Journal of Burns and Wounds, 2005; 4: (más artículos en esta revista)

Promueve la colagenasa respuestas celulares a las lesiones y la cicatrización de la herida en vivo

Abrir las ciencias Company, LLC
N. Kathleen Riley, Ira M. Herman

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Resumen

Objetivo: Este estudio se centra en el crecimiento de la migración y la promoción de la mejora de clostridial papel que desempeña la colagenasa in vitro e in vivo. Métodos: Para los estudios in vitro, biosynthesized extracelular matrices fueron tratados con colagenasa purificada clostridial, inespecífico proteasas, o los controles de amortiguación. Los queratinocitos fueron posteriormente chapada a estas matrices en la presencia o ausencia de clostridial colagenasa y / o heparina-epidérmica vinculante-como factor de crecimiento, y la proliferación celular y la migración fueron cuantificados. Para examinar los efectos de la colagenasa clostridial in vivo, se les practicó un doble-ciego de espesor total heridas en la espalda de Yucatán Micropigs, las pruebas de los efectos de la colagenasa purificada clostridial, Regranex (PDGF-BB), y Solosite (carboximetil celulosa) en la cicatrización de heridas. Resultados: Los estudios in vitro: Matrix pretratamiento con clostridial colagenasa estimula a 2 veces mayor en la proliferación y migración postinjury; cuando clostridial colagenasa y / o heparina vinculante epidérmica factor de crecimiento similar se añaden a los medios de cultivo, hay un nuevo duplicación del crecimiento y la migración, produciendo aproximadamente 5 veces el aumento de la proliferación de queratinocitos y la migración. Papaína-urea tratamiento en condiciones similares resultados en un 50% de disminución en la celda número más de un 1 semana de tiempo. Estudios in vivo: En todos los parámetros medidos, incluida la formación de tejido de granulación, inflamación, re-epithelization, y el tiempo de cierre de heridas, clostridial colagenasa purificada fue superior (análisis de varianza, P> .05) con otros tratamientos probados. Conclusión: Sobre la base de estas conclusiones, llegamos a la conclusión de que la colagenasa clostridial queratinocitos estimula las respuestas celulares a la lesión in vitro y puede representar un nuevo enfoque terapéutico para la promoción de la cicatrización de la herida en vivo.

Los queratinocitos membrana basal sirve como un andamio y una señalización matriz macromolecular responsable de regular el comportamiento de células durante el desarrollo, la vida adulta, y la cicatrización de heridas. Sintetizado y organizado por los queratinocitos, los componentes de la matriz desempeñar un papel central en la orquestación de la proliferación epitelial, el 1 de adherencia, el 2 de la migración y 3, incluidas las respuestas celulares a una lesión. Glicoproteínas y proteoglicanos no sólo proporcionan un andamiaje físico para las células epiteliales, pero también puede secuestrar y obligar a las moléculas de señalización, incluidos los miembros del factor de crecimiento epidérmico (EGF), el 4 de fibroblastos y queratinocitos del factor de crecimiento, 5, 6 y transformación del factor de crecimiento familias. 7 queratinocitos transduce señales de estos matriz determinada o factores de crecimiento solubles a través de su alta afinidad de tirosina y serina / treonina quinasa de receptores del factor de crecimiento, completando así esta cascada de señales bioquímicas.

Queratinocitos respuesta a la matriz extracelular implica el control de la expresión, activación, y la localización de los receptores de la matriz que transduce señales asociadas. Por ejemplo, la activación y la reubicación de los receptores de la integrina en respuesta a lesiones es fundamental para el inicio de la cicatrización de heridas. En la zona de la herida, queratinocitos entran en contacto con el recién expuestos matriz dérmica, que contiene colágeno de tipo I y laminina 5 que no se encuentra en los queratinocitos intacta la membrana basal, por lo general compuesto de colágeno IV, laminina 1, fibronectina, y otras moléculas. 8, 9 El recién expuestos los componentes de la matriz dérmica y obligará a activar los receptores de la integrina α2β1, provocando su traslado al sitio de lesión, lo que permite a los queratinocitos a que se adhieran a la matriz dérmica expuestas y comenzar la migración en la zona de la herida. 10 Expresión de α-V β5 integrina también es inducida en el borde de la herida, y también promueve la migración. 11 Curiosamente, los ratones knockout que carecen de la subunidad β1 integrina mostrar la morfología anormal de los queratinocitos y son muy deficientes en la cicatrización de heridas a causa de defectos de adherencia, migración y proliferación 12.

Además de las modificaciones visto en los receptores de la integrina repertorio durante la cicatrización de la herida, lesionada queratinocitos liberación factores de crecimiento y metaloproteinasas de la matriz (MMPs) para estimular su integrina mediada por la migración. 13, 14 Factores de crecimiento, tales como la heparina vinculante del factor de crecimiento epidérmico (HbEGF ), Son producidos por los queratinocitos en una membrana de forma dependiente. En respuesta a una lesión, es HbEGF exfoliados y extracelulares liberados por el MMP-3, o Stromelysin I. 15 queratinocitos también producen MMP-1, MMP-2 y MMP-9, todos los cuales ayudan a remodelar la matriz, lo que permite a las células migran en y cerrar la herida. 9, 16 - 18 MMP producción es estimulada por la presencia de sustratos objetivo y los factores de crecimiento,. 9, 16, 19 - 21 y MMP-1 también puede ser obligado por la integrina α2β1 dirigidos por la degradación del colágeno. 22 Cuando se completa curación y la herida está cerrada, el remodelado matriz a través de señales de integrinas a downregulate queratinocitos MMP factor de crecimiento y producción 9.

En circunstancias normales, el intercambio dinámico entre los queratinocitos y la matriz de resultados en completar la herida cierre y regeneración de la dermis y epidermis. Sin embargo, algunas heridas no sanan con normalidad y convertirse en crónica. Heridas crónicas muestran un perfil diferente de curación que de normal de las heridas agudas, 23, 24 permanecen en un estado inflamado durante períodos prolongados de tiempo. Heridas crónicas son a menudo exacerbada por factores intrínsecos, como el exceso de citoquinas inflamatorias y la mala vascularización / isquemia. 25 La desregulación de las integrinas 26 y sobreabundancia de MMPs, 27 - 29, así como la falta de tejido-específico de los inhibidores de MMPs, 30 también puede dar lugar a las heridas crónicas. Estas heridas casi siempre requieren de intervención clínica con el fin de que se produzca la curación.

Debido a la fluctuación de equilibrio y la inhibición de la activación de las señales que son inducidos durante la cicatrización de la herida, nos preguntamos si la aplicación exógena de factores que regulan la cicatrización normal podría acelerar el agudo proceso de curación, o activar la cicatrización de heridas crónicas. Hemos demostrado anteriormente que la colagenasa de la bacteria Clostridium promueve la migración y la proliferación de las células endoteliales vasculares y queratinocitos 31 después de la lesión, con una eficiencia de más del doble que la colagenasa de mamíferos. Aunque las enzimas de mamíferos cleave colágeno a un sitio para producir un cuarto y tres cuartos de tamaño de los fragmentos, 32 clostridial colagenasa cleaves los 3 dominios helicoidales para producir varios productos de degradación. 33, 34

También ha habido un gran interés en la papaya derivados de la proteasa papaína, como inicialmente informaron de una herida de trato 4 décadas atrás. 35 La investigación es aún en curso en el papel exacto que esta enzima puede tener en la promoción de la cicatrización, 36 a pesar de que está actualmente clasificado como un agente debriding enzimática. Hemos examinado sus efectos sobre los queratinocitos in vitro para determinar si su eficacia clínica puede deberse a la promoción de la proliferación de queratinocitos y / o la motilidad. También hemos renovado la colagenasa clostridial experimentos en los queratinocitos, y la ampliación de nuestra investigación para incluir un vivo en la cicatrización de la herida ensayo sobre la peste porcina en miniatura. En nuestro estudio in vivo, hemos clostridial colagenasa en comparación con 2 preparaciones comercialmente disponibles, Regranex, el ingrediente activo de las cuales es PDGF-BB, y Solosite, una cruz de carboximetil celulosa vinculadas a base de hidrogel que mantenga un medio ambiente húmedo de curación, así como como una gasa estéril control negativo. En general, esperamos para aclarar el papel que la colagenasa clostridial puede jugar como un agente de la cicatrización de heridas.

MÉTODOS
Células

Queratinocitos del epitelio normal aisladas de los queratinocitos epidérmicos humanos (NHEK) fueron adquiridos de Clonetics (Walkersville, Md) y cultivadas por completo el medio de cultivo de queratinocitos (kgm, Clonetics) a 175 cm 2 frascos de cultivo de tejidos (Costar) tal como está descrita anteriormente. 31 celdas fueron passaged con tripsina, quenched con soporte de 5% suero bovino ternero, lavarse con buffer fosfato salino-, y en replated kgm a una proporción de 1:4 para la propagación de células y se especifica en el número de células para todos los experimentos. Las células fueron alimentados cada dos días de completar el intercambio con los medios de comunicación fresca kgm. En todos los experimentos factores solubles que se han añadido a los medios de cultivo, estos factores se añadieron en el momento de la célula en placas, y reponer las células que fueron alimentados en días alternos. HbEGF se obtuvo de Oncogene, San Diego, California

Preparativos Matrix

Matrix preparativos se hicieron como se describe anteriormente. 31 Brevemente, las células del endotelio capilar a 10 días postconfluence fueron puestos en libertad de su matriz de amortiguación con DOC (0,5% de sodio deoxycholate, 0,02 M Tris-Cl [pH 8,0], 0,015 M NaCl, 0,001 M EGTA [ pH 7,0], 0,001 M phenylmethyl sulfonil fluoruro), y el resto de la matriz se lava con buffer fosfato salino-. Las enzimas utilizadas para la matriz digestiones se calcio diluido en solución salina amortiguadora-, para un total de 250 μ l por pocillo en un 24 y placa. Digestiones se realizaron a 37 ° C durante 1 hora en una incubadora de cultivo celular. Tras la digestión o el control del tratamiento con calcio por sí solo solución salina amortiguadora, la matriz se lava con buffer fosfato salino-y luego dejarse que en kgm durante 15 minutos a 37 ° C. El kgm fue removido, y NHEK células fueron puestos en libertad de frascos con tripsina, contados, y chapada a la matriz en fresco kgm. A principios de los experimentos publicados indican que la dosis de enzima utilizada para el tratamiento matriz no afectan a la eficiencia en placas de los queratinocitos 31.

Enzimas

Las enzimas utilizadas para la matriz extracelular se digestión colagenasa purificada de Clostridium, crudo colagenasa, y clostripain (Advanced Biofactures Corp, Lynbrook, NY), al igual que en anteriores experimentos. 31 Una mezcla de papaína y el 1% de urea (Beckton Dickinson, Sparks, Md) También probó, 36 - 39 con o sin la adición de chlorophyllin (Beckton Dickinson). 40 - 42 Todas las dosis son el tratamiento dado en este tipo de unidades de actividad enzimática.

La proliferación de las células de ensayo

Crecimiento ensayos se realizaron tal como está descrita anteriormente. 31 Brevemente, NHEK células fueron liberados de la matriz con la tripsina, diluido en Isoton II electrolito de amortiguación (Beckman, Fullerton, CA) para contar en un Coulter contra el modelo ZF (Coulter Electronics, Miami, FLA) . Condiciones experimentales fueron chapados en doble ejemplar, y cada muestra se había contado dos veces. Cada condición fue probada en al menos 3 experimentos independientes. Los datos se registran manualmente y analizados en Microsoft Excel (Microsoft, San Jose, Calif).

La migración de células de ensayo

Para los estudios de motilidad, la matriz se ha preparado en 10 mm 2 hojas de vidrio (Corning, Big Flats, NY), tal como se describe más arriba. NHEK células fueron chapados a la confluencia en la matriz resultante y permite adjuntar a la noche a la mañana. Monocapas de células resultaron heridos con un incendio-pulido pasteur pipeta para crear una pequeña herida cero. Los heridos fueron controlados a las poblaciones a través del tiempo-lapso de imágenes, tal como está descrita anteriormente. 43 motilidad relativa se calculó comparando el cambio en la zona cubierta por las células del mismo tamaño sobre el terreno: durante el mismo período de tiempo para diferentes condiciones de tratamiento.

La cicatrización de la herida estudio

Un espesor total cicatrización de la herida estudio sobre la peste porcina se realizó por América del Norte Ciencia Associates (NAMSA), Northwood, Ohio, de acuerdo con los Institutos Nacionales de Salud directrices para el tratamiento de animales de laboratorio. Los tratamientos probados fueron (1) Clostridium colagenasa bacteriana en pomada, (2) Regranex gel, (3) Solosite gel, y (4) gasa estéril seca como un control negativo. El estudio se realizó en 8 mujeres adultos sanos Micro-Yucatán Miniature la especie porcina (Sus scrofa domesticus), seleccionados en función de su utilización en otras investigaciones publicadas y su similitud de la cicatrización de heridas a los seres humanos. Cada animal recibió ocho de 2 cm de diámetro espesor total heridas en la espalda, mientras que bajo anestesia general. La presión se aplicó para detener la hemorragia antes de cualquier tratamiento o vestirse se haya colocado en el Día 0. Dos heridas en cada uno de los cerdos fueron vestidos con cada una de las 4 condiciones de tratamiento, con lugares (craneal a caudal) al azar. Clostridial colagenasa se preparó en 1000 U / g de pomada. Norma comercial de los preparativos y Regranex Solosite se utilizaron. Ungüentos se aplicaron a 0,25 g / d, de acuerdo a las instrucciones de uso de los productos comerciales. Tratados heridas estaban cubiertas con OpSite Flexgrid, la transparencia de las curaciones. El control seca heridas estaban cubiertas con gasa estéril. Todos los vendajes y apósitos se cambiaron todos los días. Los apósitos de gasa fueron retirados cuidadosamente por un veterinario, quien observó una interrupción mínima para las heridas debido a la humedad exudación de la herida. Las observaciones se registraron a diario para cada herida, tales como el diámetro, color, exudación, y epithelization, en un doble ciego. Zona de la herida fue calculada a partir de los trazados realizados en plástico transparente durante los exámenes diarios. A raíz de observaciones diarias, el área fue herida suavemente enjuagarse con solución salina estéril y secar con gasa estéril para permitir la adherencia del nuevo apósito. Vigorosa enrojecimiento de la herida en sí no se realizó.

Al concluir el estudio, cada herida fue eliminado, con un 1 a 2 cm frontera de la piel intacta, para el procesamiento histológico. Cada muestra se fijó en 10% neutros formalina tamponada, incrustado, seccionadas y teñidas con hematoxilina y eosina. Dos secciones de cada una herida muestra: uno a través de la central de diámetro de la herida y una sección paralela de un lado a mitad de camino hasta el borde del defecto original. Epithelization se registró a partir de la sección central de cada una herida como el porcentaje del defecto cubierto por bien definidos cutánea epitelio.

RESULTADOS
Proliferación in vitro

Para simular la vivo en la membrana basal de los queratinocitos, hemos utilizado la biomatrix confluente generados por las células endoteliales capilares, que se ha demostrado que contienen fibronectina, laminina, y colágeno de tipo I, III, IV y 44. Tratamiento de la endotelial producida biomatrix con colagenasa bacteriana purificada antes de placas causó un aproximado de duplicación en la proliferación de queratinocitos, en comparación con las células en la matriz sin tratar (Tabla 1]. La adición de HbEGF 14, 31, 45 a los medios de cultivo también fue probado en ensayos de proliferación. La adición de 0,1 ng / mL HbEGF a las células en la matriz sin tratar causó un 1,4 veces mayor en la proliferación de los controles después de más de 7 días, pero cuando se añade a las células que crecen en la colagenasa-digerido matriz, la proliferación casi se triplicó. Tratamiento de la matriz con la colagenasa crudo, que contiene proteasas otros inespecíficos, sólo causó un ligero aumento en número de células en los controles. Clostripain, una proteasa purificada inespecíficos, incluso produjo un menor aumento de la proliferación. Pretratamiento de la matriz con urea y papaína, 36, 38, 46 con o sin chlorophyllin, la disminución de la proliferación celular a la mitad de los números de control. A continuación pregunta si además de la colagenasa a los medios de cultivo que afectan a la proliferación, solo o en combinación con matriz de pretratamiento (Tabla 1]. Sin tratar en la matriz, incubando las células con 16 U / mL colagenasa soluble en el medio de cultivo resultó en un 1.6 veces mayor en la proliferación. Cuando las células fueron cultivadas en la matriz pretratadas con colagenasa, y se incuban con la misma dosis de enzima soluble, el total de proliferación fue de 4,5 veces mayor que para el control, casi el doble y el resultado visto tratada con matriz por sí sola.

In vitro de la motilidad

Para evaluar el efecto de la colagenasa bacteriana sobre la motilidad celular, se utilizó la microscopía de imagen digital para vigilar el ritmo al que una monocapa celular confluente es capaz de cerrar una pequeña herida. En todas las condiciones, los queratinocitos en la herida borde primero elaborar una membrana ventilador, y luego separar el borde y, por último tirar el núcleo y el cuerpo celular hacia adelante hacia la vanguardia. Como esto ocurre, las células más lejos de la herida borde extendido a llenar el nuevo espacio disponible. En la matriz pretratadas con colagenasa, las células a la vanguardia extender una membrana mucho más tiempo antes de ventilador translocating el resto de la célula, con lo cual se cubrirá una mayor distancia en un período más corto de tiempo (Figs. 1C y 1D]. En general, los queratinocitos motilidad se incrementó casi 8 veces más cuando los controles ensayados en tratados matriz, en presencia de HbEGF colagenasa y soluble (Fig. 1E]. Time-lapse imágenes digitales se pueden ver como películas de QuickTime en http://www.journalofburnsandwounds.com .

En vivo

Con el fin de determinar si el aumento de la proliferación y migración visto in vitro se traduciría en la promoción de la cicatrización en vivo, un doble ciego estudio de espesor total heridas en Yucatán Micropigs fue llevada a cabo por NAMSA. Observaciones superficiales de la herida y el exudado de color no varió notablemente entre las condiciones de tratamiento. Tejido de granulación desarrollado más lentamente en el control de las heridas que en los tratados heridas, pero no obvia diferencia se observó entre las condiciones de tratamiento. En el análisis de la zona de la herida como un porcentaje de la herida original, se constató que la colagenasa global acelera la cicatrización (Fig 2]. Las diferencias entre las condiciones de tratamiento se convirtieron en estadísticamente significativa (análisis de varianza, P <.05) a partir del día 6 del juicio, cuando la zona de la herida comenzó a disminuir. Las diferencias entre la colagenasa y Solosite o colagenasa y se convirtió en Regranex significativa (test de Tukey, P <.05) de Día 7 en adelante. La diferencia entre la condición de la colagenasa y la condición de control fue significativa (test de Tukey, P <.05) de Día 4. La zona de la herida cubierta por nuevo tejido epitelial en la terminal de histología las muestras también fue mayor con el tratamiento que la colagenasa con Regranex, Solosite, o el seco de control (Fig 3]. Esta mejora de re-epithelization fue acompañado por una disminución observada en el tejido de granulación en la colagenasa-tratadas las heridas (no se muestra). La mejora de las condiciones de la colagenasa tratados heridas pueden verse en las fotografías tomadas en el día 10 después de herir (Fig 4].

DISCUSIÓN

A través de nuestros experimentos, hemos reafirmado que el tratamiento previo de un biosynthesized matriz extracelular de la colagenasa clostridial queratinocitos humanos promueve las respuestas a las lesiones. Colagenasa actos a través de múltiples vías de señalización, aumentar la proliferación y migración in vitro. Es eficaz a través de pretratamiento de la matriz y / o su presencia en los medios de cultivo. Curiosamente, los efectos de la colagenasa se potenció fuertemente por la inclusión de HbEGF, que es prevalente en vivo en las heridas. 13, 14 A través de una combinación de matriz de pretratamiento y la adición de la colagenasa soluble y / o HbEGF en los medios de cultivo, la proliferación de queratinocitos puede potenció 5 veces. Queratinocitos migración tras lesión in vitro también es mayor. Papaína-urea, solo o en combinación con chlorophyllin, actualmente en uso clínico para el desbridamiento enzimático de las heridas, 36 inhibe la proliferación de queratinocitos in vitro, a lo largo de una amplia gama de dosis ensayado. Es importante destacar que la colagenasa purificada clostridial también promovió el celular las respuestas a una lesión en vivo, lo que resulta en la reducción de tejido de granulación, el aumento de las tasas de re-epithelization, y un intervalo más breve a la herida cierre.

Pretratamiento de biosynthesized matriz extracelular, 47, que es análoga a la de queratinocitos humanos de la membrana basal, con clostridial colagenasa promovido la proliferación celular (Tabla 1] y migración (Fig 1]. Estos resultados se apoyan en trabajos anteriores de este laboratorio en las células endoteliales vasculares que migran en respuesta a una lesión. 44, 48 Además, la colagenasa endógena se ha demostrado que promover la migración de queratinocitos in vitro. 16, 49 Colectivamente, estos resultados apuntan al importante papel que la colagenasa y otras MMPs desempeñar en la modulación de las respuestas celulares a las lesiones y la cicatrización de heridas.

La inclusión de clostridial colagenasa en el crecimiento de los medios de comunicación, sola o además de la matriz de pretratamiento, también fue capaz de estimular la respuesta a los queratinocitos lesión (Tabla 1]. Por otra parte, HbEGF estimulado la proliferación de queratinocitos in vitro, así como potenciar la migración de mejorar los efectos de la colagenasa clostridial (Tabla 1]. Se ha demostrado in vitro que stromelysin, o MMP-3, 15 es capaz de cleave HbEGF a la juxtamembrane sitio, liberando la madurez, forma soluble del factor de crecimiento para la señal en una o paracrina juxtacrine moda. Curiosamente, MMP-3 cleaves HbEGF con éxito, pero MMP-2 y MMP-9 no. Otros estudios in vitro han demostrado que las membranas de tipo MMP-1 y cleave puede activar pro-α V, -3 y -5 integrinas. 49, 50 A través de su tratamiento de la integrina α V subunidad, MT-MMP-1 previene la represión de el colágeno vinculante de los receptores α2β1 α β3 V, 51 con el efecto global sobre la promoción de la migración de tipo I colágeno. Estos datos indican que la membrana asociada a factores de crecimiento y los receptores pueden ser puestos en libertad y / o activado a través de MMP. Del mismo modo, poniendo en libertad a la activación endógena y promotores del crecimiento y la migración, la colagenasa clostridial puede ser capaz de inducir respuestas de los queratinocitos a una lesión.

Nuestra vivo en la cicatrización de la herida estudio sobre la peste porcina se extiende nuestros resultados in vitro que clostridial colagenasa promueve la proliferación de las células epiteliales y la migración al revelar que la aplicación directa de la colagenasa purificada clostridial a espesor total heridas promueve la cicatrización de heridas y mejora la salud en comparación con otros preparados comerciales o prueba controles sin tratar. Existen numerosos informes que indican que varios tipos de colagenasa ya han sido probadas y están en uso clínico como enzimática debriding agentes. 52 - 56 A partir de los estudios utilizando los preparativos de la colagenasa clostridial, 57, 58 hay muchas pruebas que indiquen que la colagenasa no sólo con éxito debrides heridas sino que también acelera la herida cierre. 53 En conjunto, estos resultados apuntan a una prometedora para la colagenasa papel en la promoción de agudos y crónicos de la cicatrización de heridas.

Los autores agradecen útil para las discusiones con Dave Brett, y también las gracias al personal veterinario a NAMSA para su continua asistencia. Esta obra fue financiada en parte por una subvención del NIH (EY 09033) y de una beca de investigación de Smith & Nephew, Inc