Frontiers in Zoology, 2006; 3: 7-7 (más artículos en esta revista)

Neuroactive sustancias específicamente modular cuerpo contracciones rítmicas en la nerveless metazoon Tethya wilhelma (Demospongiae, Porifera)

BioMed Central
Kornelia Ellwanger (kornelia.ellwanger @ izi.uni-stuttgart.de) [1], Michael Níquel (michael.nickel @ bio.uni-stuttgart.de) [1]
[1] Departamento de Zoología, Instituto Biológico de la Universidad de Stuttgart, 70550 Stuttgart, Alemania

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Resumen
Fondo

Esponjas (Porifera) son los nervios y muscleless metazoa, pero coordinada de motor mostrar reacciones. Por lo tanto, representan una valiosa filo para investigar los sistemas de coordinación, que evolucionó en un hipotético Urmetazoon antes de que el sistema nervioso central (SNC) después de metazoa. Hemos elegido el contráctil y la locomotora especies Tethya wilhelma (Demospongiae, Hadromerida) como un modelo para nuestro sistema de investigación, utilizando el análisis cuantitativo sobre la base de lapso de tiempo digital de imágenes. Con el fin de evaluar las vías de coordinación candidato, extracorporeally a prueba una serie de mensajeros químicos, agonistas y antagonistas de sustancias químicas conocidas vías de señalización en los animales con el SNC.

Resultados

Esponja cuerpo contracción de T. wilhelma fue inducida por la cafeína, glicina, serotonine, el óxido nítrico (NO) y extracelular adenosina monofosfato cíclico (AMPc). La inducción de la glicina y el campamento seguido patrones diferentes de otras sustancias. Inducción de cAMP se retrasó, mientras que la glicina dar lugar a una bi-phasic contracción respuesta. La frecuencia de la contracción del ritmo endógeno de T. wilhelma fue significativamente disminuido por la adrenalina y el NO, con la misma tendencia para el campamento y la acetilcolina. En contraste, la cafeína y el aumento de la glicina contracción frecuencia. El ritmo endógeno parece irregulares durante la aplicación de la cafeína, adrenalina, el NO y el campamento. La cafeína, glicina y NO atenuada la contracción de amplitud. Todos los efectos sobre el ritmo endógeno fueron neutralizados por el lavado de las sustancias de reactor experimental el sistema.

Conclusión

Nuestro estudio demuestra que una serie de mensajeros químicos, agonistas y antagonistas de inducir la contracción y / o modular la contracción del ritmo endógeno y la amplitud de nuestra nerveless modelo metazoon T. wilhelma. Llegamos a la conclusión de que un relativamente complejo sistema de mensajeros químicos regula el comportamiento de contracción a través de auto-paracrinos y señalización, que se presenta en un hipotético modelo. Suponemos que adrenérgicos, adenosynergic y glycinergic vías, así como las vías sobre la base de NO cAMP extracelular y son candidatos para la regulación y el momento de la contracción del ritmo endógeno dentro de las células marcapasos, mientras que GABA, glutamato y serotonine son candidatos para la coordinación directa de la células contráctiles.

Fondo

Nerveless son esponjas y animales multicelulares muscleless, que surgió durante la temprana evolución de los metazoa [1]. Por lo tanto, esponjas representan valioso modelo para los sistemas de concluir a un hipotético Urmetazoa, a partir de la cual el metazoan bodyplan evolucionado [2 - 4]. A pesar de que las esponjas no poseen músculos y sistema nervioso, son capaces de reaccionar a estímulos externos [5 - 7], para mover [7 - 10], para contratar [resume en 7], y mostrar los ritmos diurnos [ 7, 11]. La primera descripción de esa esponja comportamiento se remonta a Aristóteles, quien mencionó la contracción de vida esponjas, cuando se tocó y recogidos por los seres humanos para la producción de esponjas de baño [12].

El putativo mecanismos de coordinación han sido discutidos en detalle durante el último siglo, con un enfoque principal sobre el tema en los años 1960 y 1970 [8, 13 - 15], que conducen a la aceptación general de que las esponjas no poseen un sistema nervioso. Sin embargo, las preguntas para el sistema nervioso como los mecanismos de coordinación se han planteado de nuevo de vez en cuando debido a las nuevas conclusiones, como potenciales de acción en el Hexactinellida [16 - 18] o la caracterización de un GABA y glutamato-como receptor de Geodia cydonium [19 ].

Jones [8] presenta una de las más amplias discusiones de los sistemas de coordinación en las esponjas. Como alternativa hipotética señal de los sistemas de conducción en las esponjas que el nombre: (a) local caída de presión dentro del canal del sistema, que se transmitirá a través del sistema para inducir contracción en lugares distantes de la esponja, (b) la conducción mecánica de contracción a través de las fuerzas interconectado contractible tejido esponja (se supone que la continua pinacoderm), (c) un mensajero químico, distribuido por el sistema de aquiferous; (d) un mensajero químico a través de la difusión de mesohyle; (e) la distribución de potenciales de acción de los cruces intercelular. Aunque Jones parece preferir el mecanismo mecánico basado en hipótesis, afirma que "claramente el mecanismo no puede ser un simple" (p. 41). Sin embargo, a pesar de mecánica de conducción podría explicar la transmisión de una información física, no puede explicar cómo los ritmos endógenos se generan y coordinada. Esto es especialmente importante en relación con la diurna patrones se encuentran en las esponjas [7, 11]. En este contexto, químicos basados en los sistemas de mensajería, a través específicas ligando-receptor interacciones, parecen ser más probable. De hecho, una serie de transmisores, los mensajeros químicos, los receptores agonistas y antagonistas se han puesto a prueba en las esponjas. Los primeros experimentos se remontan a Lendenfeld al final del siglo 19 [20]. Estos fueron seguidos por otros, en parte con resultados contradictorios, por ejemplo, informes positivos a la acetilcolina en las esponjas por algunos investigadores [21, 22] y los informes negativos de otros [5, 23 - 25]. Sin embargo, esta incoherencia de los resultados puede explicarse en parte por razones técnicas y el hecho de que diferentes marcadores, esponja especies de esponjas y las reacciones (contracción, los conflictos internos actuales, estado de la oscule) fueron considerados. Además, algunos de estos experimentos sufrido la falta de precisión de los métodos de medición cuantitativa.

Para superar estos problemas, hemos establecido un modelo de sistema, basado en la locomotora contráctil y esponja Tethya wilhelma (Demospongiae, Hadromerida; Fig. 1], que ha sido descrito de un acuario de hábitat recientemente y puede ser mantenido y se han criado en el acuario [ 7, 26 - 30]. El uso de lapso de tiempo digital de imágenes de la esponja cuerpo, en relación con el análisis cuantitativo de imágenes, nos permite registrar y analizar el comportamiento y las reacciones de la esponja de medir cuantitativamente los cambios proyectados de la zona corporal (por el principio ver en la figura 1. ). Utilizando esta metodología, uno de nosotros ha demostrado recientemente que T. wilhelma muestra un ritmo de contracción endógeno, que es diurna y puede ser perturbada por los acontecimientos externos. Este comportamiento caracteriza integrador T. wilhelma como un sistema modelo valioso para la investigación sobre la coordinación en metazoa basal [7]. Por otra parte, hemos demostrado que la contracción de T. wilhelma es inducible por mensajeros químicos y que caracteriza la especificidad, la dosis y la respuesta y la cinética de la contracción de la neuroactive aminoácidos γ-amino ácido butírico (GABA) y glutamato [31], dando pruebas para detectar la presencia de un mecanismo de coordinación GABAérgicas en las esponjas.

En el presente estudio se evaluaron los efectos de una serie de sustancias a nuestro modelo de esponja, por medio de la inducción de la contracción y la interferencia con la contracción del ritmo endógeno y amplitud. Hemos elegido a través de sustancias que actúan ligando-receptor de los sistemas, que son las que se sabe están implicadas en la regulación de los comportamientos de metazoa con los sistemas nervioso central (CNS): la acetilcolina y la nicotina, cafeína, glicina, la adrenalina, serotonine, el óxido nítrico y de AMP cíclico. La mayoría de estas sustancias han sido previamente probado en varias esponjas bajo diferentes condiciones y los set-ups de diversos investigadores esponja como se muestra arriba. En contraste, se utilizó una semi-cerrado reactor experimental, bajo condiciones experimentales reproducibles. El objetivo del presente estudio fue demostrar que la contracción, endógeno ritmo y la fuerza de contracción son específicamente modulada por varios neuroactive sustancias químicas. En consecuencia, destinadas a añadir más detalles a nuestro hipotético mensajero químico a base de modelo de coordinación, presentado antes del [31]. Además, el presente estudio debe ayudarnos a identificar ligando-receptor sistema candidatos, que merecen más detallada fisiológicos y moleculares en la caracterización de T. wilhelma y, eventualmente, otros modelos de esponja.

Resultados
Acetilcolina y la nicotina

Para la acetilcolina, hemos probado las concentraciones entre 40 μ m y 2,8 mm (Fig. 1a], por la nicotina, hemos probado las concentraciones de 25 μ M a 50 μ m (Fig. 1b]. Ni la acetilcolina, ni las contracciones inducidas por la nicotina o alterado el ritmo endógeno contracción o amplitud a primera vista. En ambos casos, las contracciones son endógenas rítmica e igualmente fuerte, correr como las ondas sobre el cuerpo de la esponja de la zona basal archivo adjunto a la parte apical de Tethya (véase la disposición 1: Movie_S1.mov). Sin embargo, comparar la duración de la contracción del ciclo (D cc) estadísticamente, reveló una ligera pero significativamente prolongado ciclo de duración de la exposición la acetilcolina, mientras que no se encontraron diferencias significativas para la nicotina (Tab. 1].

La cafeína

En todos los experimentos, las contracciones inducidas por la cafeína en concentraciones de 257 μ M y 515 μ M, respectivamente. En contraste con el anteriormente casi inmediata inducción de glutamato y GABA [31], la cafeína inducida por la contracción tiene un retraso de varios minutos en la mayoría de los casos (Fig. 3a, b, d], aunque inmediata aparición puede ocurrir también (Fig. 3 B ). En un caso, encontramos un espasmo-como reacción de T. wilhelma exposición a la cafeína. Este espasmo se asemeja en gran medida los espasmos, que puede ser inducido por GABA [31]. Después de regular las contracciones y expansiones de la esponja es estimulado por la cafeína, los contratos y se mantiene en un estado casi contratado, con una rápida progresión de menor expansiones y contracciones (Fig. 3b]. El lapso de tiempo de grabación muestra que la esponja no tejido en un contrato temporal de forma coordinada (véase la disposición 2: Movie_S2.mov). Local contracciones y expansiones de partes de la esponja el tejido se producen simultáneamente, agitando la esponja en un espasmo de la misma manera.

Además, la cafeína desencadenado efectos a largo plazo, modificando tanto, D cc y la fuerza de la contracción global. El D cc se acorta considerablemente durante largo plazo la cafeína exposición (Tab. 1], pero el efecto se suspende por lavado de cafeína de la reactor experimental. Lo mismo se aplica para las alteraciones de la contracción general de la fuerza durante la exposición de la cafeína. La amplitud de los cambios registrados en las proyecciones zona corporal es atenuada (Fig. 3c, d]. En el caso más destacado T. wilhelma llegado a un semi-estado contratados después de varias horas y se muestra sólo la debilidad de las contracciones (Fig. 3c]. El lapso de tiempo de grabación revela un comportamiento de la esponja de tejido similar al espasmo-como estado, pero el efecto es más débil y el ritmo endógeno sigue (véase la disposición 3: Movie_S3.mov).

Glycine

Al igual que la cafeína, la glicina y la contracción inducida por D alterado cc y la dotación de la contracción. La contracción inducida se caracteriza por una bi-phasic aparición (Fig. 4]. Time-lapse grabaciones revelan que en la primera fase, la esponja contratos sólo en la parte basal del cuerpo. En consecuencia, se reduce la esponja hacia el sustrato y el tejido de todo el cuerpo comienza a contrato bastante simultáneamente en las siguientes segunda fase (véase la disposición 4: Movie_S4.mov, el tiempo Índice 69 - 90 min).

La endógeno D cc se acortó significativamente durante la exposición glicina (Tab. 1], pero después de lavar las restauraciones de la sustancia. La amplitud de los cambios registrados en las proyecciones zona corporal puede ser atenuada (Fig. 4b]. La atenuación difiere de la observada para la cafeína, ya que el aspecto general de la contracción es muy similar a la no endógena contracciones inducidas, salvo que los cambios de volumen durante la contracción y expansión son más bajos (ver archivo adicional 4: Movie_S4.mov, el tiempo Índice 90 - 378 min).

Adrenaline y serotonine

Adrenaline no indujo contracción de la T. wilhelma. Sin embargo, el ritmo endógeno está fuertemente preocupada por la adrenalina, lo que ya irregular D cc durante la exposición (Fig. 5a, Tab. 1). El lapso de tiempo de grabación muestra que T. wilhelma sigue en fase de la ampliación durante un período más largo. N local contracciones en la superficie son observables. Alargamiento y retracción del cuerpo extensiones, así como la yema de formación no se ven afectados por la adrenalina (ver archivo adicional 5: Movie_S5.mov). Hemos encontrado que el efecto sobre cc D fue mayor a 44 μ M que en 22 μ M adrenalina (Fig. 5b].

Por el contrario, serotonine inmediatamente contracciones inducidas a concentraciones de 260 μ M y 520 μ M, pero no a 65 μ M (Fig. 5c, d]. Sin embargo, no se encontraron atenuación de la fuerza de contracción y no alteración significativa de la categoría D cc (Tab. 1].

El óxido nítrico

La liberación de NO-sustancia NOC-12 se encontró para inducir contracciones al instante después de la aplicación (Fig. 6]. Además, los fuertes efectos, tanto en D cc y la fuerza de contracción se registraron. El D cc está aumentada significativamente y parece ser más irregular (Tab. 1, Fig. 6b]. La fuerza de contracción se reduce, con un menor volumen en fase ampliada y un mayor volumen contratado en fase. Durante este semi-ampliado los períodos, T. wilhelma casi no muestra contracción actividad local (ver archivo adicional 6: Movie_S6.mov). Las contracciones, que se producen dentro del tiempo de exposición a NO, son similares a las contracciones inducidas endógeno, con la excepción de la amplitud atenuada: parecen ser activado a nivel local y repartidas en el cuerpo una esponja en una ola igual manera.

AMP cíclico

La aplicación de cAMP dado lugar a contracciones, ya sea con carácter inmediato inicio (Fig. 7a] o la demora en la aparición (Fig. 7b]. En ambos casos hay una tendencia a una alteración D cc (Tab. 1] y el patrón típico fue ligeramente perturbado, como se muestra en un caso de una segunda contracción inmediata después de la inicial, sin un típico descanso en la ampliación del estado (Fig. . 7b]. A pesar de que el ritmo es un poco perturbado, el aspecto general de las contracciones no se altera durante la aplicación de campamento. Al igual que en las contracciones endógeno, parece que se activará a nivel local en la parte basal de la esponja y extender desde allí hacia la parte apical (ver archivo adicional 6: Movie_S6.mov).

Observaciones generales y de control de los experimentos

En general, la mayoría de las esponjas respondieron a la de lavado de las sustancias, también. En algunos casos, relativamente fuertes contracciones producido (Fig. 5a, 6b, 7c], en otros, T. wilhelma respondió sólo ligeramente (Fig. 3d; 6 bis]. En todos los casos, la temperatura del agua y otros caracteres físicos de la sustitución artificial de agua de mar fueron lo más cerca posible de las condiciones en la cámara. En casi todos los casos, la esponja ampliado a un mayor volumen después de un lavado en comparación con el aumento de volumen durante el experimento (Fig. 3c, d, 7a, b] y en algunos casos incluso más altos que antes de que el experimento (Fig. 5 bis ; 6 bis, b]. El control de los experimentos muestran que la inyección de pequeños volúmenes de agua de mar solo en el sistema no da lugar a las contracciones. Esto también se refleja en esas sustancias, que no inducen contracción, al igual que la acetilcolina y la nicotina (Fig. 3] o adrenalina (Fig. 5a, b]. El valor del pH del agua de mar en el interior del reactor experimental es un poco alterado por algunas de las sustancias. Las diferencias del pH (Δ pH) superior a ± 0,15 se observaron sólo para el campamento (Δ pH = -1,16 ± 0,02; N = 3). Un cambio de pH similar, imitada mediante la aplicación de una cantidad correspondiente de HCl a T. wilhelma no dar lugar a contracciones (datos no presentados). Los cambios de temperatura dentro del rango de ± 0,5 ° C, que se produjeron durante los experimentos no han afectado a las esponjas en el control de experimentos. La concentración de oxígeno se mantuvo en un nivel de saturación en todos los experimentos, para excluir cualquier influencia.

Discusión
Efectos de las sustancias en neuroactive esponjas

Se aplicaron sustancias, que son bien conocidas por ser neuroactive en metazoos con el CNS, a nuestro nerveless modelo metazoon, la esponja Tethya wilhelma. La esponja respondido por las contracciones, así como alteración del ritmo y / o atenuar la contracción de amplitud a una serie de estas sustancias. Los resultados se resumen en la Tabla 2 y en comparación con informes anteriores en relación con la Porifera.

Acetilcolina (ACh) es uno de los mejores transmisores investigados y los relacionados con muscarínicos y receptores nicotínicos fueron los primeros para que la farmacología se dilucidado [32]. Los receptores nicotínicos están ligando-garse los canales iónicos, los muscarínicos metabotrophic son los tipos de sistemas. Ambos desempeñan papeles importantes en el SNC de todos los phyla, en la que han sido objeto de investigación [33, 34]. Específicas acetilcolina esterasa (AChE) la actividad se ha informado de las esponjas Sycon sp. [21], Hippospongia communis [35]. y también para T. wilhelma [26]. Por otra parte, no AChE actividad fue encontrada por los investigadores en la primera mitad del siglo 20, aunque varios esponja especímenes han sido investigados: Spongilla lacustris [23], Scypha sp. [24], Leuconia asperta y Syphonocalina crassa [25]. Por otra parte, según Pavans de Ceccatty [22], la aplicación de ACh aumenta el ritmo y la intensidad de la contracción de la H. communis. En contraste con este resultado y nuestra propia conclusión anterior la actividad de AChE en T. wilhelma, nuestros actuales investigaciones no revelan una correlación significativa entre la contracción y la ACh. ACh no induce la contracción. No obstante, la ligera, sino un efecto estadísticamente significativo de ACh en la contracción del ciclo de duración proporciona pruebas de que la ACh desempeña un papel en T. wilhelma, pero no participa directamente en la coordinación de la contracción. Sin embargo, pueden estar involucrados en la regulación del balance de extensión y retracción de formación [26], que tiene que ser demostrada. Nuestros resultados actuales muestran que la nicotina no afecta a la contracción y el ritmo de ninguna manera. Por lo tanto, podemos concluir que al menos ionotrophic ACh-receptores es muy probable que no participan en la regulación de la contracción de la T. wilhelma.

La cafeína no es un antagonista específico de los receptores de adenosina en el cerebro mamífero [36]. Además, como se dice por Fredholm y co-autores, es el "más ampliamente consumida comportamiento sustancia activa en el mundo" [36]. En este contexto, es extraño, que a nuestro entender, no consume café esponja científicos ha informado de ningún cafeína pruebas a las esponjas. Nuestras propias pruebas en T. wilhelma mostrar un fuerte efecto: que induce contracciones, aumenta el ritmo endógeno y atenúa la amplitud de las contracciones endógeno. Es interesante observar que en la mayoría de los experimentos, la aparición de cafeína inducida por la contracción es desacelerado. Excepto para el campamento (véase más adelante), no hemos observado esta pauta de cualquier otra contracción de la inducción de fondo. En consecuencia, llegamos a la conclusión de la aparición se desaceleró, que la cafeína no actúa directamente sobre las células contráctiles. Desde el perturbado ritmo endógeno y la contracción de amplitud, parece probable que la cafeína interfiere con la regulación de las contracciones endógeno. El espasmo-como reacción (Fig. 3b] y el cronotropa efecto, a saber. el significativamente más rápido, aunque algo irregular contracción ritmo, ponen de relieve esta hipótesis. Por consiguiente, un putativo del receptor de adenosina puede ser parte del mecanismo de activación endógena de las contracciones. En los mamíferos, los receptores de adenosina son ubicuos e importantes a lo largo de todo tipo de tejidos y tipos de células y que han demostrado causar efectos cronotropa en el corazón [de revisión en 37]. Además, los receptores de adenosina, que son todos metabotrophic, vincular la ATP impulsada por la energía del metabolismo, a las vías de señalización de las células. La adenosina vía de señalización interactúa fuertemente con otras sustancias mensajero [38]. Es muy probable que ese mecanismo central de señalización evolucionado rápida y desempeña un papel importante en los invertebrados, también [33].

Glycine induce efectos similares a la cafeína en T. wilhelma: estimula la contracción, fastens el ritmo de contracción, mientras que la amplitud atenuantes. Además de GABA y glutamato, por lo que hemos caracterizado los efectos sobre T. wilhelma en detalles en otro lugar [31], la glicina es uno de los aminoácidos importante transmisor en el cerebro de vertebrados [39]. Su función transmisor también se ha demostrado en los invertebrados, por ejemplo, Hydra vulgaris, donde actúa como un transmisor inhibidor, también [40]. En nuestros experimentos T. wilhelma mostraron una respuesta bifásica, con un carácter inicial de lanzamiento de la esponja hacia el sustrato, seguida por la contracción se desaceleró cuerpo. Esto indica que la glicina más probable es que actúa sobre las células que participan en la regulación de las contracciones endógeno, no a las células contráctiles directamente. Esto queda subrayado por la alteración del ritmo y la amplitud. Se ha demostrado que antes de aminoácidos juegan un papel en la señalización intercelular de esponjas:. Recientemente, hemos caracterizado la cinética de GABA y glutamato inducida por las contracciones en T. wilhelma [31]. En relación con el hallazgo de una GABA y glutamato-gen receptor como en Geodia cydonium [19] y la observación de un curso más lento en virtud de la exposición de GABA Cliona celata [5], se concluye que la vía de señalización GABAérgicas existe en las esponjas. Nuestros primeros indicios de una glycinergic sistema basado en los resultados del presente estudio han demostrado que por más molecular y bioquímica de las investigaciones.

Las catecolaminas adrenalina es otra sustancia, que ha sido probado previamente en esponjas: por Emson en Cliona celata, observando una ligera reducción en los actuales [5], y, por Lentz que específicamente teñidas de adrenalina que contiene bipolar y multipolar tipos de células en Sycon sp. utilizando métodos histoquímicos [21]. El resultado de nuestro presente estudio subraya que la adrenalina juega un papel importante en las esponjas. La estricta limitación de los efectos para el alargamiento del ciclo de contracción endógeno duración en T. wilhelma sugiere que la adrenalina es directamente involucrados o alt menos que interfiera con la regulación de la contracción del ritmo endógeno. En los mamíferos, la adrenalina está involucrada en el upregulation de los genes del reloj molecular y, por tanto, participan en el bucle de regulación de ritmo circadiano [41]. En este contexto, es interesante que Reiswig y níquel en las publicaciones independientes en los ritmos circadianos en dos especies diferentes Tethya [7, 11]. En conclusión, la adrenalina puede estar directamente implicados en la regulación circadiana en Tethya.

El efecto de las aminas biogénicas serotonine a esponjas también ha sido probado anteriormente. Se ha detectado dos veces utilizando imunohistochemical histoquímicas y métodos en Sycon sp. y Tedania ignis [21, 42]. Sin embargo, Emson no encontró efectos sobre la Cliona celata [5]. Por el contrario, hizo de inmediato serotonine inducir la contracción de la T. wilhelma en el presente estudio en concentraciones de 260 μ M y superior. El efecto es limitado, ya que el ritmo endógeno de las contracciones no se ve afectada. Sin embargo, la conclusión generalizada de serotonine en todos los phyla de los metazoa, actuando a través de ionotrophic y metabotrophic tipos de receptores, apunta a una rápida evolución de este sistema de señalización central [33, 34]. Esto también es apoyado por los datos moleculares [43].

El gas de óxido nítrico (NO) es una molécula central en la regulación de un elevado número de procesos fisiológicos en los vertebrados [44], pero NO también juega un papel importante en muchos phyla de invertebrados [45, 46]. Actúa a guanilato ciclasa soluble y se libera de óxido nítrico sintasa (NOS) durante la conversión de l-arginina a l-citruline. Esta reacción es regulada principalmente intracelular de Ca 2 +. NO difunde directamente de célula a célula y su área de distribución está limitada por su corta vida media [47]. NO se supone que es un mensajero de edad evolutiva, que actúa automáticamente y paracrinos [33]. Esto es apoyado por el hallazgo de EEUU en la esponja Axinella polypoides, donde participa en la cascada de señalización de temperatura [48]. En este sentido, puso de manifiesto que no induce a la contracción de la T. wilhelma, sino que también modula la contracción endógeno ritmo y amplitud. Debido a su rápida difusión, la corta vida media y la serie limitada, NO es un óptimo candidato a una contracción de la inducción de mensajero, que actúa automáticamente y paracrinos y mi también participarán en un circuito de retroalimentación para activar las células putativo, que participan en la la fecha de celebración del ritmo endógeno.

AMP cíclico también las contracciones inducidas por T. wilhelma en el presente estudio. Es de interés que no utilizó una membrana permeable forma de campamento. En consecuencia, el efecto observado tiene que ser considerado como un evento de señalización extracelular, que es más probable modulada por una cAMP receptor específico, similar al Dictyostelium discoideum [49]. Se ha demostrado que antes de cAMP extracelular juega un roll regulativas en Porifera: se interviene en la regulación de la producción y el desarrollo de gemmules en esponjas de agua dulce [50], y que afecta directamente a la locomoción de disociar las células de cerebro Clathrina [51]. Por lo tanto, puede vincular la movilidad celular y el cuerpo locomoción con la contracción de esponjas. Los tres fenómenos son aspectos importantes en la vida de Tethya [7, 9, 10, 26, 52].

Ligando a base de la coordinación en vías de esponjas

La cuestión de si las esponjas poseen un nervioso (-like) del sistema o no, se ha debatido en detalle y, en general, una respuesta negativa [4], para obtener una visión general véase [7, 8, 14, 15]. Incluso los informes de potenciales de acción en el Hexactinellida no altera esta conclusión, ya que un tejido sincicial está involucrada en esto, [16 - 18]. La discusión más detallada se da por Jones [8], que también examinó los mecanismos de coordinación alternativo, basado en la propagación de señales mecánicas, que prefiere a los productos químicos basados en los mecanismos de mensajería. Sin embargo, nuestro presente informes específicos de la inducción del cuerpo y la contracción de la modulación endógena contracción ritmo y la amplitud de distintos mensajeros químicos o receptores agonistas y antagonistas en nuestro modelo de sistema T. wilhelma, sugiere claramente la hipótesis de mensajeros químicos. Esta hipótesis está apoyada por recientes o detallada caracterización cinética de la respuesta contráctil de T. wilhelma a GABA y glutamato [31], así como los informes anteriores sobre los efectos de mensajeros, agonistas y antagonistas a las esponjas (véase Tab. 1 y el texto más arriba). Además la caracterización molecular de un putativo metabotrophic GABA y glutamato-like receptor, muestra claramente la presencia de mensajería basada en sistemas de señalización en las esponjas [19]. En consecuencia, apoyamos la idea de un amplio mensajero químico del sistema de señalización basado en esponjas [8, 53]. A partir de nuestros resultados, la cuestión plantea, ¿por qué tantos mensajero sustancias son eficaces en un sistema biológico, que obviamente tiene muy pocos opciones de comportamiento? La respuesta es sencilla. Para un filtrado, sésiles organismo como una esponja la adecuada respuesta a muchos estímulos del medio ambiente o los estados es detener la filtración y, finalmente, renovar el contenido de agua interna de la aquiferous sistema rápidamente. Nuestro modelo de sistema Tethya wilhelma más probable es que el organismo altera el volumen de contracción de la pinacoderm del complejo aquiferous sistema, a fin de intercambiar el agua [7, 54]. Parece ser favorable para la esponja para el intercambio de agua con regularidad, lo que se refleja en la contracción del ritmo endógeno. Por lo tanto, llegamos a la conclusión a la presencia de al menos una vía de señalización en relación con la regulación un ritmo endógeno. Teniendo en cuenta que el marcapasos del ritmo endógeno es muy probable que no las células contráctiles, Tethya requiere por lo menos dos vías de señalización a fin de coordinar el marcapasos a través de un auto y paracrinos y señal para activar la contracción del pinacocytes paracrinos por un mensajero ( Fig. 8].

Por otra parte se ha demostrado que las esponjas reaccionar a estímulos mecánicos [5 - 7] o los cambios de corrientes de agua externa, por ejemplo, durante los eventos de lavado en el presente estudio (véase más arriba). Nuestros estudios previos sobre GABA también puso de manifiesto que la atenuación y la desensibilización mecanismos son parte de los sistemas de regulación. Por consiguiente, si la contracción sería coordinada por un único sistema de señalización, la esponja no sería capaz de responder a nuevos estímulos durante los períodos de atenuación. Por lo tanto llegamos a la conclusión de que varios paracrinos ligando-receptor sistema de vías de señalización están involucrados en la coordinación de las señales externas a las células efectoras contráctil (Fig. 8]. Paracrinos si estas señales de propagación a través de la mesohyle o si uno o más son, además, ni siquiera distribuyen exclusivamente a través del sistema de aquiferous habrá que determinar en futuras investigaciones.

Conclusión

Nuestro estudio demuestra que una serie de mensajeros químicos, agonistas y antagonistas de inducir la contracción y / o modular la contracción del ritmo endógeno y la amplitud de nuestra nerveless modelo metazoon, la esponja Tethya wilhelma. A partir de nuestros resultados en combinación con las anteriores investigaciones sobre la señalización y la coordinación en las esponjas, llegamos a la conclusión de que un relativamente complejo sistema de mensajeros químicos regula el comportamiento de contracción a través de auto-paracrinos y señalización, a los receptores específicos de los sistemas. Como consecuencia de las condiciones de vida de filtrado de organismos sésiles, que parece más probable que diferentes vías de señalización están involucrados en la coordinación de la contracción, ya que este comportamiento es solo la respuesta adecuada a una serie de estímulos externos. Por otra parte, el actual potencial de cribado en los sistemas de mensajería muestra una vez más el valor de T. wilhelma como un sistema modelo para entender la evolución temprana de los sistemas de señalización durante la evolución de multicellularity en la basal metazoa. Básicamente esperamos encontrar el mismo mensajero del receptor de los sistemas, que forman parte del sistema nervioso y paracrinos sistemas de regulación de otros metazoan phyla. Desde el presente y un estudio anterior, se concluye que un adrenérgicos, adenosynergic y glycinergic vías, así como las vías sobre la base de NO cAMP extracelular y son candidatos para la regulación y el momento de la contracción del ritmo endógeno dentro de las células marcapasos, mientras que GABA, glutamato y serotonine son candidatos para la coordinación directa de las células contráctiles. Sin embargo, más probable es que estos sistemas actúan en una escala distinta y en variados contextos, en comparación con el bien investigado los sistemas en los animales con el SNC. Esto tendrá que ser por más unravelled moleculares y fisiológicos caracterizaciones de los sistemas de señalización en T. wilhelma esponja y otros sistemas de modelos, por ejemplo, las esponjas de agua dulce.

Métodos
Esponjas

Los especímenes de la esponja Tethya wilhelma Sarà et al. 2001 (Tethyidae, Hadromerida, Demospongiae) se obtuvieron del tipo de ubicación en el acuario del zoológico-jardín botánico "Wilhelma" de Stuttgart [27]. Para los experimentos se mantuvieron las esponjas en un 180 l acuario, corriendo a 26 ° C, utilizando agua de mar artificial [55], a una luz-oscuridad ciclo de 12/12 horas. Esponjas fueron alimentados con cuatro a cinco veces a la semana utilizando suspendido de invertebrados comerciales de alimentos (plancton artificial, Aquakultur Genzel, Fellbach, Alemania, www.aquakultur-genzel.de), de pipeteado varios ml de suspensión para cada esponja. El agua de mar se intercambió a un ritmo de aproximadamente el 10% del volumen total del acuario cada tres a cuatro semanas.

Reactor experimental

Todas las manipulaciones experimentales se llevaron a cabo en 250 ml cerrado reactor experimental. Consistía en una cámara de gaseosas experimental, diseñado en los principios de los reactores de transporte aéreo, conectado a una unidad de regulación de la temperatura (F25, Julabo, Seelbach, Alemania). Nivel de oxígeno y la temperatura se controlará mediante un multi-sistema de sensores (P4, WTW, Weilheim, Alemania), controlada por una computadora-software (3,0 Multilab piloto, WTW). Un built-in de filtros de cristal óptico (Ø 49 mm, DK Enterprises, India) permitió la imagen adecuada.

Digital time-lapse de imágenes y análisis de imágenes

Las imágenes digitales de la esponja especímenes fueron llevados a una resolución de 2048 × 1536 píxeles a intervalos regulares de 180 s (pre-y post-experimental de vigilancia) y 30 s (control de la contracción inducida), lo que resulta en una imagen de la acumulación de datos de tipo 60 megabytes por hora y 360 megabytes por hora, respectivamente (sin compresión de 8 bits de datos en imágenes). Una Nikon Coolpix 990E cámara digital manual en macro enfoque y la exposición fue el modo utilizado para la obtención de imágenes en escala de grises. La cámara se conecta a un Nikon SB 24 unidad de flash, sistema de modo manual (24 mm, salida de 1 / 16). La cámara estaba controlado por un ordenador, usando cable de conexión USB y el software DC_RemoteShutter V 2.3.0 en relación con el DC_TimeTrigger V. 1,0 [56]. Las imágenes fueron descargados, guardados en el PC y se borrarán en la CF-tarjeta de la cámara inmediatamente después de haber sido adoptadas. Una imagen de referencia incluida una barra de escala situarse al lado de la esponja se tomó para cada serie experimental, para permitir la ampliación. En todos los casos un fondo negro se utiliza para maximizar el contraste.

Análisis de imágenes se realizó a través ImageJ 1,30 a 1,34 (NIH, Washington, EE.UU.), con sede en construida en funciones [57]. La medición de áreas proyectadas en las bases contraste diferencia entre esponja (blanquecina) y fondo (negro). Todas las imágenes fueron ampliadas mediante la imagen de referencia. Un valor umbral entre el 50 y el 90 se aplicó a los 8 bits de imágenes y, en términos absolutos la proyección del área de la esponja se midió usando ImageJ incorporada en herramienta de medición. Cada vez-lapse serie fue cargado como una pila de imagen en ImageJ. Time-lapse películas se prepararon sobre la base de construido en funciones de ImageJ. Una macro se programó para medir semi-automática. Resultados de las mediciones fueron escritos en un archivo de texto y más calculado utilizando Excel 2000. Se realizó Mann-Whitney U-las pruebas sobre la contracción duración del ciclo (D cc) endógeno de los períodos de contracción y de fondo expuestas por períodos única esponja las personas que utilizan el Excel add-on WinSTAT [58]. D cc se midió el tiempo entre dos contracciones, que se define por su volumen corporal mínimos [7].

Sustancia de ensayo aplicación

Stock soluciones diluidas de sustancias de prueba se inyecta en el reactor experimental para llegar a final de las concentraciones entre 5,7 μ M y 1,3 mM dependiendo de la sustancia. Para nuestras pruebas, las sustancias siguientes, se aplicaron: la acetilcolina (cloruro de acytlcholine, Sigma-Aldrich A6625), adrenalina ([±]-epinefrina, Sigma-Aldrich E1635); Camp (cíclico adensosine-3'-5'-monophosphoric sal de ácido monosódico , Boehringer 102296); cafeína (Sigma Aldrich C5-3); glicina (Merck 104201); nicotina ([S] - [-] de la nicotina, Sigma-Aldrich 18637-6); NOC-12 (3-etil-3 - [ethylaminoethyl]-1-hidroxi-2-oxo-1-triazene, Sigma-Aldrich E3145); serotonina (sulfato de serotonina creatinina complejo, Sigma-Aldrich H7752).

Cuidado no se ha tomado para inyectar las soluciones directamente a la esponja espécimen, pero permiten la mezcla en la corriente circulante del sistema. Para cada experimento, las sustancias se aplica sólo durante una fase de expansión-a entre dos contracciones rítmicas endógeno, pero el tiempo relativo en el ciclo de contracción varía entre el experimento, para la imagen de procesamiento de datos razones. Las esponjas a largo plazo la reacción ha sido registrada. Tras el experimento del reactor fue perfundido de fresco, aireado artificial de agua de mar a 26 ° C. La misma especímenes fueron usados para otro experimento después de mantener un ritmo normal de contracción durante al menos varias horas.

Control de experimentos y mediciones de control

Antes de la prueba, cada muestra utilizada se permitió a aclimatarse al reactor experimental durante varias horas. Los experimentos se inició sólo después de la esponja especímenes muestran contracción típicos patrones regulares, tal como se describe anteriormente [7]. Durante todos los experimentos, la temperatura y el nivel de oxígeno fueron controlados y registrados. Los cambios en el pH debido a la aplicación de sustancias que se midieron. Control de los experimentos se llevaron a cabo para poner a prueba la esponja a la reacción de los cambios de pH.

Conflicto de intereses

El autor (s) declaran que no tienen ningún interés en competencia.

Autores de las contribuciones

KE diseñado y realizado los experimentos, analizar los datos, cifra preparado borradores y el manuscrito revisado. MN diseñó el estudio y los principales experimentos, realizó el análisis de datos, preparado cifras definitivas, redactó, escribió y revisó el manuscrito.

Material complementario
1 de ficheros adicionales
Time-lapse de película
Tethya wilhelma reaccionar a la nicotina aplicación extracorporal
La película QuickTime Movie_S1.mov representa el time-lapse imagen de la serie periodo de tiempo mostrado como un patrón de contracción gráfico en la Fig.
2b
En tiempo de extracorpórea aplicación de la sustancia ha sido acusada formalmente en la película, así como el tiempo transcurrido. Time-lapse 2300 veces. Para más detalles referirse a los resultados de la sección del manuscrito.
2 ficheros adicionales
Time-lapse de película
Tethya wilhelma
reaccionar a extracorporal aplicación cafeína (como el espasmo de contracción comportamiento)
La película QuickTime Movie_S2.mov representa el time-lapse imagen de la serie periodo de tiempo mostrado como un patrón de contracción gráfico en la Fig.
3b
En tiempo de extracorpórea aplicación de la sustancia ha sido acusada formalmente en la película, así como el tiempo transcurrido. Time-lapse 2300 veces. Para más detalles referirse a los resultados de la sección del manuscrito.
3 ficheros adicionales
Time-lapse de película
Tethya wilhelma
reaccionar a la cafeína aplicación extracorporal (atenuados amplitud, contracciones local)
La película QuickTime Movie_S3.mov representa el time-lapse imagen de la serie periodo de tiempo mostrado como un patrón de contracción gráfico en la Fig.
3c
En tiempo de extracorpórea aplicación de la sustancia ha sido acusada formalmente en la película, así como el tiempo transcurrido. Los cambios en perspectiva son el resultado de leves cambios involuntarios de la cámara durante el experimento. Time-lapse 2300 veces. Para más detalles referirse a los resultados de la sección del manuscrito.
4 de ficheros adicionales
Time-lapse de película
Tethya wilhelma
reaccionar a extracorporal glycin aplicación
La película QuickTime Movie_S4.mov representa el time-lapse imagen de la serie periodo de tiempo mostrado como un patrón de contracción gráfico en la Fig.
4b
En tiempo de extracorpórea aplicación de la sustancia ha sido acusada formalmente en la película, así como el tiempo transcurrido. Time-lapse 2300 veces. Para más detalles referirse a los resultados de la sección del manuscrito.
5 de ficheros adicionales
Time-lapse de película
Tethya wilhelma
reaccionar a extracorporal adrenalina aplicación
La película QuickTime Movie_S5.mov representa el time-lapse imagen de la serie periodo de tiempo mostrado como un patrón de contracción gráfico en la Fig.
5a
En tiempo de extracorpórea aplicación de la sustancia ha sido acusada formalmente en la película, así como el tiempo transcurrido. Los cambios en perspectiva son el resultado de leves cambios involuntarios de la cámara durante el experimento. Time-lapse 2300 veces. Para más detalles referirse a los resultados de la sección del manuscrito.
6 ficheros adicionales
Time-lapse de película
Tethya wilhelma
reaccionar a extracorporal aplicación de óxido nítrico (a través de NOC-12)
La película QuickTime Movie_S6.mov representa el time-lapse imagen de la serie periodo de tiempo mostrado como un patrón de contracción gráfico en la Fig.
6b
En tiempo de extracorpórea aplicación de la sustancia ha sido acusada formalmente en la película, así como el tiempo transcurrido. Los cambios en perspectiva son el resultado de leves cambios involuntarios de la cámara durante el experimento. Time-lapse 2300 veces. Para más detalles referirse a los resultados de la sección del manuscrito.
7 ficheros adicionales
Time-lapse de película
Tethya wilhelma
reaccionar a extracorporal AMP cíclico aplicación
La película QuickTime Movie_S7.mov representa el time-lapse imagen de la serie periodo de tiempo mostrado como un patrón de contracción gráfico en la Fig.
7b
En tiempo de extracorpórea aplicación de la sustancia ha sido acusada formalmente en la película, así como el tiempo transcurrido. Los cambios en perspectiva son el resultado de leves cambios involuntarios de la cámara durante el experimento. Time-lapse 2300 veces. Para más detalles referirse a los resultados de la sección del manuscrito.
8 de ficheros adicionales
Hipotéticas vías de señalización en Tethya wilhelma
que participan en la coordinación de las contracciones a estímulos externos y endógenos señales
La película QuickTime Movie_S7.mov representa un paso a paso la presentación de hipotético modelo de coordinación indicadas en la figura
8
Un estímulo externo (1) en células del receptor putativo (gris) en el pinacoderm desencadena la liberación de una señal de sustancias (2), que difunde a través de la mesohyle (azul claro) de la esponja y desencadena la contracción (C!) Contráctil de pinacocytes ( azul) a través de un receptor específico y una vía de señalización intracelular. Finalmente, estimulado pinacocytes liberación una segunda señal de fondo (3), que pueden seguir a través de la difusa mesohyle o serán distribuidos por las corrientes en el canal del sistema. Esta señal secundaria ampliar la velocidad de reacción al interior y exterior de activación de la contracción. La contracción del ritmo endógeno puede ser controlada por numerosas células de activación (rojo) distribuidos en los mesohyle. Estas células se supone poner en libertad a una señal auto-/paracrine sustancia (4), que difunde a través de la mesohyle para coordinar la liberación de una señal de sustancia (5), que difunde a la pinacocytes y desencadena la contracción y, finalmente, se traduce en una señal de amplificación como se muestra en el paso (3). Señal de sustancias (2) y (5) son probablemente no idénticas para permitir una coordinación específica independiente de contracción a endo-y estímulos exógenos.
Agradecimientos

Esta publicación está dedicada a Roberto Pronzato (Genova, Italia), un gran mentor en la ciencia esponja, una generosa acogida y de una especie, de mente abierta esponja compañeros. Queremos dar las gracias a Hans-Dieter Görtz y Franz Brümmer para apoyar nuestras actividades de investigación, Isabel Koch y Kai-Uwe Genzel de proporcionar y mantener las esponjas en la localidad tipo de zoológico-jardín botánico Wilhelma, el níquel y el Birgit Markus Götz para el debate de la resultados, Isabel Heim y Carsten Wolf para la asistencia técnica con el acuario. El trabajo fue parcialmente apoyado por el Ministerio Federal Alemán de Educación e Investigación (BMBF) a través del proyecto Centro de Excelencia BIOTECmarin (F 0345D), por el Ministerio de Ciencia, Investigación y Artes del Estado de Baden-Württemberg y la Universidad de Stuttgart.