Journal of Burns and Wounds, 2005; 4: (más artículos en esta revista)

Microscopía de inmunofluorescencia deconvolución y reconstrucción de la imagen humana defensinas en condiciones normales y la piel quemada

Abrir las ciencias Company, LLC
Brian J. Poindexter

Se trata de un acceso abierto mediante el cual el artículo los autores conservan los derechos de autor de la obra. El artículo se distribuye bajo la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que la obra original esté debidamente citados.

Resumen

Objetivo: El objetivo de este estudio fue la visualización y localización de la persona humana antimicrobianos humanos beta defensinas 1, 2 y 3, neutrófilos defensin alfa (neutrófilos humanos péptido), y la cathelicidin LL-37 en condiciones normales y la piel quemada, y la determinación de la tipos de células en las que estos antimicrobianos fueron localizados. Métodos: Muestras de tejido se probaron con anticuerpos antimicrobianos, etiquetados con la etiqueta fluorescente secundaria de anticuerpos, y sometidos a la microscopía de fluorescencia deconvolución y reconstrucción de imagen. Las imágenes fueron generadas por el apilamiento de múltiples exploraciones sección, que se dictó el volumen de rotación de 360 ° pilas en torno a un eje, o modelado en 3 dimensiones. Resultados: Esta técnica produce una imagen definitiva, proporcionar una rápida base para continuar la cuantificación y la manipulación de un 3-plena aspecto. En la piel normal, humana beta defensin-1 fue localizado en la región perinuclear de queratinocitos humanos defensin beta-2 fue localizada principalmente a los estratos de germinativum; humanos defensin beta-3 se encuentran en las células dendríticas del estrato spinosum; humanos de neutrófilos fue péptido distribuidos al azar en la dermis papilar y LL-37 se concentró en el estrato córneo ya lo largo de los conductos. En la piel quemada, en la que los queratinocitos son perdidas o destruidas, humanos beta defensin-1 estaba presente en las estructuras glandulares cutánea incluida pelo; humanos defensin beta-2 y humanos defensin beta-3 se encontraron en el resto de las capas de queratina y las glándulas de la parte inferior dermis; neutrófilos humanos péptido fue localizada principalmente a pelo, aunque residual visible en las capas de queratina, y LL-37 se puso de manifiesto en concentraciones muy elevadas en el epitelio de los conductos del sudor. Conclusión: La conclusión a través de esta técnica que las células en la parte baja y por vía cutánea subdermal regiones de la piel quemada sintetizar los antimicrobianos después de lesión por quemaduras, y mantener una especie de barrera contra las infecciones. Esta metodología se analiza y se explica en este artículo.

La piel tiene muchas defensas naturales contra la infección. Tight los cruces entre los queratinocitos impedir la invasión de los microbios, y los ácidos grasos ricos en lípidos y ricas en medio ambiente en la epidermis es tóxico no sólo para las bacterias, sino también a los hongos y virus. 1 defensinas son péptidos antimicrobianos naturales, producidos por diversas células en humanos piel, 2, 3, que también ofrecen protección contra la invasión, sobre todo cuando la barrera de la piel se ha visto comprometida por la lesión. 1 queratinocitos de la epidermis sintetizar cathelicidins, 4 Ecrinos glándulas producen sudor, que contiene LL-37, 5 mastocitos produce LL-37 , 4 y neutrófilos humanos contienen péptidos de neutrófilos (HNPs) y LL-37. 6 Por lo tanto, la pérdida o destrucción de la piel elimina muchos de nuestros mecanismos de defensa naturales.

Hemos determinado que los péptidos antimicrobianos naturales Estuvieron presentes en la piel quemada, 7, 8, a pesar de la pérdida de la epidermis e incluso la dermis superior, y localizados estos péptidos a determinados tipos de células y especialmente las capas restantes de la piel. 9 deconvolución microscopía de fluorescencia rendimientos definitivo imágenes que nos permiten localizar péptidos y proteínas a determinados tipos de células y estructuras, y dirige los estudios futuros para la upregulation de muchos de estos microbials y la cultura de múltiples tipos de células para la formulación de matrices de cubrir la herida. Microscopía de fluorescencia deconvolución es otro instrumento de investigación dirigidos al tratamiento de heridas y la regeneración celular.

MATERIAL Y MÉTODOS

Todos los productos químicos fueron adquiridos de Sigma Chemical Corp (St. Louis, Mo), excepto cuando se indica, y fueron de la más alta calidad disponible.

Preparación de Tejidos

La piel se obtuvieron muestras de la sección de congelados de pacientes ingresados en el Centro Regional de Quemaduras en Springfield, Ill, con parciales-y espesor total quemaduras, que van del 10% al 35% del total de superficie corporal. Representante de tejido fueron cosechadas en el segundo o tercer día después de la lesión durante la escisión y el injerto. La piel normal, se tomaron muestras de restos a la división de autoinjertos de espesor (0,30 mm). Las muestras fueron incorporados a la base de sacarosa-OCT compuestos (tejidos-Tek, Torrence, Calif) y congelado en hielo seco. Las secciones se redujeron en un espesor de 12 ± 3 μ m con un Microm HM 505 E cryotome (Microm Laboratories, Walldorf, Alemania) y se coloca a 18 mm de vidrio cubierta se desliza (Fisher, Pittsburgh, Pa), que había sido limpiado y ácido recubierto con Poly - l - lisina. Las secciones fueron fijadas en el 3,7% de paraformaldehído (Tousimis Research, Rockville, Md) durante 5 minutos a temperatura ambiente, enjuagar 5 veces con tampón fosfato salino a temperatura ambiente, y cubrir las caídas fueron invertidos y flotaron en el 10% de suero de cabra durante 1 hora a 37 ° C para reducir la unión de los anticuerpos inespecíficos. Los anticuerpos humanos para humanos defensinas beta defensin-1 (HBD-1), defensin humanos beta-2 (HBD-2), los neutrófilos humanos péptido-1 (Policía Nacional Haitiana-1) (Alpha de diagnóstico, San Antonio, Tex), humanos beta-defensin 3 (HBD-3) (Novus Productos Biológicos, Littleton, Colo), y LL-37 (Hycult Biotecnología bv, Uden, Países Bajos) fueron diluidos 1:100 en el 10% de suero de cabra y se incubaron con las secciones durante 45 minutos a 37 ° C. Después de enjuagar la cubierta se desliza en el 0,05% de Tween-20 para eliminar los anticuerpos no encuadernado, fluorescente de anticuerpos marcados secundaria (Molecular Probes, Eugene, Ore) y se han añadido las secciones fueron incubadas durante 30 minutos a 37 ° C. Por último, F-actina y los núcleos fueron al mismo tiempo fluorescente manchadas de phallicidin (Molecular Probes, Eugene, Ore) y 4 ',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) (Molecular Probes) durante 15 minutos a temperatura ambiente, y cubrir los resbalones fueron montados en portaobjetos de vidrio con Elvanol (DuPont, Willmington, Del) como el montaje y los medios de comunicación adjunta con esmalte de uñas.

Microscopía Reconstructiva (Deconvolution)

Los especímenes fueron digitalizadas con una precisión DeltaVision Aplicada (Issaquah, Wash) sistema equipado con una Olympus IX invertido 70 empleando un microscopio de 100 W de lámpara de arco de mercurio para la iluminación (Olympus America, Melville, NY) y de excitación / emisión filtro conjuntos (Chroma Technology Corp , Brattleboro, Vt) específicas para cada uno de los anticuerpos fluorescentes. La combinación del filtro establecido para DAPI (núcleo) es una excitación de 340 nm con un filtro de banda de paso de 20 nm y una emisión de 390 nm con un filtro de banda de paso de 20 nm. Phallicidin (F-actina) fluorescencia fue adquirida con un filtro de excitación de 488 nm (filtro pasa banda 10 nm) y una emisión de filtro de 520 nm (filtro pasa banda 25 nm). Defensin anticuerpos se visualizaron con un filtro de excitación de 585 nm (filtro pasa banda 10 nm) y una emisión de filtro de 640 nm (filtro pasa banda 40 nm). Imagen scans para cada sonda se adquirieron en serie a un paso de tamaño de 0,2 μ m con un Sony Interline cámara CCD. Por lo menos 30 secciones fueron escaneados por muestra para cada sonda (es decir, 90 imágenes en total para las 3 sondas se utiliza). Modelo de ampliación era de 400 × salvo que se indique lo contrario.

Deconvolución y análisis de imágenes se realizó mediante la transferencia de los conjuntos de datos para Linux / RedHat SoftWoRx de trabajo que emplean software (Applied Precision) que utiliza un algoritmo experimental producido por el sistema de la convolución de una función de propagación punto (PSF) para diferenciar y reducir la luz extraña o dispersa la luz capturada por la cámara. Un PSF se describe la resolución de imágenes y características de la luz recogida por la óptica del microscopio y se obtuvo mediante el escaneo de un 0,1 μ m de bolas fluorescentes (Molecular Probes, Eugene, Ore) 4 μ m por encima y por debajo del plano de enfoque. El resultado fue de fibras discontinuas de poliéster de Fourier transforma en una óptica de función de transferencia que manipulan los datos para producir imágenes con una mayor relación señal-ruido de resolución de la sonda de emisión de los patrones. Todos los conjuntos de datos fueron sometidos a 10 deconvolución iteraciones y luego utilizados para análisis de imagen, imagen reconstrucciones, el volumen renderizado y modelado. La resta de fluorescencia de fondo y el cambio de intensidad óptima ganancia fueron establecidos para cada emisión.

Una imagen de proyección fue producida por apilar cada uno de los z secciones de las 3 sondas fluorescentes en una sola imagen, lo que resulta en un período de tres dimensiones (3D) producto final y una superposición de todos los colores. Tomo renderizado utilizado la pila de z secciones y rotar sobre el eje x o y avión. Cada volumen de la rotación de películas fue producida con un 6 ° ángulo de visión. A 3D generados por ordenador, modelo virtual de los patrones de emisión de fluorescencia se produjo ver a las posiciones relativas de cada uno de los patrones y la localización de dilucidar las defensinas a determinados tipos de células. En breve, positiva y intensidades de fondo y se midieron los umbrales establecidos para producir polígonos sobre la base de la mayor relación señal / ruido de la intensidad de señal positiva. El software utilizado estos polígonos para generar objetos 3D y un modelo virtual que representa las pautas de emisión de cada sonda fluorescente. El modelo 3D es completamente interactivo y puede ser rotada en cualquier plano para visualizar en cualquier ángulo o perspectiva.

Las Juntas de Revisión Institucional de la Universidad de Illinois del Sur y la Universidad de Texas Health Science Center en Houston aprobó el estudio y apropiado consentimiento se recibió.

RESULTADOS

La Figura 1 muestra la imagen apilados adquisiciones de los 5 péptidos antimicrobianos examinado en las secciones de la piel normal. Cada imagen se ha deconvoluted, las secciones apiladas, y los 3 colores superpuestos (F-actina es verde, los núcleos son de color azul, y las defensinas son rojas). Grupo A se muestra HBD-1 localizado en el queratinocitos, principalmente en la periferia de ámbito nuclear; Grupo B muestra HBD-2 se concentró en el estrato basale, y se distribuyen en todo el estrato córneo y spinosum; Grupo C muestra HBD-3 localizado en las células dendríticas Y Grupo D es la Policía Nacional Haitiana, que no se ha encontrado en la epidermis, pero se encuentra en los niveles superiores de la dermis (determinado por la presencia de grandes citoesqueleto fibras). Por último, Grupo E muestra LL-37 asociados a las glándulas y los conductos, ausente de la spinosum, pero presentes en el exterior córneo, con indicación de su depósito de sudor secretado.

Figura 2 es una compilación de una selección de imágenes obtenidas de muestras de piel quemada tomadas de las zonas donde hay porciones restantes de la epidermis. Cada uno de los 5 grupos de manifiesto una pérdida de queratinocitos viable, una reducción de definición de las capas, y un clumped, desnaturalizado aparición de los elementos citoesqueleto. En un panel, a causa de la pérdida de queratinocitos, no existe una pauta distinta nuclear de HBD-1, aunque hay clumped masas en la parte superior del dermis papilar y un grupo en la región de la dermis reticular. Grupo b demuestra la localización de HBD-2 a Ecrinos glándulas, y en el Grupo c, HBD-3 se muestra asociada con elementos vasculares en algunas secciones. Grupo d es la Policía Nacional Haitiana y demuestra una vez más con la localización de un conducto, y algunos ubicados difusa en toda la dermis superior, mientras que LL-37 (panel e) la deposición de la córnea exterior y un alto colocalización a epitelio del conducto. Conductos se distinguen de pelo por la falta de F-actina y del tejido conjuntivo en la primera.

Figura 3 es un ejemplo de hacer volumen y el volumen de rotación. Esta imagen de la piel normal probaron para HBD-1 gira 360 ° alrededor del eje y en un ángulo de rotación de 6 °. La rotación es del Grupo A, en la Figura 1, y demuestra la especificidad de HBD-1 para la región nuclear de queratinocitos. También revela la abundancia y distribución generalizada de HBD-1 en la epidermis, realizar la protección contra la infección.

Figura 4 es otro volumen de rotación de la piel normal destacando HBD-3. En la piel normal, HBD-3 se encuentran principalmente en las células dendríticas de la epidermis. El 2-dimensional imagen en la Figura 1 (Grupo C), no plenamente, ya sea mostrar la especificidad de los péptidos a las células dendríticas, o el 3-dimensional morfología de estas células dendríticas. Por lo tanto, la figura 4 se muestra la zona de la imagen que se corta, se dictó y volumen establecido para girar 360 ° alrededor del eje y para visualizar mejor la especificidad de HBD-3.

Figura 5 es un volumen de rotación de la piel quemada probaron para la Policía Nacional Haitiana, tomadas del Grupo d en la Figura 2. La rotación es de 360 ° alrededor del eje x. Esta rotación de imagen demuestra claramente una pérdida de queratinocitos viable pero algunos localización a la Policía Nacional Haitiana la dermis superior. También revela algunas características particulares de la Policía Nacional a un sudor coursing conductos a través de la parte superior de la dermis. Estas rotaciones volumen no sólo son útiles para localizar patrones positivos de emisión, sino también valiosa para visualizar la verdadera naturaleza 3D de los especímenes.

La Figura 6 muestra las imágenes de un ordenador generados por el modelo, con los colores en consonancia con las anteriores imágenes y figuras. Este método de volumen ayuda a hacer hincapié en las pautas de localización 3D de HBD-3, y demuestra aún más la localización de HBD-3 para las células dendríticas en la epidermis. Cada una de las imágenes en la figura se produce por la rotación secuencial de la adquisición a lo largo de los 3 ejes.

DISCUSIÓN

La presencia de antimicrobianos naturales en la piel desempeña un papel importante en el cuerpo de defensas naturales, y la pérdida de estos compuestos reduce nuestra capacidad para luchar contra la infección y sepsis. 1, 10 Esto es particularmente cierto en los casos de lesiones térmicas, en el que la resultante sepsis es a menudo fatal. 10 La agresión térmica resultados en la remoción o destrucción de los cruces y apretado intercelular-fosfolípido lípidos entorno defensas. Por lo tanto, sería beneficiosa para determinar que los antimicrobianos, en su caso, después de permanecer lesión por quemaduras ha eliminado o destruido los queratinocitos epidérmicos. Además, determinar qué tipos de células específicas a seguir después de sintetizar los antimicrobianos lesión por quemaduras nos permitiría seguir el cultivo de células de investigación para identificar a una mejor matriz para su aplicación en las heridas. Por último, también sería beneficiosa para determinar si los antibióticos restantes upregulation en las células y las estructuras después de daño térmico es algo que debe proseguirse con firmeza.

Nuestros trabajos anteriores 7, 8 demostrado la pérdida de la epidermis HBD-2 después de lesiones térmicas, incluso en pequeñas manchas de la epidermis restantes. Por otra parte, defensin se ha encontrado a estar ausente de quemar blister líquido. 11 Sin embargo, informó de que HBD-2 se encuentra en profundo, las células dérmicas de la piel quemada, y este hecho nos dirige a la hipótesis de que la glándula Ecrinos epitelios, o el pelo de raíz melanocitos asociados, podrían ser potenciales fábricas para la producción y los antibióticos específicos que tipos de células pueden ser cultivadas para la producción y la cosecha de defensinas para producir un agente tópico, cubrir la herida o matriz. Por otra parte, upregulation de antimicrobianos producción de células específicas de la dermis sería un complemento beneficioso en el tratamiento de heridas y para combatir la infección.

En nuestros estudios recientes, imágenes muestras de piel para localizar los antimicrobianos naturales antes y después de lesiones térmicas para determinar cuánto de esta barrera natural de defensa contra la infección había sido destruida y para determinar si otras células y las estructuras más profundas de la piel debe tenerse en cuenta para futuras células la cultura y la producción de antimicrobianos experimentación. Hemos empleado la microscopía de fluorescencia deconvolución para producir en 3D, imágenes volumen (generados por ordenador, modelos virtuales), 12 lo que nos permitió determinar a qué tipo de células (s) de cada uno de los antimicrobianos se pueden encontrar. Imaging puso de manifiesto que gran parte de este mecanismo de defensa antimicrobiana ha sido destruida después de lesiones térmicas, con HBD-1, sino todos los desaparecidos de la piel, excepto en clumped conglomerados cerca de las zonas donde los corpúsculos de Meissner podrían encontrarse. HBD-2 ofreció una fluorescencia positiva en la capa cutánea reticular, agrupadas en torno a las células Ecrinos. HBD-3 estuvo presente en un clumped patrón, y no parece estar asociado con un determinado tipo de células o estructura cutánea. La Policía Nacional de Haití se encuentra cerca de los buques más grandes ya lo largo de pelo, y LL-37, tuvieron una elevada intensidad colocalizations con el sudor conductos.

Por lo tanto, demuestra que los antimicrobianos naturales se sintetizan en las partes más profundas de la piel quemada y que células que no sean los queratinocitos que hacen estos compuestos son Ecrinos epitelios, epitelios de conductos, y las células se encuentran en la base de las raíces del cabello y el cabello bulbos. Por lo tanto, podemos preguntarnos que cuando las células son cultivadas para obtener un adecuado que cubra la herida matriz, en caso de que el coculture, y / o admixing, de otros tipos de células con queratinocitos nos da cierta base para un tratamiento tópico en el que múltiples antimicrobianos son producidos, o ¿hay drogas o productos químicos que nos permitirá específicos tipos de células para inducir una mayor síntesis de estas defensinas en la piel restantes elementos siguientes lesión por quemaduras?

Este trabajo nos da más información sobre el papel de los péptidos antimicrobianos en la piel quemada y sus mecanismos de protección. Este informe también demuestra el uso de microscopía de fluorescencia, no sólo en la escena de la investigación, sino también como una valiosa herramienta de gran alcance y en los estudios patológicos. Cuestiones pendientes relativas a futuros estudios en terapias que podrían ser desarrollados para luchar contra la quema sepsis e iniciar una rápida respuesta de curación. Junto con las cada vez mejora la especificidad de las sondas fluorescentes y anticuerpos, y la continua evolución de los mejores microscopios, deberíamos considerar seriamente la posibilidad de más, todos los días utiliza la fluorescencia para la orientación.