artículos en esta revista)

Aconitasa mitocondrial en el metabolismo de citrato y malignos de próstata y tejidos humanos nonmalignant

BioMed Central
Keshav Singh K (keshav.singh @ roswellpark.org) [1], Mohamed M Desouki (mohamed.desouki @ duke.edu) [1], Renty B Franklin (rfranklin@umaryland.edu) [3], Leslie C Costello ( Lcostello@umaryland.edu) [3]
[1] Department of Cancer Genetics, Roswell Park Cancer Institute, Buffalo, NY 14263, USA
[2] Department of Pathology Duke University Medical Center, Durham, NC 27710, USA
[3] Department of Biomedical Sciences, University of Maryland, Baltimore, MD 21201, USA

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Resumen
Antecedentes

En el cáncer de próstata, que producen normal citrato de células epiteliales glandulares secretoras someterse a una transformación metabólica de citrato malignas las células-oxidantes. M-Aconitase es el paso crucial que participan en el metabolismo de citrato de esta alteración que es esencial para la neoplasia de próstata. El m-aconitasa limitación de la actividad en las células epiteliales de próstata podría ser el resultado de un menor nivel de m-aconitasa enzima y / o la inhibición de los actuales m-aconitasa. Algunos estudios han identificado el zinc como un inhibidor de la m-aconitasa actividad de las células en la próstata, y que el agotamiento de zinc en las células malignas es un factor importante en esta transformación metabólica. Sin embargo, sigue siendo una posibilidad de que una expresión alterada y el nivel de los m-aconitasa enzima también podrían estar involucrados en esta transformación metabólica. Para resolver este problema, el nivel de in situ m-aconitasa enzima fue determinada por el análisis inmunohistoquímico de tejido de cáncer de próstata secciones y líneas de células malignas de próstata.

Resultados

El procedimiento de inmuno identificados con éxito la presencia de m-aconitasa localizada en el compartimiento mitocondrial en el PC-3, LNCaP, y DU-145 líneas de células malignas de próstata. El examen de las secciones de tejido de la próstata cáncer de próstata temas demostrado que m-aconitasa enzima está presente en el epitelio glandular normal de las glándulas, las glándulas hiperplásicas, adenocrcinomatous glándulas, y intraepitelial prostática neoplásicas focos. Análisis cuantitativo del nivel relativo de m-aconitasa en el epitelio glandular de citrato de las glándulas productoras de adenomatosa frente a la citrato-oxidantes adenocarcinomatous glándulas no reveló diferencias significativas en la m-aconitasa niveles de la enzima. Esto es en contraste con la baja regulación de ZIP1 zinc transportista en el frente maligno glándulas hiperplásicas glándulas que existe en las mismas muestras de tejidos.

Conclusión

Los resultados demuestran la existencia de m-aconitasa enzima citrato en la productora de las células del epitelio glandular, de manera que con deficiencia de la enzima m-aconitasa no está asociada a la limitación de m-aconitasa actividad que evita la oxidación de citrato en estas células. El nivel de m-aconitasa se mantiene en las células malignas, de modo que una enzima alterada nivel no tiene relación con el aumento de m-aconitasa actividad. En consecuencia, el elevado nivel de zinc que inhibe la enzima m-aconitasa es responsable de la alteración de la oxidación de citrato en la hiperplasia de próstata normal y las células del epitelio glandular. Además, la baja regulación de ZIP1 transportador de zinc y de la correspondiente disminución de zinc resultados en el aumento de la actividad de la m-aconitasa existentes en la actividad de las células malignas de próstata. Los estudios ahora definir el mecanismo para la transformación metabólica que caracteriza a la transición fundamental de la normalidad de la producción de citrato de células epiteliales malignas de las células citrato-oxidantes.

Antecedentes

En el cáncer de próstata (CaP), la neoplasia se desarrolla principalmente del epitelio glandular de la próstata zona periférica. Una de las principales característica y persistente que distingue a los tejidos normales de la próstata maligno de tejido de la próstata es el citrato extraordinariamente alto contenido de la antigua versus el bajo contenido de citrato de esta última [ver comentarios de [1 - 4]]. La normal de las células epiteliales secretoras tienen la función especializada de la producción y secreción de los extraordinariamente altos niveles de citrato. Para lograr esta capacidad, estos "citrato de productores de" células poseen una única limitación de m-aconitasa actividad de la enzima citrato de oxidación que deteriora. En las células malignas, m-aconitasa actividad no es limitar y citrato de oxidación no se vea perjudicada. Esta transformación metabólica normal de las células productoras de citrato citrato-oxidantes a las células malignas es un evento esencial en el desarrollo de tumores malignos de próstata. Además, la hiperplasia benigna de próstata (HBP) supone la proliferación de las glándulas productoras de citrato. Estos son coherentes relaciones que se han establecido y corroborada in situ por espectroscopía de resonancia magnetica de imágenes de la próstata humana, que es actualmente el procedimiento más fiable para la identificación y localización de loci malignas en la glándula prostática [para ver comentarios [4 - 6] ]. En consecuencia, es indispensable establecer el mecanismo de alteración de la oxidación de citrato en la normal de las células epiteliales secretoras, y la alteración de citrato de producción asociados a la transformación metabólica en la células malignas.

Normal de células de mamíferos en el metabolismo intermediario m-aconitasa normalmente existe en exceso y no es un tipo de limitación o reglamentación enzima, y cataliza la reacción de equilibrio:

~ 88 citrato ← → 4 cis-aconitate ← → ~ 8 isocitrate.

Esto se traduce en una característica citrato / ~ isocitrate ratio 10 / 1 para la mayoría de tejidos de mamíferos, independientemente de la concentración de citrato. En contraste, la producción normal de citrato de próstata y de hiperplasia de las glándulas exhiben una citrato / ~ isocitrate ratio 30 / 1; que es indicativo de una limitación de la actividad m-aconitasa [1, 7]. Esto se fundamenta en la alteración de citrato de oxidación, pero no por oxidación isocitrate citrato de acumulación de células de la próstata [8, 9]. Un limitado m-aconitasa actividad podría ser el resultado de una inhibición de la enzima y / o una disminución del nivel de la enzima. Estudios anteriores establecieron que la acumulación de altos niveles de zinc, que se produce en las células normales de la próstata [3, 10, 11], resulta en la inhibición de la actividad de la aconitasa m-y en un cambio de su equilibrio hacia citrato [12, 13]. En CaP, las células malignas de próstata no se produce una acumulación de zinc, que conduce a la expectativa de que m-aconitasa actividad no es inhibida en estas células y se produce la oxidación de citrato. En un reciente estudio en el que participaron las mediciones con las secciones de tejido de cáncer de próstata (14), hemos demostrado que ZIP1 zinc transportista es regulada por los niveles de zinc y se agotan en el epitelio glandular de adenocarcinomatous glándulas. Sin embargo, una alternativa o adicional consideración es la posibilidad de que el m-aconitasa enzima nivel podría ser baja en la producción de citrato de células de la próstata normal, y / o de la enzima podrían ser más-se expresa en las células malignas. Por lo tanto, es importante determinar el nivel de m-aconitasa enzima en muestras de tejidos humanos de la próstata y comparar su nivel y malignos en glándulas nonmalignant. Además, este estudio fue realizado con las mismas muestras al igual que en nuestro informe anterior, de modo que las diferencias de los cambios en los niveles de ZIP1 puede ser contrastado con los resultados actuales de m-aconitasa niveles. Este informe proporciona la primera identificación de la enzima m-aconitasa malignas en la próstata humana y nonmalignant epitelio glandular.

Resultados

Costello et al [15] informó de que el m-aconitasa anticuerpos empleados en el presente estudio es específico para la isoforma mitocondrial y no se reactiva con citosólico (c-) aconitasa. Esta conclusión se basó en inmunoreactividad positiva (Western blots) con extractos aislados mitocondrial de los preparativos, y con reactividad negativa citosólicas extracto de los preparativos. Sin embargo, para el presente estudios de inmunohistoquímica, es esencial para establecer que dentro de la m-aconitasa mitocondrial podría ser detectado anticuerpos y que la reacción se limita a la mitocondria. Para establecer esto, el análisis de inmunofluorescencia se realizó con células LNCaP en conjunto con la tinción con mitocondrial Mitotracker. La figura 1 muestra que la m-aconitasa inmunoreactividad se asoció con y específicos para el compartimento mitocondrial, y que el anticuerpo es selectivo para el m-aconitasa isoenzimas.

A continuación, procedió a analizar humanos de las secciones de tejido de la próstata m-aconitasa inmunoreactividad en frente nonmalignant focos malignos. Figura 2 se presenta el representante de la detección inmunohistoquímica m-aconitasa en la HBP, malignas, normal, y el PIN focos. Los resultados muestran que m-aconitasa está presente en el epitelio glandular de todas las glándulas, independientemente del estado patológico. Asimismo, el nivel celular de m-aconitasa es consistentemente más baja en el tejido estromal que en el epitelio glandular. Lo que es más importante, immunopositive detección de m-aconitasa es evidente en las glándulas malignas, así como en el epitelio glandular normal.

Cuadro 1 es el resumen de la puntuación de inmunohistoquímica m-aconitasa reactividad de las secciones de tejido de 22 casos de cáncer de próstata. En la tabla se presentan los dos parámetros utilizados para la cuantificación de m-aconitasa enzima nivel: el porcentaje de las células dentro de una glándula que exhibió m-aconitasa inmuno-positividad, y el nivel celular de m-aconitasa representada por el m-aconitasa puntos positivos - (Mitocondrias) dentro de las células. En este estudio, hemos restringido el análisis a la comparación de m-aconitasa en las glándulas situadas en la misma sección de tejido. Uno de los motivos es para eliminar, o al menos minimizar, las posibles diferencias derivadas de la difusión de anticuerpos en las células y en las mitocondrias de inmunoreactividad. Por lo tanto, cualquier comparativa diferencias observadas en el nivel de inmunoreactividad en las diferentes glándulas de la misma sección de tejido se debe a las diferencias comparativas en el nivel de m-aconitasa.

Se desprende de la Tabla 1 que m-aconitasa inmunoreactividad es esencialmente el mismo para la HBP epitelio glandular y adenocarcinomatous glándulas. HBP glándulas, como la zona periférica normal de las glándulas productoras de citrato son las glándulas; que adenocarcinomatous glándulas son citrato-oxidantes glándulas. Además, no existe correlación entre el grado tumoral y m-aconitasa inmunoreactividad. Esto es coherente con el hecho de que la disminución de citrato en las células malignas ocurre muy a principios de malignidad y persiste a través de la progresión de la malignidad [4 - 6]. Aunque el número de casos en los que las muestras de tejidos normales que figuran las glándulas y el PIN (considera por muchos como un precursor etapa de malignidad) era insuficiente para el análisis estadístico, estas glándulas expuesto m-aconitasa con calificaciones similares entre sí y similares a la HBP y adenocarcinoma . Estos resultados muestran que la alteración en el nivel de m-aconitasa enzima (es decir, alterada m-aconitasa expresión / biosíntesis) no está asociado con la alteración de la oxidación o la producción de citrato en malignas o no malignas de las células. Esto contrasta con nuestro estudio anterior [14] de los cambios en el nivel de ZIP1 transportista en las secciones de las mismas muestras de tejidos empleados en este informe actual. Por comparación, el cuadro 1 muestra los resultados anteriores. La ausencia de un cambio en la m-aconitasa nivel de la enzima es evidente en la misma que las glándulas muestran un marcado descenso de regulación del nivel de ZIP1 transportista en malignas o no malignas de las glándulas. Además, acompañan a la baja regulación de ZIP1 es una correspondiente disminución en los niveles de zinc celular [14]. Así, la ausencia de un cambio en demostrable m-aconitasa enzima nivel no se debe a algún efecto artefacto.

Para más corroboración de estos resultados, se determinó la expresión de m-aconitasa en LNCaP, DU-145, y PC-3 líneas de células malignas de la próstata y el efecto del tratamiento de zinc en el nivel de m-aconitasa en líneas de células malignas de próstata. Los resultados (figura 3] muestran que m-aconitasa se expresa en todas las líneas de células malignas. Es notable que el nivel de m-aconitasa en células LNCaP no tratados es superior a la PC-3 células de la oxidación a pesar de citrato por las células LNCaP es insignificante en comparación con citrato de alta oxidación por células PC-3 [16, 17]. Esto se debe a la mayor acumulación de zinc en las células LNCaP que inhibe m-aconitasa actividad [16]. La exposición de las células de zinc no tuvo ningún efecto sobre el nivel de m-aconitasa (figura 3]. Sin embargo, las condiciones empleadas resultados en la acumulación celular de zinc (18, 19), que inhibe la actividad de la aconitasa m-y citrato de oxidación. Por lo tanto, estos estudios establecen, por primera vez, que es la acumulación de inhibitoria sobre los niveles de zinc m-aconitasa actividad, y no la limitación de los niveles de m-aconitasa enzima, que impide la oxidación de citrato en células de la próstata.

Discusión

En el metabolismo típico de células de mamíferos, citrato es un elemento esencial para la oxidación intermedia a través del ciclo de Krebs y la posterior producción de ATP junto fosforilación. Citrato se debe convertir a isocitrate por la acción de m-aconitasa como de la entrada de su paso a través de la oxidación del ciclo de Krebs. Es importante intermediario en el metabolismo energético de células de mamíferos que m-aconitasa no es una limitación de la reacción que esencialmente truncar el ciclo de Krebs. Por lo tanto, la constituitive m-aconitasa actividad es, por lo general superiores en células de mamíferos, lo que asegura un adecuado flujo de citrato a isocitrate para la oxidación de la siguiente manera:

Sin embargo, en las células epiteliales normales de la próstata citrato es fundamentalmente un producto final de metabolismo intermediario, en lugar de un útil intermedios como en la mayoría de las otras células. Es bien sabido que citrato de células productoras de la próstata y de sus mitocondrias isocitrate oxida fácilmente, pero no citrato [7 - 9, 20]. Estas observaciones colectivas establecer que la acumulación de citrato en citrato de células productoras de próstata es predominantemente debido a la limitación de la actividad m-aconitasa (pruebas adicionales para ver [1 - 4, 21]. Por lo tanto, existía la posibilidad de que el nivel de constituitive m - Aconitasa enzima en células de la próstata podría ser excepcionalmente bajos y un factor que contribuye a la limitada m-aconitasa actividad. Sin embargo, varios estudios con células de la próstata de ratas, cerdos y humanos de las células de próstata próstata líneas celulares demostrado que la expresión y el nivel de los m-aconitasa No es menor en células productoras de citrato en comparación a la que se encuentra en el típico citrato-oxidantes células [15, 22 - 24]. Si bien este próstata m-aconitasa relación se ha establecido en estudios en animales y en cultivos celulares estudios, el nivel de los m - Enzima aconitasa tejido de la próstata en humanos nunca se ha determinado. Los estudios actuales revelan que el nivel de constituitive m-aconitasa es esencialmente el mismo en la HBP epitelio glandular normal y zona periférica del epitelio glandular (ambos glándulas productoras de citrato), y la adenocarcinomatous Glándulas (glándulas citrato-oxidantes) y el PIN (presume malignos etapa temprana).

La ausencia de una expresión alterada de m-aconitasa está en marcado contraste con los cambios en la expresión del transportador de ZIP1 la absorción de zinc y los niveles de zinc en el celular que informó recientemente [14]. La eliminación de la participación de los alterado m-aconitasa nivel de la enzima lleva a la conclusión de que la tasa de limitación m-aconitasa actividad se debe a una inhibición de la enzima. Es bien sabido que la zona periférica normal de glándulas y de la HBP glándulas se acumulan niveles extremadamente altos de zinc, en asociación con su singular capacidad de producir y acumular citrato de niveles extremadamente altos, y que, en el CaP, las glándulas malignos muestran una marcada disminución en los niveles de zinc y en Citrato de los niveles [10, 11]. Estas relaciones son coherentes con las establecidas efectos del zinc en la inhibición de la actividad de m-aconitasa y citrato de oxidación [12, 13], que permite la única zona periférica función glandular (como en la próstata de otros animales), de la producción neta de citrato. En CaP, la pérdida de la capacidad de las células malignas para acumular zinc elimina su inhibición de la actividad de la aconitasa m-, y con ello aumenta la oxidación de citrato y disminuye el nivel celular de citrato.

Conclusión

El presente estudio demuestra la existencia de niveles similares de m-aconitasa enzima no malignos en citrato de productores de la HBP glandular normal y las células epiteliales, en comparación con el citrato-oxidantes células malignas. En consecuencia, la limitación de m-aconitasa actividad de la citrato-producción de las células epiteliales no es el resultado de un deficiente nivel de la enzima (reacción 1), y el aumento de m-aconitasa actividad de la citrato-oxidantes células no es el resultado de un elevado Nivel de la enzima (reacción 2), de la siguiente manera:

Estos resultados, de acuerdo con informes anteriores, establecer el mecanismo de la regulación de los m-aconitasa y citrato humano normal de oxidación en las células epiteliales de próstata glandular y en la transformación metabólica de las células malignas. El efecto inhibidor de elevación de los niveles de zinc en m-aconitasa actividad es responsable de la alteración de la oxidación de citrato normal y HBP citrato de células productoras de próstata (reacción 1). La pérdida de la capacidad de las células malignas para acumular zinc elimina la inhibición de los actuales m-aconitasa citrato de modo que se produce la oxidación (reacción 2). Esta elucidación de los mecanismos asociados a la transformación metabólica de la oxidación de citrato proporciona el bioenergético sintéticas y requisitos que son esenciales para la manifestación del proceso maligno de la próstata de células neoplásicas. Por lo tanto, importante conocer la genética y metabólica de las relaciones de la patogenia y progresión del cáncer de próstata está en evolución, que proporcionará nuevos enfoques para la detección y su tratamiento.

Métodos
Humanos tejido de la próstata

Veintidós casos de adenocarcinoma de próstata diapositivas se obtuvieron de RPCI que figuran tanto adenocarcinomatous focos adyacentes y la hiperplasia benigna de próstata. Cuatro de los casos que figuran normal de próstata y las glándulas que figuran seis casos intra-epitelial prostático neoplásicas focos (PIN). Una sección de la normalidad y otro HBP se obtuvieron a partir de la Cooperativa de Tejidos Humanos de la Red Nacional Cancer Institute, National Institutes of Health, Bethesda, MD. Las diapositivas fueron codificados sin identificación en relación con los pacientes. Revisión Institucional se obtuvo la aprobación de la Junta.

Inmunohistoquímica

La inmunohistoquímica se realizó con el anticuerpo m-aconitasa (1:500 dilución) desarrollado y descrito por Costello et al [15]. La inmunohistoquímica es protocolo descrito por Desouki y Rowan [25]. En pocas palabras, las diapositivas se de-parafinized por incubación en xileno y ascendente de los grados de alcohol. Antígeno de la recuperación fue realizada por la calefacción en 10 mM buffer citrato de sodio (pH 6,0) @ 98 ° C, incubadas en el 1% de peróxido de hidrógeno, con un 10% bloqueado suero de cabra con avidina D (Vector Laboratories, Burlingame, CA), incubadas con m - Aconitasa de anticuerpos en el 10% de suero de cabra con biotina a 4 ° C durante la noche seguido de incubación con la etiqueta secundaria peroxidasa anti-conejo IgG (H + L) de anticuerpos (Vector Laboratories, Burlingame, CA), en una concentración de 5 ug / ml. Color fue desarrollado por incubando diapositivas con kit de DAB (Vector Laboratories, Burlingame, CA), seguido de counterstaining con Hematoxylin. Una sección de cada una de próstata tejido teñido con H & E para la caracterización de las lesiones histológicas y clasificación de los tumores por un patólogo (MMD), de acuerdo con la Organización Mundial de la Salud sistema de clasificación [26]. Grado 1 se define por las glándulas bien diferenciadas con un mínimo de anaplasia en el que los núcleos son casi uniforme, con la mínima variación en el tamaño y la forma y pocos nucleolos detectables. Grado 2 se define por las glándulas moderadamente diferenciado con moderada anaplasia nuclear con muchos nucleolos. Grado 3 se define por pobremente diferenciado o indiferenciado glándulas mostrando marcada anaplasia en el que los núcleos se mostró marcadas variaciones en el tamaño y forma irregular, vesicular, marcado con figuras mitóticas anormales. Todas las secciones fueron examinados con microscopio de luz E600 Nikon. Las imágenes fueron procesadas con Spot software, la versión 4,1, instrumentos de diagnóstico, Inc (Sterling Heights, MI).

Inmunofluorescencia localización de m-aconitasa

LNCaP células (cáncer de la próstata humana línea celular) se cultiva en la cubierta de hojas y se llevan en los medios de comunicación RPMI con glutamina (Gibco, Grand Island, NY) suplementado con 10% de SFB + 100 U / ml penicilina y 100 ug / ml estreptomicina + 20 ng / Ml EGF para inmunofluorescencia. El sub-localización celular de m-aconitasa en relación con la mitocondria fue determinado por la combinación de inmunofluorescencia con m-aconitasa y la MitoTracker Roja CMXRos selectivo sonda (Molecular Probes, Eugene, OR). LNCaP células fueron cultivadas en la laminina revestida de vidrio cubierta se desliza en placas de cultivo de tejidos, hasta llegar a alrededor del 75% de confluencia. La inmunofluorescencia protocolo descrito por Makino et al [27] se utilizó la modificación. Las células fueron incubadas en los medios de comunicación con 100 nM MitoTracker durante 30 minutos a 37 ° C. El medio fue entonces sustituido por los medios de comunicación sin MitoTracker fresco y se incubaron durante 15 minutos a 37 ° C. La fijación de las células se hizo en los medios de comunicación recién preparada que contenga 4% paraformaldehido durante 15 minutos a 37 ° C. Permeabilización se realizó con 0,2% Triton-100x en PBS durante 5 minutos a temperatura y bloqueo habitación con 1% de BSA en PBS durante 1 hora a temperatura ambiente. Las células fueron lavadas con PBS y se incubaron con m-aconitasa de anticuerpos durante 60 minutos a temperatura ambiente, y seguido de incubación con el secundario de conejo anti-IgG-FITC (Covance de Investigación Products, Inc Denver, PA) en el 1% BSA durante 60 minutos (1:1000 dilución). Montaje con Vectashield montaje de los medios de comunicación con DAPI (Vector Laboratories, Burlingame, CA) se hizo antes de vidrio sellado con diapositivas. Examen microscópico con Leica SP2 en microscopía confocal de barrido láser se llevó a cabo. Emisiones; Diole Blue Laser 405, y 488 Argón láser Helum / Neon Laser 543 para DAPI (azul), FITC (verde) y MitoTracker (rojo), respectivamente.

Evaluación de m-aconitasa inmunoreactividad

El m-aconitasa nivel de la enzima fue determinada por el método de puntaje de inmunohistoquímica y Desouki Rowan [25]. Se emplearon dos criterios: el porcentaje de células epiteliales dentro de las glándulas que presentan m-aconitasa immunopositivity, y el número de immunopositive citoplásmica puntos (aconitasa-detectado mitocondrias) en las células epiteliales. Las células con puntúan citoplásmica puntos fueron considerados positivos para el m-aconitasa. Veinte a cincuenta campos aleatorios de alta potencia (aceite de inmersión, 100x) en una sección de cada uno de los casos fueron evaluados. Los resultados fueron empleadas; negativos, no positivos células, Resultado +, <10% positivo; Resultado + +, 10-50% positivo; Resultado + + +,> 50% positivos. Para la cuantificación de los m-aconitasa dentro de las células epiteliales, el número medio de identificación bien definida m-aconitasa immunopositive puntos por celular fue determinada por la inmersión en aceite de alto campo (100x) examen de 50 células. El programa Excel se utiliza para calcular la correlación entre el grado del tumor y la aconitasa immunopositivity resultados. A t-test fue realizado también por comparación estadística de m-aconitasa niveles en la HBP glándulas versus adenocarcinomatous glándulas.

Western blot de m-aconitasa

El nivel de m-aconitasa en las líneas de células malignas de próstata fue determinada por Western blot de extractos de células que se describió anteriormente [15].

Contribuciones de los autores

KS dirigido el estudio en Roswell Park Cancer Institute. MD realizó análisis histopatológico e inmunohistoquímico de cáncer de próstata diapositivas, y la immunofluorescent estudio de las células malignas de próstata LNCaP. KS y MD proporcionado los datos de estos análisis.

RBF LCC y el estudio concebido, desarrollado y proporcionado la m-aconitasa anticuerpos; dirigió la línea de células malignas estudios en la Universidad de Maryland. Todos los autores contribuyeron a la redacción del manuscrito, y leído y aprobado el manuscrito final

Agradecimientos

Estos estudios se apoya en parte (RBF y LCC) de la NIH subvenciones CA71207, CA21097, CA79903. KKS fue apoyada con una donación de los Institutos Nacionales de Salud 097714 y Elsa Pardee Fundación.