Diagnostic Pathology, 2006; 1: 2-2 (más artículos en esta revista)

Aumento de los análisis moleculares de combinación de la esperanza-y la técnica láser microdissection

BioMed Central
Torsten Goldmann (tgoldmann@fz-borstel.de) [1], Renate Burgemeister (renate.burgemeister @ palmeras microlaser.com) [2], Ulrich Sauer (Ulrich.Sauer @ palmeras microlaser.com) [2], Siegfried Loeschke (sloeschke@fz-borstel.de) [1], Dagmar Silvia Lang (dlang@fz-borstel.de) [1], Detlev Branscheid (branscheid@kh-grosshansdorf.de) [3], Peter Zabel (pzabel @ fz-borstel.de) [4], Ekkehard Vollmer (evollmer@fz-borstel.de) [1]
[1] Clínica y Patología Experimental, Centro de Investigación Borstel, Alemania
[2] PALM Microlaser Technologies, Bernried, Alemania
[3] Departamento de Cirugía Torácica, Krankenhaus Großhansdorf, Alemania
[4] Clínica Médica, Centro de Investigación Borstel, Borstel, Alemania

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Resumen

Como parte de una investigación encaminada a que ilumine las posibilidades y los límites de la esperanza a la fijación y la integración de parafina-técnica que aquí se describe un novedoso procedimiento que se desarrolló con el fin de combinar las ventajas de la HOPE-técnica con la capacidad de láser microdissection. El presente procedimiento se evita la necesidad de ampliación de plantilla de ARN-lo que facilita la fiabilidad y resultados reproducibles. La excelente preservación de los ácidos nucleicos, proteínas, y en la morfología HOPE-fijo, embebido en parafina tejidos aumenta la moleculares aplicaciones disponibles hasta la fecha con los materiales adquiridos por láser microdissection si se compara con formol fija, embebido en parafina tejidos, por lo tanto, se amplía sustancialmente la metodología del panel en el tejido basado en la investigación.

Introducción

Microdissection láser es una valiosa herramienta para el análisis de parámetros moleculares en la población purificada de células o células individuales incluso fuera de su medio ambiente dentro de los tejidos. Esta tecnología requiere una aceptable conservación de los detalles morfológicos que se necesita para la disección exacta y la preservación de los ácidos nucleicos que se analizan. La fijación de los tejidos con formalina resultados en la morfología bien conservada, pero - a un alto grado - conduce a la degradación de los ácidos nucleicos que limita considerablemente el espectro de técnicas moleculares aplicables [4]. La novela HOPE-técnica, con la consiguiente incorporación de parafina, como una alternativa a la formalina, se ha demostrado que el resultado en un preservación morfológica comparable al fijado en formol e parafina embebidos especímenes [6]. Por otra parte, se describen los procedimientos que permiten la aplicación con éxito de todas las técnicas moleculares como la hibridación in situ [1, 4, 7], sin inmunohistoquímica de antígenos para la recuperación y la formalina refractaria antígenos [1, 3], PCR [8, 11], RT-PCR [6, 11], Western blot [9], Northern blot, y la transcripción microarrays [2] para HOPE-fijo, embebido en parafina tejidos. HOPE-fija los tejidos se pueden utilizar para la preparación de los microarrays de tejidos para mejorar los análisis de alto rendimiento en el nivel molecular [5, 12]. Utilizando la técnica de HOPE-como su base metodológica fundamental, ex vivo modelo de sistemas se podría establecer, por ejemplo, para la simulación de los primeros eventos en infecciones humanas y la detección de resistencias a la quimioterapia en cáncer humano [7, 13]. Además de tejidos, células, la cultura preparativos se han preparado utilizando el HOPE-técnica, que luego se aplicó con éxito a la hibridación in situ o la orientación mRNA inmunocitoquímica con una excelente conservación de los detalles morfológicos [10]. En este estudio se describe el uso de HOPE-fijo, embebido en parafina de tejidos láser microdissection y posterior análisis molecular de ARN-transcripciones de tiempo real RT-PCR. Los resultados se establecen en relación a los obtenidos con formol fija, embebido en parafina tejidos de las mismas lesiones. Este tiempo real RT-PCR se realizó sin ambigüedades sin ninguna amplificación de RNA o total de cDNA, lo que elimina la necesidad de este tipo difícilmente controlable medidas necesarias en los procedimientos establecidos con tejidos fijados en formol.

Materiales y métodos
Preparación de la muestra

Los especímenes utilizados fueron tumor-bearing o tumor libre de materiales (por lo menos 5 cm de distancia del tumor frontal) de lobectomía o neumonectomía por cáncer de pulmón. Por medio de comparación, las muestras de tejidos de los mismos órganos se convencionalmente fijado en formol e y embebido en parafina o tratados de acuerdo con el HOPE-técnica.

La fijación de los tejidos mediante la aplicación de la HOPE-técnica se llevó a cabo como se describe anteriormente (6), comenzando con una incubación de las muestras de tejido fresco en un acuosa solución de protección (que contiene una mezcla de diferentes amino-ácidos) la noche a la mañana a bajas temperaturas de 0 -4 ° C (DCS, Hamburgo, Alemania). Incubación en acetona seguido a 0-4 º C. Los tejidos fueron incorporados directamente con parafina.

Muestras de tejido de HOPE-fijo o formalina y embebidos en parafina (FFPE) el cáncer de pulmón humano muestras de tejidos se prepararon en la membrana diapositivas montadas (PALM MembraneSlides, PALM, Bernried, Alemania).

HOPE-secciones se deparaffinized ya sea con isopropanol (2 × 10 min a 60 ° C) o como el normal FFPE-secciones se lava con xileno (2 × 10 minutos a temperatura ambiente).

Todos fueron teñidos con cresil violeta (1% w / v cresil violeta acetato en el 100% de etanol; Aldrich # 86098-0) durante 1 minuto a temperatura ambiente, se lava en breve con el 70% y el 100% de etanol y posteriormente se seca al aire.

Microdissection láser y la presión catapulting (LMPC)

LMPC se realizó con un sistema PALM MicroBeam con pulsos UV-A nitrógeno láser (337 nm). Usando el objetivo × 10 áreas de interés se han marcado, corte y catapultado en la tapa de 0,5 ml de microfuga de tubos de llenado con adhesivo (PALM AdhesiveCaps, PALM, Bernried, Alemania). Áreas más pequeñas se combinaron para llegar a la media el tamaño de las muestras de 0.5-1 millones de micrones cuadrados. Después de terminado microdissection la parte restante de cada sección de tejido se redujo a cabo con un bisturí y se recoge en periódicos de microfuga de 0,5 ml tubo (cortadas).

La extracción de RNA

Muestras de tejidos fueron extraídos utilizando el RNeasy Micro Kit (Qiagen, Hilden, Alemania, # 74004) las indicaciones del fabricante, manual de instrucciones. En resumen, las células fueron disueltos en 350 μ l de buffer de lisis RLT, tratados con DNaseI después de la primera etapa de lavado de acuerdo con el manual y, finalmente, el ARN fue purificado eluye a 12 μ l de RNasa libre de agua.

Espectrofotometría se realizó para probar la pureza y concentración de ARN, lo que puso de manifiesto bien conservada ARN de alta concentración a lo largo de dichas muestras.

De cada muestra de ARN 1 μ l fue probado en un Agilent Bioanalyzer 2100 utilizando el ARN 6000 Pico LabChip kit (Agilent, Waldbronn, Alemania, # 5065-4473) para determinar la integridad del ARN.

Transcripción reversa y RT-PCR

La síntesis de ADNc se realizó a través de la línea 1 de cDNA síntesis kit de RT-PCR (AMV) (Roche, Penzberg, Alemania, # 1483-188) tras las instrucciones del fabricante. En pocas palabras, 8,2 μ l de solución de ARN se transcribe a invertir un volumen final de 20 μ l azar usando primers de la carpeta para garantizar la eficacia de la transcripción también fragmentado parcialmente degradadas o ARN.

RT-PCR se realizó con los primers de la baja abundancia de referencia de genes humanos hipoxantina phosphoribosyltransferase (huHPRT, GenBank: M31642 , POS. 383-411 y POS. 613-591) que producen un amplicón de 231 pb.

La reacción de PCR se realizó en un LightCycler Instrumento mediante el Fast Start Master Plus SYBR Green sistema (Roche, Penzberg, Alemania) la aplicación de las siguientes condiciones: 95 ° C durante 10 min, 50 ciclos a 95 ° C durante 10 segundos, 67 ° C durante 10 segundos, 72 ° C durante 10 segundos seguido de un análisis de la curva de fusión de 70 ° a 99 ° C en 0,1 ° C medidas para el control de especificidad. El importe de RT-PCR producto fue evaluado de forma automática en tiempo real con detección por fluorescencia LightCycler el paquete de software.

Resultados

HOPE-fijo, parafina de tejidos embebidos muestra excelente 'formol-como' la preservación de detalles morfológicos después de seccionar y cresil violeta tinción con buena adherencia a la membrana diapositivas montadas (PALM MembraneSlides) utilizados para láser microdissection (Fig. 1]. Laser microdissection fue posible sin problemas sin ningún tipo de modificación a la PALM MicroBeam sistema, lo mismo vale para la presión catapulting del material disecado en la recogida de tubos (Fig. 1]. La extracción de ARN de acuerdo con el protocolo descrito anteriormente se logró rápidamente. ARN de calidad del HOPE-fijo muestras analizadas mediante el uso de la Agilent Bioanalyzer fue claramente superior al fijado en formol e materiales, que se ejemplifica en la figura 2. En el tiempo real RT-PCR (Fig. 3], resultados similares fueron obtenidos con la utilización de deparaffinization xileno o isopropanol para las muestras que hayan sido sometidos a LMPC y el recorte secciones. Las diferencias entre las secciones cortadas y LMPC puede explicarse por las diferencias en las cantidades de material de partida. FFPE materiales - ya sea LMPC o cortar secciones - no muestran ninguna amplificación de los objetivos humanos hipoxantina phosphoribosyltransferase fragmento. Esto está en buen acuerdo con los resultados de ARN-análisis de la calidad en los materiales obtenidos FFPE con el Bioanalyzer, que no muestra ningún visualizar ARN en estos bloques (Fig. 2].

Discusión

Microdissection láser para el análisis de parámetros moleculares en las poblaciones de células o células individuales de los tejidos requiere aceptable conservación de la morfología y los ácidos nucleicos. Esto no puede lograrse a un grado suficiente de la utilización de FFPE, que muestran la degradación de los ácidos nucleicos si se compara con material fresco, que nos llevó a esta investigación de HOPE-fijos materiales.

Nos mostró que la esperanza-fijo, embebido en parafina tejidos están bien preparadas para laser microdissection. La morfología bien conservada es comparable al fijado en formol e especímenes y superior cuando se compara con las secciones congeladas. ARN de alta calidad se pueden extraer de la microdissected muestras y posteriormente se utilicen para el éxito de análisis de tiempo real RT-PCR. Estos RT-PCR análisis se puede realizar sin necesidad de ningún procedimiento de amplificación del ARN. Esto se traduce en mayor especificidad y la reproducibilidad si se compara con los protocolos que han de recurrir a esas técnicas debido a la degradación dentro de los (por lo general, fijado en formol e) los especímenes. Por lo tanto los resultados en tiempo real de RT-PCR con la esperanza de tejidos fijados son claramente superiores a los obtenidos en formol-fijos materiales.

La combinación de la mejora molecular posibilidades que ofrece el HOPE-técnica con láser microdissection representa una novedosa herramienta para el futuro del tejido basado en los estudios. Estudios apropiados están en curso para ampliar aún más estos resultados iniciales prometedores.

Agradecimientos

Los autores se agradecen a Dr Ch. Sartori para proporcionar reactivos para el HOPE-técnica y la señora H. Kühl y la señora B. Haar por su excelente apoyo técnico.