PLoS Clinical Trials, 2006; 1(1): (más artículos en esta revista)

RTS, S/AS02A malaria vacuna no induce parásito CSP células T epítopo selección y reduce la multiplicidad de infección

Biblioteca Pública de la Ciencia
Sonia Enosse [1], Carlota Dobaño [1], Diana Quelhas [1], John J Aponte [1], Marc Lievens [4], Amanda Leach [4], Jahit Sacarlal [1], Brian Greenwood [5], Jessica Milman [6], Filip Dubovsky [6], Joe Cohen [4], Ricardo Thompson [1], W. Ripley Ballou [4], Pedro L Alonso [1], David J Conway [5], Colin J, Sutherland [8 ]
[1] Centro de Investigação em Saúde da Manhiça, Ministério de Saúde, Maputo, Mozambique
[2] Instituto Nacional de Saúde, Ministério de Saúde, Maputo, Mozambique
[3] Centro de Salut Internacional, Hospital Clínic / IDIBAPS, Universidad de Barcelona, Barcelona, España
[4] GlaxoSmithKline Biologicals, Rixensart, Bélgica
[5] Gates Malaria Partnership, la Escuela de Londres de Higiene y Medicina Tropical, Londres, Reino Unido
[6] PATH Malaria Vaccine Initiative, Bethesda, Maryland, Estados Unidos
[7] Consejo de Investigación Médica Laboratories, Fajara, Gambia
[8] HPA Malaria laboratorio de referencia, la Escuela de Londres de Higiene y Medicina Tropical, Londres, Reino Unido
Resumen
Objetivo:

El candidato vacuna contra la malaria RTS, S/AS02A es una proteína recombinante que contiene parte de la proteína circumsporozoite (CSP) de secuencias de Plasmodium falciparum, vinculado a la hepatitis B antígeno de superficie y formulados en el sistema de propiedad adyuvante AS02A. En un reciente ensayo realizado en niños menores de cinco años en el sur de Mozambique, la vacuna demostró significativo y sostenido de la eficacia contra la infección y tanto la enfermedad clínica. En un estudio de seguimiento para el proceso, avance infecciones identificadas en el juicio fueron examinados para determinar si la distribución de las secuencias csp se vio afectada por la vacuna y para medir la multiplicidad de infectar a los genotipos del parásito.

Diseño:

P. falciparum ADN de los aislamientos recogidos durante el juicio se utilizó para estudios de genotipo.

Ambiente:

El principal ensayo se llevó a cabo en el distrito de Manhiça, provincia de Maputo, Mozambique, entre abril de 2003 y mayo de 2004.

Participantes:

Los niños de las dos cohortes de las principales cepas del parásito juicio previstas de la siguiente manera: los niños de la cohorte 1 que fueron ingresados en el hospital clínico de la malaria; niños de la cohorte 1 que se parásito-positivos en una encuesta transversal en 8,5 meses de estudio, los niños de Cohorte 2-parásito identificado como positivo durante el seguimiento activo de detección de la infección.

Resultados:

La divergencia de secuencia de ADN que codifica el CSP de células T-epítopo región secuencia de la de la vacuna contra la secuencia se midió en 521 aislamientos. El número de distintas P. falciparum También se determinarán los genotipos.

Resultados:

No se encontraron pruebas de que el parásito genotipos de los niños en el RTS, S/AS02A brazo fueron más divergentes que las que recibieron vacunas de control. Por cohorte 1 (encuesta a 8,5 meses de estudio) y de cohortes 2, infecciones en el grupo de la vacuna contenía una cantidad significativamente menor de los genotipos que los del grupo control (p = 0,035, p = 0,006), respectivamente, para las dos cohortes. Este no era el caso para los niños de 1 de cohortes que se encontraban ingresados en el hospital (p = 0,478).

Conclusiones:

RTS, S/AS02A no ha seleccionado para la codificación de los genotipos divergentes epítopos de células T en la región C-terminal de CSP en este juicio. En ambas cohortes, hubo una modesta reducción en el número medio de parásitos genotipos alberga en niños vacunados en comparación con los controles, pero sólo entre los que tienen infecciones asintomáticas.

INTRODUCCIÓN

El paludismo sigue siendo una de las principales causas de morbilidad y mortalidad en muchos países de África, y se estima que causa más de un millón de muertes cada año [1]. Considerando que una mejor utilización de las medidas de control disponibles y la búsqueda de nuevos, baratos, eficaces y de las drogas son los principales objetivos de los actuales esfuerzos en la investigación del paludismo, sostenible, el control de la malaria sería mayor si se dispone de vacunas eficaces para su uso en combinación con otras medidas de control.

Varias vacunas contra el paludismo se han probado en los países con malaria endémica [2], incluida la pre-eritrocitaria vacuna RTS, S/AS02A, un polipéptido recombinante desarrollada por GSK Biologicals que contiene la mayor parte de la C-terminal de la mitad de la proteína circumsporozoite (CSP) Secuencia de P. falciparum Fundida a virus de la hepatitis B antígeno de superficie formulados en el adyuvante AS02A sistema [3, 4]. Eficacia contra P. falciparum Infección en ambos infectados experimentalmente voluntarios y, naturalmente, los adultos expuestos se han obtenido con esta vacuna [3 - 5], y la eficacia protectora de la RTS, S/AS02A contra la malaria clínica se demostró recientemente en una prueba de concepto de fase IIb, a doble Ciego, aleatorizado, controlado juicio en niños de edades comprendidas entre 1-4 años en el sur de Mozambique [6]. La eficacia de la vacuna para el primer o único episodio fue 29,9% (95% IC 11.0-44.8; p = 0,004) de la malaria clínica y 57,7% (95% IC: 16.2-80.6, p = 0,019) para la malaria grave más de seis meses de seguimiento . La eficacia de la vacuna para extender el tiempo hasta la primera P. falciparum Infección fue 45,0% (95% IC: 31.4-55.9, p <0,001). Amplio seguimiento ha confirmado que se mantiene la protección de más de 18 meses posteriores a la vacunación [7].

CSP es una proteína que se encuentra abundante en la superficie del esporozoito. La hipótesis que prevalece en este ámbito es que las células de la respuesta inmune mediada por desempeñar un papel importante en la protección contra la pre-eritrocítica parásitos, y los estudios del gen de codificación de CSP P. falciparum Han demostrado un gran nivel de polimorfismo genético entre cepas, la mayoría de los dominios es la variable de células T epítopos cerca de la C-terminal de la proteína, que son designados Th2R y Th3R [8, 9]. La inclusión de estas variables en las secuencias de la vacuna puede seleccionar para la no vacuna de tipo alelos que podrían repercutir en la eficacia general, no como vacuna de tipo alelos fueron seleccionados por la vacuna contra la cepa específica de las respuestas a la P. falciparum Merozoite proteína MSP-2 entre los vacunados los niños de Papua Nueva Guinea [10]. En los varones adultos de Gambia, la RTS, S/AS02A se ha encontrado la vacuna para inducir la protección contra P. falciparum Que la infección no fue la cepa específica [11]. La población de parásitos en este estudio mostraron una alta frecuencia de los alelos de codificación epítopos de células T con la misma secuencia de aminoácidos como los de la vacuna, que se basa en laboratorio P. falciparum 3D7/NF54 clon. Csp de los alelos identificados por punto-secante, el 10% codificada Th2R y el 15% codificada Th3R epítopos que se puede distinguir de los de la vacuna. La prevalencia de estos alelos fue similar entre las infecciones emergentes en la vacuna y los grupos de control [11]. Curiosamente, en el ensayo de Gambia el número de genotipos por la infección del parásito (multiplicidad de infección (MOI)) en los casos fue mayor avance en el RTS, S/AS02A grupo que en el grupo control (4,90 frente a 4,23, p = 0,05). Estos estudios indican que la tipificación molecular integrada será una herramienta útil para la evaluación de vacunas contra la malaria, especialmente cuando una cepa específica-efecto es posible.

Como parte del proceso llevado a cabo en 2003-2004 por Alonso y colegas para evaluar la eficacia de la RTS, S/AS02A en niños mozambiqueños la vacuna [6], las secuencias de ADN que codifica el Th2R y Th3R epítopes de la CSP de genes de los parásitos avance de los casos En ambas vacunas y el control de armas de la prueba se obtuvieron durante los seis meses de seguimiento. Estos se analizaron para poner a prueba la hipótesis de que la protección contra la infección o la enfermedad clínica después de la vacunación con la RTS, S/AS02A no era dependiente de la secuencia con respecto a la Th2R y Th3R epítopos del CSP. Además, se investigó si la vacunación modificado el número de P. falciparum Genotipos presentes en sujetos infectados con el virus.

MÉTODOS
Los participantes

Las muestras para el análisis molecular se recogieron durante el curso del ensayo de una vacuna llevado a cabo en el distrito de Manhiça, en el sur de Mozambique, entre abril de 2003 y mayo de 2004. Detalles de la zona de estudio, la población y el diseño del estudio se ha informado anteriormente [6]. En resumen, una Fase IIb, a doble ciego, aleatorizado, controlado ensayo se llevó a cabo para determinar la eficacia de la vacuna contra la enfermedad clínica y la infección en niños de edades comprendidas entre 1-4 años. Estos puntos finales fueron medidos en dos cohortes basado en diferentes sitios, Cohortes 1 (Manhiça) y la cohorte 2 (Ilha Josina). Intensidad de la transmisión de la malaria es mayor en el área de estudio de cohortes que en 2 cohortes 1 [6]. En cohortes 1 1605 niños fueron matriculados y la variable principal fue el tiempo hasta el primer episodio clínico de los síntomas P. falciparum La malaria más de seis meses de período de observación a partir del 14 d después de la dosis 3, que corresponde al estudio de 2,5 meses, hasta 8,5 meses de estudio. En la cohorte 2, 417 niños fueron matriculados y el principal criterio de valoración fue la eficacia de la vacuna para la prevención de nuevas infecciones, a lo largo de la etapa posterior a la vacunación de seguimiento período que abarca el estudio de 2,5 a 8,5 meses. En la cohorte 2, sujetos recibieron una sola dosis de sulfadoxina-pirimetamina y una dosis diaria de la amodiaquina por 3 d, 4 semanas antes del comienzo de Semana y 2 de vigilancia antes de la última dosis de la vacuna, para despejar cualquier parasitemia.

Las muestras para el genotipado de parásitos en los niños recogidos de cohortes 1 se obtuvieron de dos fuentes: 1)-filtro de papel bloodspots de una encuesta transversal realizada en el estudio de 8,5 meses, y 2)-EDTA congelado sangre de los pacientes con paludismo pasivos identificados por la detección de casos Y las admisiones al hospital como en la de los pacientes. En la cohorte 2, filtro de papel bloodspot Se recogieron muestras de pacientes con infección por malaria identificados por la detección de la infección activa (ver Figura 1]. En ambas cohortes, sólo muestras de sangre periférica de los niños que estaban en pleno cumplimiento con el protocolo de vacunación fueron incluidos.

El protocolo fue aprobado por el Consejo Nacional de Mozambique comité de revisión ética, el Hospital Clínic de Barcelona comité de revisión ética, la protección de los sujetos humanos PATH comisión, y la Escuela de Londres de Higiene y Medicina Tropical de comité de revisión ética. Escrito se obtuvo el consentimiento de los padres o tutores antes de la inscripción de estudio y recogida de muestras de sangre.

Muestra de sangre recogida y extracción de ADN

Filtro de papel de las muestras de sangre de aire secos, envasados individualmente en papel de aluminio, colocar en una caja que contiene un desecante (gel de sílice), y almacenadas a 4 ° C hasta su uso. Todas las muestras fueron etiquetadas con un único número de identificación de la muestra.

Extracción de ADN de un terreno (tres fragmentos, de aproximadamente 3 milímetros de diámetro) de papel de filtro y de alrededor de 200 μ l de las muestras de sangre congelada (1 hospitalizados cohortes participantes solamente) se realizó a través de la sangre QIAamp DNA minikit-procedimiento de extracción como se describe por el fabricante (Qiagen, Valencia, California, Estados Unidos). Muestras de ADN se eluye en 150 μ l de tampón AE y almacenados a -20 ° C hasta su uso.

Determinación de la CSP de secuencias polimórficas

La distribución de las variantes polimórficas secuencia de codificación de la Th2R y regiones de Th3R P. falciparum CSP se determinó a través de una entrevista semi-nested PCR seguida de la secuenciación de los productos de PCR purificado.

La amplificación por PCR semi-anidado de un fragmento de 321 pb del gen csp se realizó utilizando tres primers vinculante secuencias conservadas de acompañamiento a la Th2R y Th3R regiones de csp. Para la primera ronda de PCR, los primers fueron: primer adelante (CSo101), 5'-aatcaaggtaatggacaagg-3 '; invertir cartilla (CSo102), 5'-ctaattaaggaacaagaagg-3'. Para la segunda reacción, los primers utilizados fueron los siguientes: primer adelante (CSo101), inversión de cartilla (CSo104), 5'-ggaacaagaaggataatacc-3 '. Los primers CSo101 y CSo104 se utilizaron para la secuencia principal reacciones.

La primera ronda de PCR mezcla figura 1 μ l de ADN en un volumen total de 10 μ l que contenga 200 nM concentraciones de cada primer constituido en 1 × BioMix Roja (Bioline, Boston, Massachusetts, Estados Unidos) la reacción de PCR buffer. La segunda mezcla de PCR figura 1 μ l de ADN en un volumen total de 20 μ l que contenga 200 nM de cada cebador en 1 × reacción de amortiguación. Amplificaciones de PCR se realizaron en un MJ Research DYAD 96-termociclizador así con el ciclo de las siguientes condiciones: 95 ° C durante 4 min, seguido por 40 ciclos de 94 ° C (1 min), 50 ° C (1 min) y 72 ° C (1 min) y extensión final a 72 ° C durante 4 min. Segunda ronda de los productos de PCR fueron controlados en un 2,0% en gel de agarosa 1 × buffer TAE, para comprobar la calidad, el tamaño y el rendimiento de los productos de PCR antes de proceder a la purificación del producto y la secuencia.

Después de la purificación de productos de PCR QIAquick multiwell utilizando el protocolo de purificación de PCR (Qiagen), la secuencia de reacciones se realizaron BigDye Terminator después de la versión 3,1 del ciclo de protocolo kit de secuenciación (Applied Biosystems, Foster City, California, Estados Unidos). En resumen, el PCR-secuenciación mezcla de reacción contenía 2 μ l purificada producto que contenga entre 10 y 120 ng de producto de PCR, junto con 8,0 μ l maestro de la mezcla de PCR que contiene 2 μ l de avance o el retroceso de ejemplo, 0,5 μ l BigDye mezcla, 1,75 μ l de la secuencia de amortiguación y Agua purificada. La amplificación de PCR se realizó en placas de 96 pozos en las condiciones siguientes: 25 ciclos de 96 ° C por 0,30 min, rampa de 1,0 ° C / s a 50,0 ° C, 50 ° C por 0,15 min, rampa de 1,0 ° C / s para 60,0 º C, 60,0 º C de 4,00 min, rampa de 1,0 ° C / s a 96,0 ° C.

La secuenciación de los productos se precipitó entonces utilizando el etanol-acetato de sodio y el método de precipitación en la secuenciación ABI 3730 capilar máquina de muestra para electroforesis.

Análisis de Secuencias

El programa de software SeqMan (DNASTAR, Madison, Wisconsin, Estados Unidos) se utilizó para analizar la electropherogram secuencias. La secuencia de cada producto de PCR fue verificada manualmente por al menos dos investigadores y un consenso que se alcanzó o el ensayo repetido. El avance y retroceso electropherogram secuencias fueron montadas en una secuencia contigua y el consenso de archivos analizados para decidir si representaba un único alelo o alelos mixtos. Contigua secuencias que muestran dos o más electropherogram picos en la misma posición (en la que una clara mayoría alelo no puede definirse) indicó mixta alelos.

Las variantes polimórficas en ambas regiones de la secuencia PAP (Th2R y Th3R) fue evaluado utilizando el alelo 3D7/NF54 como referencia. Ochenta codones, en las posiciones 323-402 (numerados de acuerdo a la secuencia 7G8 [9]] se suman para todos los aislados, y los datos introducidos en una hoja de cálculo de Excel. Dos archivos de datos separadas fueron creadas, una para la única y clara mayoría y uno de los alelos para todas las cepas, incluidas las mezclas alelos. En el primer archivo de datos, los aminoácidos en cada posición se puntuó como 1 si que es idéntica a la de aminoácidos presentes en esa posición en la secuencia 3D7/NF54. No idénticos aminoácidos se anotó como 0. En el segundo fichero de datos, la puntuación fue el siguiente: 0 para no incluidos en la vacuna de aminoácidos tipo 1, si sólo una de aminoácidos idéntica a la vacuna contra el tipo de secuencia se presente, y 2 en caso de la vacuna tipo alelo se mezcla con otros alelo (s ).

Genotipificación de msp-1, msp-2, y para glurp Estimación de MOI

Nested PCR se utilizó para discriminar alelos de msp-1 y bloque 2 msp-2 y repetir el R11 región de glurp como ha sido descrito previamente [12].

Después de la electroforesis, geles fueron doble anotó independiente por dos investigadores, y, o bien se llegó a un consenso o el ensayo repetido. El número mínimo de los genotipos de cada locus se determinó para cada una de las muestras y los resultados introducida en una hoja de cálculo de Excel. El general genotípica complejidad de cada aislamiento se tomó como la más alta de los tres números calculados en cada locus. La media de este número mínimo se calcula para cada grupo, y en llamar la "multiplicidad de la infección" (MOI). Esto debe considerarse como una estimación mínima de la verdad significa MOI [12].

El ciego

Todas las extracciones de ADN y los análisis de laboratorio fueron realizados por individuos cegados a la vacuna contra la cesión.

Métodos estadísticos

Un análisis plan fue acordado antes de la decodificación de datos en los grupos de tratamiento. Los criterios de valoración para evaluar la especificidad cepa de la vacuna fueron: 1) la proporción relativa de la vacuna tipo alelo, para cada uno de los sitios polimórficos de aminoácidos en ambas regiones epitopo de células T (Th2R y Th3R), en la vacuna frente al grupo control. La prueba exacta de Fisher (2 caras) se utilizó para probar las diferencias entre RTS, S/AS02A y grupo control, y 2) el número de aminoácidos diferentes de la vacuna tipo en cada una de las regiones epitopo de células T (Th2R y Th3R ). Las diferencias en la distribución del número de aminoácidos diferentes de 3D7/NF54 entre la vacuna y el control de los grupos se compararon utilizando una de Mann-Whitney U test (2 caras Rank Sum test de Wilcoxon). Estadística de los resultados de las pruebas no fueron ajustados para múltiples análisis.

Para determinar si la vacuna el número de afectados P. falciparum Genotipos por la infección, la frecuencia de distribución de genotipos en los vacunados y los grupos de control se compararon mediante la U de Mann-Whitney como prueba el resultado primario. Se utilizó la regresión de Poisson para producir estimaciones de la vacuna efecto, ajustado por la densidad de parásitos, la edad y el tiempo a la infección. Sin embargo, el análisis no producir un resultado que de acuerdo con el análisis no paramétrico, y por lo tanto se concluye que la distribución de Poisson no describir adecuadamente los datos. Un ajustado gamma de regresión se calculó y se presenta como una exploración de análisis (secundaria), ya que fue capaz de ajustar los datos más de cerca.

RESULTADOS
Participante Flow

En general los participantes de flujo se resume en la figura 1. El número de muestras recogidas y utilizadas para la secuenciación se da en el cuadro 1, y para la estimación de las MOI en la Tabla 2.

Analizó los números

La RTS, S/AS02A juicio llevado a cabo en Mozambique matriculados dos cohortes de niños, una para la estimación de la eficacia de la vacuna contra episodios clínicos de malaria (cohorte 1), y el otro para la estimación de la eficacia contra la infección (cohorte 2) [6]. En cohortes 1, 213 parásito-positivas fueron identificados por el estudio transversal de prevalencia de parásitos en el estudio de 8,5 meses. De estos, 82 fueron los individuos vacunados con RTS, S/AS02 y 131 habían recibido vacunas de control, que representan el 11,9% y el 18,9% de los participantes encuestados en estos dos grupos, respectivamente [6]. El csp genes de 208 (98%) de estos fueron éxito amplificado por PCR y secuenciado. El electropherograms de 109 aislamientos (52,4%) indicaron la presencia de un único alelo csp, ocho (3,8%) indicaron una clara mayoría único alelo (con pequeños picos de antecedentes que indican minoría alelos en uno o varios de los sitios polimórficos), y 91 ( 43,8%) dieron mixta alelos. Un total de 95 muestras fueron analizadas 1 de cohortes de 104 participantes admitidos en el hospital con malaria clínica por primera o única vez: el ADN de 90 de estos (94,7%) se ha amplificado y secuenciado. Cuarenta y un (45,5%) de los productos de PCR dio electropherograms coherente con un único alelo, 11 (12,3%) un único alelo clara mayoría en la presencia de pequeños picos de fondo, y 38 (42,2%) fueron mixtos alelos.

En la cohorte 2, hay 323 niños con primeros episodios de la parasitemia detectados, pero 82 de estos niños no tienen un papel de filtro muestra recolectada. La mayoría de estas muestras corresponden a 82 niños que fueron febriles en la visita a la casa y, por tanto, enviada directamente a la clínica donde microcapillary frotis de sangre y se les tomaron muestras, pero no es papel de filtro. Así, las muestras de ADN para el análisis de genotipos estaban disponibles para los niños con parasitemia 241, y 223 (92,5%) de estas muestras fueron éxito amplificado por PCR y los productos secuenciados. De ellos, 157 (70,4%) contenían un único alelo, ocho (3,6%) un único alelo clara mayoría con pequeños picos de fondo, y 58 (26%) dio mixta alelos. La observación de un menor número de infecciones mixtas en 2 cohortes que en la cohorte 1 podrán ser, al menos en parte se explica por las diferencias en las dos fases de la intervención y la vigilancia del estudio. Los niños en la cohorte 2 recibieron tratamiento contra el paludismo dos semanas antes de la tercera dosis de la vacuna para eliminar la parasitemia antes del comienzo de la eficacia período de seguimiento, y se sometieron cada dos semanas activa la detección y el tratamiento de la infección. En el seguimiento de cohortes 1 fue por la detección pasiva de casos de malaria.

Estimación y resultados

En cada cohorte se determinó 1) la proporción de los aislamientos con el PAP tipo de la vacuna (3D7) polimórficos en cada aminoácido en la posición Th2R y Th3R epítopos en la vacuna y los grupos de control, y 2) el número de aminoácidos diferentes de la vacuna tipo (3D7), en el Th2R y Th3R regiones de la vacuna frente al grupo control. Hubo ocho y seis posiciones de aminoácidos en la Th2R y Th3R regiones de la secuencia PAP, respectivamente, que muestran polimorfismo en nuestra población y, por lo tanto informativo. Primaria análisis comparativos se realizaron con un conservador de datos que comprende tanto mono-alélica aislados, y los aislados con un único alelo clara mayoría en un contexto de una menor de edad o más alelos. Mixed-genotipo aislamientos fueron incluidos en los análisis comparativos secundaria.

Las comparaciones entre grupos se realizaron mediante prueba exacta de Fisher y de la evaluación de la IC del 95% de las diferencias entre los grupos. Post hoc, el estudio tiene el poder de detectar cualquier diferencias entre grupos en la proporción de los no vacuna aminoácidos en la Th2R y Th3R epítopo regiones de al menos el 25% (encuesta transversal en cohortes 1, conservador de datos) y De al menos el 20% para los otros conjuntos de datos.

La proporción de los aislamientos que no contenía residuos de la vacuna en el PAP Th2R y Th3R epítopos se muestra en la Figura 2. Entre los aislamientos de 8,5 meses en el estudio de cohortes en los niños 1, primaria análisis no reveló diferencias significativas entre la vacuna y los grupos de control en cualquier aminoácido Th2R posiciones en la región, ni en cualquier posición en el Th3R región. Del mismo modo, no se encontraron diferencias significativas entre los grupos de tratamiento en la cohorte 1 participantes admitidos en el hospital en cualquier posición, ya sea en epítopo región. Entre las infecciones detectadas en la cohorte 2, la vacuna de tipo de residuos 374-Asp en la Th3R epítopo fue sustituido por Asn en el 4% de las infecciones por el grupo de la vacuna, en comparación con 13% en el grupo control (diferencia de proporciones 9%, IC del 95%: 0,8% -17,2%, p = 0,050), pero no hubo otras diferencias significativas entre los grupos de tratamiento en 2 cohortes en cualquier posición, ya sea en epítopo región.

Análisis auxiliares

En el análisis secundario de datos de cohortes 1 en 8,5 meses de estudio, incluidos los cargos de la sociedad mixta de alelo infecciones, la vacuna-Glu tipo de residuos en 333 (Th2R) fue sustituido por Gln Lys o en el 76% de las muestras de vacunas grupo, en comparación con el 64% de Muestras de control (diferencia de proporciones -12,5%, IC del 95%: -25% a 0,1%, p = 0,066), y la vacuna contra el tipo de residuos presentes en Lys 337 en la región Th2R fue sustituido por Thr, Arg, IIe o en el 52% Grupo de muestras de la vacuna en comparación con el 38% de muestras de control (diferencia de proporciones -14,7%, IC del 95%: -28,5% a -0,9%, p = 0,044). En la cohorte 2, la vacuna de tipo de residuos 374-Asp en la Th3R epítopo fue sustituido por Asn en el 3% del grupo de las infecciones de la vacuna cuando se mezclan alelos se incluyeron, en comparación con el 9% en el grupo control (diferencia de proporciones 6,6%, el 95 % CI 0,4% -12,7%, p = 0,054). Diferencias significativas en los patrones de sustitución entre la vacuna y el control de los grupos no fueron vistos en ningún otro aminoácido en la posición de los análisis secundarios.

Se estimó el número de aminoácidos que difieren de la vacuna para cada tipo de aislar. No se encontraron diferencias significativas entre la vacuna y los grupos de control, ya sea en la Th2R o Th3R epítopo regiones en ninguno de los dos cohortes (Figura 3]. Sólo tres de los niños (1,6%) del grupo control y tres niños (2,0%) de la vacuna contra el grupo alberga parásitos con Th2R epítopos idénticos a los de la cepa de la vacuna. Th3R epítopo secuencias idénticas a 3D7/NF54 se encontraron en seis niños (3,2%) y cinco niños (3,4%) en el control de vacunas y grupos, respectivamente. Esto contrasta con prevalencias de 10% y 15%, respectivamente, entre los hombres adultos en Gambia [11].

Multiplicidad de infección

Parásito ADN de 208 muestras de cohortes 1 (investigadas en el estudio de 8,5 meses), 95 cohortes de niños de 1 ingresados en el hospital, y 224 muestras de cohortes 2 niños, fue mecanografiada con éxito para msp-1, msp-2, y los genes y utilizado glurp Para el análisis de las MOI (Tabla 2].

Por cohorte 1 (estudio mes 8,5) y de cohortes 2, el mínimo global MOI (combinación de los datos de los tres loci) fue significativamente menor entre las infecciones en el grupo de la vacuna que entre los del grupo control (p = 0,035, p = 0,006, Respectivamente, para las dos cohortes, la prueba de Wilcoxon rango suma) (Figura 4]. La media de MOI de cohortes 1 fue 1,94 (sd 0,94) en el RTS, S/AS02A grupo y 2,24 (sd 1,01) entre los controles (diferencia proporcional de gamma de regresión ajustada para la densidad de parásitos 0,9, IC 95% 0.79-1.02, p = 0,098 ). La media de MOI de cohortes 2 fue 1,83 (sd 0,89) y 2,16 (sd 0,97), respectivamente, para la vacuna y de los grupos de control (diferencia proporcional de regresión gamma, para ajustar la densidad de parásitos y el tiempo a la infección 0,84, IC 95% 0.74-0.96, p = 0,007). Entre los participantes de cohortes 1 que se encontraban ingresados en el hospital, no había ninguna diferencia significativa entre la vacuna (media 2,84 MOI, sd 1.08) y grupos de control (media de 2,67 MOI, sd 0,87) genotípica en la complejidad de la infección por el análisis como se indica mediante el test de Wilcoxon (P = 0,478) y la gamma de regresión ajustada para la densidad de parásitos y de la gravedad de la enfermedad (diferencia proporcional 1,12, IC 95% 0.96-1.30, p = 0.154).

DEBATE

Las medidas preventivas contra el paludismo y la mortalidad de la enfermedad se necesitan con urgencia al entrar en el siglo 21 con una carga de la malaria entre los niños africanos sin cambios desde comienzos del siglo anterior. La demostración de Alonso et al. [6] que la vacunación de niños de 1 a 4 años de edad en Mozambique con GSK Biologicals candidato vacuna contra la malaria RTS, S/AS02A proteja a la vez contra la infección y una serie de manifestaciones clínicas de la malaria incluyendo enfermedad grave, y Que esta protección se mantiene durante al menos 18 meses [7], es oportuna la prueba de que el desarrollo de una vacuna eficaz contra el paludismo es factible. El objetivo de antígenos en la RTS, S/AS02A, el CSP de P. Falciparum, que incluye las regiones son altamente polimórficos y puede existir como docenas de variantes dentro de cada parásito población [8, 9, 11]. Si la eficacia de la RTS, S/AS02A es dependiente de la secuencia, la protección puede variar en función de la divergencia de la CSP en la secuencia predominante cepas circulantes. En teoría, si una vacuna fueron ampliamente desplegado, la secuencia que dependen de la protección de los genotipos podría seleccionar a un parásito nivel de población. Presentamos aquí que entre los emergentes P. falciparum 222 infecciones en niños vacunados en comparación con el control de 299 personas que participan en el ensayo de Mozambique RTS, S/AS02A en 2003-2004 no había pruebas para la selección de genotipos que difieren en la secuencia de la vacuna tipo.

Interpretación

La ausencia de la secuencia mensurables que dependen de la selección en la Th2R y Th3R regiones no implica que una contribución de la vacuna indujo una respuesta inmunitaria celular a la observada eficacia de la RTS, S/AS02A se puede descartar. De hecho, existe amplia evidencia de que los seres humanos vacunados con RTS, S/AS02A generar respuestas inmunes a los epítopos [13, 14], a pesar de un vínculo formal entre estas respuestas y la protección aún no se ha hecho. De células T CD4 + en las respuestas a una invariante CSP epítopo presente en RTS, S han sido asociados con protección natural contra la infección [15], y el análisis genético de los últimos csp secuencias de codificación theTh2R y Th3R epítopos en 238 aislamientos procedentes de Tailandia no apoya la idea de que Diversidad en estos epítopos se genera en respuesta a la selección por la secuencia específica de la inmunidad humana en que la población [16]. Además, la vacunación con RTS, S/AS02A Mayo obtener respuestas de las células T en contra de la CSP polimórficos de la región que reconoce heteróloga epítopos de células T, tanto transversal como clado reconocimiento por el VIH específicos de las células T [17, 18] y la reactividad cruzada de VPH -11 Específico de células T CD4 + con la piel y otros tipos de VPH genital [19] se ha informado. En curso y futuros ensayos de RTS, S-basada en vacunas puede arrojar luz sobre el papel de las células mediada por la respuesta inmune a epítopes conservados y polimórfico observado en la protección inducida por la vacuna.

Generalizabilidad

Nuestro análisis de la secuencia que dependen de la eficacia de la vacuna utilizada directa de la secuencia de ADN amplificado directamente de las muestras de sangre. Todos los procesos se han realizado en un formato de 96 pozos de extracción de ADN a través de la recopilación de datos. Este innovador enfoque ofrece ventajas sobre la hibridación dot-blot método de Alloueche et al. [9, 11] en ser más rápido, más fácil de automatizar, y el más robusto, como el método anterior requiere habilidad en la interpretación de los complejos conjuntos de datos dot-blot, y las múltiples lecturas de los trabajadores independientes para eliminar el error de observación. La única limitación nos encontramos con la secuenciación directa es que una proporción de los aislamientos fueron demasiado compleja en la posiciones de nucleótidos de interés en el Th2R-y Th3R-csp codificación de las regiones, debido a la presencia de múltiples genotipos csp con diferentes alelos, de manera inequívoca a asignar Una completa secuencia. Así, el 43,8% de los aislados de cohortes 1 y el 26% de la cohorte de 2 fueron mixtos csp genotipo sin clara mayoría alelo, y no contribuye a nuestro análisis de la secuencia principal. Esto puede potencialmente sesgo nuestras conclusiones dependen de si la secuencia de selección es más frecuente entre las infecciones de estos complejos. Esta limitación se aplica también a punto de métodos de secante, pero podría abordarse en el futuro los estudios de la clonación y secuenciación individual csp alelos de tales infecciones mixtas, que aumentan sustancialmente los análisis de los esfuerzos.

Un importante parasitológicos parámetro utilizado en numerosos estudios clínicos y epidemiológicos de la malaria es el número medio de los distintos genotipos de parásitos por individuo infectado, o MOI [12, 20]. Estudios de las posibles asociaciones entre el MOI y el riesgo de la malaria clínica en Ghana, Mozambique, Tanzania, y PNG han sido coherente [21 - 24], y como la relación entre el MOI y la morbilidad por malaria es posiblemente dependiente de la edad [22], es probable Variar considerablemente en diferentes condiciones de la transmisión. Por lo tanto, debemos ser prudentes al interpretar los datos acerca de nuestra MOI. De hecho, la evidencia de una reducción de las MOI se encontró en los niños vacunados con la vacuna SPf66 polipéptido sintético en Tanzania [25] y en Gambia [26], a pesar de la reducción del riesgo de la vacuna contra la malaria en Tanzania [27], pero no en Gambia [28] . Por el contrario, un aumento en el total de MOI se observó entre los hombres de Gambia vacunados con RTS, S/AS02A [11] que experimentaron un retraso en el tiempo hasta la primera infección [4]. Entre 527 infecciones emergentes en el juicio Mozambique, hubo una reducción de las MOI en RTS, S/AS02A-vaccinated niños en comparación con los controles tanto en la cohorte 1 (en estudio 8,5 meses, p = 0.035) y en la cohorte 2 (p = 0,006) . No hay diferencia entre MOI en RTS, S/AS02A-vaccinated los niños y el control de los individuos se observó entre los participantes de cohortes 1 ingresados en el hospital clínico de la malaria. The mechanism by which an efficacious vaccine might reduce MOI among emergent infections remains unclear, but in our analysis the reduction effect was shown to be independent of both parasite density and time to infection. A pre-erythrocytic vaccine such as RTS,S/AS02A may work in part by preventing or reducing emergence of parasites from the liver stage [ 3 , 5 ]. Our finding that there was no reduction in MOI in RTS,S/AS02-vaccinated children admitted to hospital with malaria may represent the emergence of new clones and is consistent with the hypothesis that new parasite types are more likely to cause illness than are those types already established in the host.

Overall Evidence

We have found no evidence that the observed efficacy against malaria infection and morbidity of the RTS,S/AS02A vaccine among Mozambican children is sequence-dependent, and we have shown that fewer distinct parasite genotypes circulate in vaccinated hosts compared with controls. There has been no systematic review of genotypic multiplicity in the context of vaccination with RTS,S/AS02A. However, an analysis of a previous RTS,S vaccine trial conducted in Gambian adults [ 4 ] also revealed no differences in the prevalence of vaccine-type allele sequences among breakthrough infections between vaccine or control groups [ 11 ]. Moreover, although the vaccine reduced the incidence of infection in that trial, it did not reduce the MOI compared with controls. Although a genetic analysis of CSP T cell polymorphisms in individuals exposed to falciparum malaria along the Thai–Burmese border [ 16 ] indicated that naturally acquired immune pressure in the human host is unlikely to play any significant role in selecting and maintaining the extensive polymorphisms that occur naturally in the CSP Th2R and Th3R regions, such responses are typically weak and short-lived. This does not appear to be the case in the context of vaccination with RTS,S/AS02A [ 15 , 29 ], and the observation that vaccine-induced selection of escape mutants does not occur bodes well for candidate vaccines based on the CSP antigen.

These data were accrued in the context of a large Phase IIb trial. Nevertheless, should RTS,S/AS02A or similar pre-erythrocytic malaria vaccines be deployed on a large scale in the future, surveillance for evidence of sequence-dependent selection of breakthrough parasite genotypes would be a wise precaution. We have demonstrated that high-throughput direct sequencing of large numbers of field samples from parasite-positive individuals would be a feasible and robust approach to this end.

SUPPORTING INFORMATION