BMC Cancer, 2006; 6: 142-142 (más artículos en esta revista)

La relación entre Desoxicitidina actividad quinasa y la radiosensitising efecto de la gemcitabina en ocho diferentes humanos líneas celulares tumorales

BioMed Central
Bea Pauwels (bea.pauwels @ ua.ac.be) [1], Annelies CE Korst (Vinke@zeelandnet.nl) [1], Greet GO Pattyn (greet.pattyn @ ua.ac.be) [1], Hilde AJ Lambrechts (hilde.lambrechts @ ua.ac.be) [1], Juliette AE Kamphuis (jae.kamphuis @ vumc.nl) [2], Christel MJ De Pooter (christel_de_pooter@gvagroup.com) [3], Godefridus J Peters (GJ.Peters @ vumc.nl) [2], Filip Lardon (filip.lardon @ ua.ac.be) [1], Jan Vermorken B (jan.b.vermorken @ uza.be) [1]
[1] Laboratorio de Investigaciones sobre el Cáncer y Oncología Clínica del Departamento de Oncología Médica, Universidad de Amberes (UA / UZA), Wilrijk, Bélgica
[2] Departamento de Oncología Médica, VU University Medical Center, Amsterdam, Los Países Bajos
[3] Departamento de Radioterapia, Hospital St Augustinus, Wilrijk, Bélgica

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Resumen
Fondo

Gemcitabina (dFdC) es un activo agente antitumoral con radiosensitising propiedades, que se muestra tanto en los estudios preclínicos y clínicos. En el presente estudio, la relación entre Desoxicitidina quinasa (dCK) y la actividad radiosensitising efecto de la gemcitabina fue investigado en ocho diferentes humanos líneas celulares tumorales.

Métodos

Las células tumorales fueron tratados con dFdC (0-100 nM) durante 24 h antes de la radioterapia (RT) (γ-Co 60, 0-6 Gy, temperatura ambiente). La supervivencia celular se determinó 7, 8, ó 9 días después de la RT B sulforhodamine prueba. dCK actividad de las células se determinó mediante un ensayo de actividad enzimática.

Resultados

Un claro dependiente de la concentración radiosensitising efecto de dFdC se observó en todas las líneas celulares. El grado de radiosensitisation también línea celular dependiente y parece estar en correlación con la sensibilidad de la línea celular para el efecto citotóxico de dFdC. La actividad dCK de líneas celulares de nuestro variado considerablemente y difieren hasta tres veces de 5 a 15 pmol / h / mg de proteína entre las líneas celulares a prueba. En esta gama dCK actividad fue sólo débilmente relacionadas con radiosensitisation (coeficiente de correlación 0,62, p = 0,11).

Conclusión

Gemcitabina hay que metaboliza al principio activo de nucleótidos con el fin de radiosensitise las células. Desde dFdCTP acumulación y la incorporación en el ADN son dependiente de la concentración, el grado de radiosensitisation parece estar relacionada con el grado de dFdCTP incorporado en el ADN necesario para inhibir la reparación del ADN. La actividad de dCK no parece ser el factor más importante, pero es claramente un factor importante. Otros socios del metabolismo intracelular de gemcitabina en relación con los efectos del ciclo celular y reparación del ADN podría ser más responsable de la radiosensitising efecto que dCK actividad.

Fondo

Gemcitabina (2 ', 2'-difluorodeoxycytidine, dFdC) es un nucleósido sintético análogo pirimidina que tiene una estructura muy similar a la de Desoxicitidina y cytosine arabinoside (Ara-C) [1]. En el uso clínico, gemcitabina es activo frente a una variedad de tumores sólidos como el cáncer de páncreas, pulmón, cabeza y cuello, vejiga, mama y ovario. Es activado intracelularmente por Desoxicitidina quinasa (dCK), que añade un grupo fosfato a los 5 'posición de la desoxirribosa. El difosfato (dFdCDP) y trifosfato (dFdCTP) las formas de las drogas desempeñan un papel importante en el efecto citotóxico: dFdCDP es un inhibidor de la reductasa ribonucleotide, mientras que dFdCTP se incorpora en el ADN, tanto para la inhibición de la síntesis de ADN. Al mismo tiempo, gemcitabina tiene varios auto-potenciación de mecanismos que sirvan para aumentar los niveles intracelulares del metabolito activo y aumentar la citotoxicidad [1, 2]

Además de su efecto citotóxico, gemcitabina es un potente radiosensitiser cuando se utilizan en roedores y humanos de las células tumorales, incluyendo los tumores pancreáticos, células no pequeñas de cáncer de pulmón, cáncer de cabeza y cuello, colon, mama, de ovario y el cáncer de vejiga [3 - 14] . Gemcitabina puede conducir a una radiosensitising efecto en ambos monocapa y esferoide glioblastoma culturas [15]. Recientes estudios in vivo han confirmado estas observaciones y han puesto de manifiesto el crecimiento del tumor importante retraso con la combinación de gemcitabina y las radiaciones ionizantes en modelos animales [4, 5, 16]. Estos resultados han impulsado una serie de ensayos clínicos utilizando gemcitabina como radiosensitiser [17 - 31]. El mecanismo exacto de radiosensitisation y factores más importantes que aún no se conoce aún. Aunque los efectos de gemcitabina en la redistribución del ciclo celular y deoxynucleotide trifosfato (dNTP) piscinas puede contribuir a, o incluso ser necesario para, mediada por gemcitabina radiosensitisation [7, 10, 13], no en última instancia, determinar si procede o no gemcitabina tratamiento va dar lugar a una mayor radiosensibilidad. Por ejemplo, el papel de dATP agotamiento no podía ser confirmado en un estudio utilizando células con diferentes reparación de defectos [32]. Wachters et al [33] han demostrado que gemcitabina puede sensibilizar las células a la radiación específica de interferencia con la reparación homóloga (HR) itinerario. Otros han sugerido que gemcitabina en combinación con la radioterapia se ve comprometida por falta de adecuación de reparación (MMR), porque la recuperación de gemcitabina es el tratamiento facilitado por, aunque no depende de MMR dominio [34, 35]

Como Un promedicamento, gemcitabina requiere la fosforilación intracelular a su forma activa trifosfato de dCK y, en menor medida por la timidina kinasa (TK2) [36] para exponer la actividad biológica. Adquirido resistencia a la gemcitabina ha sido asociado con deficiencia de dCK [37 - 40] Se ha demostrado que la expresión de mRNA en dCK, proteínas y nivel de actividad en las líneas celulares de cáncer de diferente origen están estrechamente relacionados, así como la relación entre la sensibilidad a la gemcitabina y la actividad de dCK se observó [41]. También se ha demostrado que la sensibilidad a los análogos de nucleósidos pueden ser restaurados por transfección de un tipo silvestre dCK cDNA [42 - 44]. El papel crítico de dCK en la gemcitabina radiosensitisation no se conoce. Anteriormente una relación significativa entre la actividad dCK y la sensibilidad de diversos xenoinjertos de gemcitabina se ha descrito [41], mientras que la acumulación de trifosfato, dFdCTP, estaba relacionado con la sensibilidad a la gemcitabina también [45]. A comienzos de datos con un resistente gemcitabina línea celular, es decir, que carecen de dCK, puso de manifiesto que estas células requiere una alta concentración (50-100 μ M), de gemcitabina con el fin de obtener radiosensitisation [46]. Sin embargo, debido a radiosensitisation in vitro aumenta con la concentración de drogas [12, 47])., Puede ser que el efecto de radiosensitising gemcitabina también depende de la tasa de fosforilación de drogas que a su vez depende de la actividad dCK [8] y de concentración del fármaco [ 12, 13, 37, 45, 48]]. Por lo tanto, se tiene la hipótesis de que dCK actividad podría ser un factor importante para la radiosensitising efecto de la gemcitabina.

El propósito del presente estudio fue el de fundamentar aún más el papel de dCK en la gemcitabina radiosensitisation. La mayoría de los estudios de investigación radiosensitising el efecto de la gemcitabina son limitados a tipos de células y sólo unas pocas concentraciones de gemcitabina se utilizan. En este estudio, el efecto de radiosensitising gemcitabina se investigó humanos en ocho líneas celulares tumorales, procedentes de diferentes tejidos, utilizando una serie de concentraciones gemcitabina. Dentro de ese contexto, el papel de dCK era seguir estudiando.

Métodos
Y productos químicos reactivos

Dulbecco's modificó Eagle's Medium (DMEM), RPMI, Media 199, suero de ternera fetal y el medio suplementos L-glutamina y piruvato de sodio fueron todos adquiridos de Invitrogen (Merelbeke, Bélgica). Sulforhodamine B se obtuvo de CIE (Asse, Bélgica). Gemcitabina fue adquirido de Eli Lilly (Indianápolis, EE.UU.).

Líneas celulares

Las líneas celulares utilizadas en este estudio fueron células tumorales humanas que difieren en estado de p53 procedentes de diferentes tejidos: ECV304 (tm-p53) un ser humano epidermoide línea de cáncer vesical, H292 (wt-p53) un ser humano mucoepidermoide el cáncer de pulmón de células línea, A549 ( wt-p53) un ser humano escamosa cáncer de pulmón de células línea, MCF-7 (wt-p53) un carcinoma de células mamarias línea, HT-29 (MT-p53) un adenocarcinoma de colon línea celular Panc-1 (tm-p53) un ser humano pancreática epitheloid línea celular, CAL-27 (MT-p53) un ser humano carcinoma de células escamosas línea celular de la lengua y FaDu (tm-p53) un ser humano carcinoma de células escamosas línea celular de la faringe. H292 y A549 fueron cultivadas en RPMI-1640 mediano, suplementada con glutamina, piruvato de sodio y 10% de suero de ternera fetal. ECV304 se cultivaron en Media-199 suplementado con 10% de suero de ternera fetal. MCF-7, HT-29, CAL-27 y FaDu se cultivaron en medio DMEM, suplementado con glutamina y el 10% de suero de ternera fetal. Las culturas se mantuvieron en crecimiento exponencial en un ambiente humidificado a 37 ° C por debajo del 5% de CO 2 / 95% aire.

Célula de supervivencia después del tratamiento con gemcitabina y radioterapia

El sulforhodamine B (SRB) es un test adecuado sistema de pruebas in vitro para pruebas radiosensibilidad, en la que actualmente utilizan las líneas celulares ha demostrado ser comparable en el resultado con el clonogenic ensayo, cuando las células están autorizados a ser objeto de al menos 6 veces después de doblar la radiación tratamiento [49]. Por lo tanto, en nuestros experimentos, ECV304, H292, A549, MCF-7, HT-29 y FaDu células fueron incubadas durante 7 días, CAL-27 celdas para 8 días y Panc-1 células de 9 días después del tratamiento de radiación, antes de la determinación de la supervivencia de la SRB de ensayo. Densidad óptima de siembra se determinará para cada línea celular para asegurar un crecimiento exponencial durante el ensayo.

Las células fueron cosechadas de la fase exponencial de las culturas trypsinisation, contados y chapada en 48 pozos de placas. A raíz de placas y las 24 h período de recuperación, las células fueron tratados con gemcitabina (0-100 nM) disuelta en tampón fosfato salino (PBS) durante 24 h seguida inmediatamente por la radiación. PBS se añadió a las células control. Cada concentración se puso a prueba seis veces en el mismo experimento. Después de la irradiación a temperatura ambiente durante un rango de dosis de 0-6 Gy, utilizando una fuente de 60 Co (Alcyon, St Augustinus hospital, Amberes), las células fueron lavadas con medio libre de drogas. Después de 7, 8 o 9 días, la supervivencia fue determinado por la SRB ensayo. Para la determinación de la supervivencia celular tras el tratamiento con gemcitabina sola, la SRB ensayo se realizó 4 días después del inicio del tratamiento.

El único ensayo se realizó de acuerdo al método de Skehan y Papazisis y colegas y compañeros de trabajo, con modificaciones menores [50, 51] Cultura medio fue aspirado antes de la fijación de las células mediante la adición de 200 μ l 10% de ácido tricloroacético frío. Después de 1 h de incubación a 4 ° C, las células fueron lavadas 5 veces con agua desionizada. Luego, las células fueron teñidas con 200 μ l 0,1% SRB disuelto en el 1% de ácido acético por lo menos 15 minutos y posteriormente lavadas 4 veces con 1% de ácido acético para eliminar las manchas no encuadernado. Las placas se dejaron secar a temperatura ambiente y proteína ligada mancha fue solubilizado con 200 μ l de 10 mM TRIS unbuffered base (tris (hidroximetil) aminomethane) y se transferirán a placas de 96 pocillos para leer la densidad óptica a 540 nm (BioRad 550 microplaca lector, Nazareth, Bélgica).

dCK ensayos de actividad enzimática

Para determinar una posible correlación entre la actividad dCK y radiosensitising el efecto de la gemcitabina, las células fueron cosechadas como hemos descrito anteriormente [41], y "pellets" fueron almacenadas a -80 ° C hasta su análisis. 25,10 6 celdas fueron utilizadas con el fin de poder medir la actividad enzimática en una serie lineal de tiempo y de proteínas. dCK se determinó esencialmente como hemos descrito anteriormente [41]. Para medir dCK selectiva y mediada por bypass TK2 fosforilación de Desoxicitidina, hemos utilizado radiomarcada chlorodeoxyadenosine ([3 H] CDA) como el sustrato [52], que no está activado por TK2. Actividades enzimáticas se expresaron como nmol producto por h por mg de proteína (nmol / h / mg de proteína).

Métodos estadísticos

Los supervivientes fueron calculadas por: La media de densidad óptica (DO) de células tratadas / media densidad óptica del control de las células × 100%. La radiación curvas de supervivencia fueron equipados de acuerdo con el lineal-cuadrática modelo: sobrevivir fracción = exp (- α D - D β 2), utilizando Winnonlin (Pharsight, EE.UU.).

Los siguientes parámetros fueron calculados: ID50, la dosis de radiación que produce el 50% de inhibición de crecimiento y CI50, la concentración gemcitabina produce el 50% de inhibición del crecimiento. El efecto radiosensitising estuvo representado por la dosis de factor de mejora (DEF): ID50 (-dFdC) / ID50 (+ dFdC).

Salvo indicación en contrario, todos los datos se presentan como la media ± desviación estándar. Todos los experimentos se realizaron al menos tres veces. Una muestra de dos t-test y ANOVA de un factor de análisis se utilizó para determinar significativa la diferencia entre los valores ID50 y DEFs.

Radiosensitisation puede definirse como una interacción sinérgica entre gemcitabina y radioterapia. Para la determinación de las sinergias, la combinación de índice (IC) se calculó por el Chou-Talalay ecuación [47, 53, 54], utilizando CalcuSyn (Biosoft, EE.UU., Reino Unido). La ecuación general para el clásico isobologram viene dada por:

donde (D x) 1 y (D x) 2 en los denominadores son las dosis (o concentraciones) de D 1 (gemcitabina) y D 2 (radiación) por sí sola que dar x% de inhibición, mientras que (D) 1 y (D) 2 en los nominadores son las dosis de radiación y gemcitabina en combinación que también inhiben el x% (es decir, isoeffect).

El (D x) 1 o (D x) 2 (gemcitabina y de radiación) puede ser fácilmente calculada a partir de la mediana-efecto ecuación de Chou:

Donde f es una fracción de los afectados y D m es la mediana de dosis-efecto (ID50 o IC50) que se obtiene a partir de la lucha contra el registro de los X-intersección de la mediana efecto parcela, X-log (D) versus Y = log [f a (1 - f] o D m = 10 - (Y-interceptar) / m, y m es la pendiente de la mediana efecto parcela.

Para los conservadores no exclusivo mutuamente isobolograms de dos agentes, un tercer mandato,

Se añade. El tercer término es generalmente omitido, cuando el excluyen mutuamente (α = 0) o hipótesis clásica isobologram se utiliza [53, 55] Los datos en el cuadro 2 se basan en el supuesto de que α = 0.

Un CI valor entre 0,9 y 1,1 indica sólo aditividad. Moderado sinergismo es representado por IC valores entre 0,7 y 0,9, IC sinergismo de los valores por debajo de 0,7.

Resultados
Radiosensitisation de gemcitabina

Un claro dependiente de la concentración radiosensitising efecto de la gemcitabina se observó en ECV304, FaDu, H292, A549, CAL-27, Panc-1, MCF-7 y HT-29 células (Figura 1 y 2]. ID50 valores y DEFs para las diferentes concentraciones de gemcitabina se resumen en la Tabla 1.

El grado de radiosensitisation parece ser dependiente de línea celular. Por ECV304 y MCF-7 células, la DEF después del tratamiento con 1 nM gemcitabina fue 1,37 y 1,24, respectivamente, mientras que esta concentración no tiene efecto radiosensitising en FaDu, H292, A549, CAL-27 y HT-29 celdas con valores en torno a DEF 1. En Panc-1 células, mucho más alta concentración (15-100 nM) de gemcitabina se requieren para obtener un efecto radiosensitising que en las otras líneas celulares (2-8 nM). Panc-1 células fueron menos sensibles para el efecto citotóxico de gemcitabina como se ilustra por sí solo de la IC50 valores en la Tabla 1. El radiosensitising efecto parece correlacionarse con la sensibilidad de la línea celular a la citotoxicidad efectos de gemcitabina (coeficiente de correlación para IC50 media y media DEF: -0,82, p = 0,013).

La IC análisis demostró que después del tratamiento durante 24 h con gemcitabina inmediatamente antes del tratamiento de radiación, hay sinergias en ECV304 con gemcitabina concentraciones de 2 nm o superior (IC ≤ 0,65), con concentraciones de 4 nm o superior a A549 (IC ≤ 0,70) , MCF-7 (IC ≤ 0,62) y FaDu (IC ≤ 0.50) y con concentraciones de 6 Nm y superior en HT-29 células (IC ≤ 0,39). Sólo moderada se observó sinergismo con 6 nM o superior a H292 (IC ≤ 0,88) y CAL-27 (IC ≤ 0,72). En Panc-1 células, las concentraciones de 7 nm y superior dio lugar a un moderado para la interacción sinérgica (IC ≤ 0,79) (Figura 3].

dCK

Desde nuestra líneas de células tiene un rango de sensibilidad normal (rango nM) y tenía un DEF comparable a valores altos y bajos en la literatura, que mide la actividad dCK con el fin de determinar si habrá relación entre DEF y dCK actividad. Tabla 2 representa la dCK actividad y por línea celular. La actividad dCK varía considerablemente de línea celular a línea celular y difieren hasta tres veces de 5 a 15 pmol / h / mg de proteína entre las líneas celulares a prueba. En esta gama dCK actividad fue débilmente relacionadas con DEF (coeficiente de correlación = 0,62, p = 0,11) (Figura 4].

Discusión

Este es el primer estudio que muestra una clara concentración-dependiente radiosensitising efecto de la gemcitabina en un gran número de líneas celulares tumorales, procedentes de diferentes tejidos. Además, nos dimos cuenta de que que existe una débil correlación positiva entre dCK actividad de estas células y el DEF. Probablemente, más factores, entre ellos otros socios del metabolismo intracelular, efectos del ciclo celular y reparación del ADN juegan un papel importante. Esto ofrece una explicación de la variable resultados en la clínica.

En particular, hemos investigado el efecto radiosensitising en 8 diferentes líneas celulares, utilizando diferentes concentraciones de gemcitabina. Nuestros datos demuestran que aumenta la gemcitabina radiosensibilidad de ECV304, H292, A549, MCF-7, HT-29, CAL-27, Panc-1 y FaDu células in vitro cuando las células se tratan durante 24 h, inmediatamente antes de la radiación. El aumento es dependiente de la concentración, con un aumento de DEF con mayores concentraciones de gemcitabina.

Nuestro DEFs son comparables a la literatura de datos de otras líneas celulares [6 - 13, 46]]. En la mayoría de estos estudios, la concentración de gemcitabina necesarios para lograr tal efecto radiosensitising, fue mayor que en nuestro estudio. Esto parece ser dependiente de la sensibilidad a la gemcitabina sola agente de las líneas celulares estudiadas, ya que en gemcitabina resistentes a las líneas celulares incluso μ M concentraciones de gemcitabina se requiere [46]. Además, esto también podría ser debido a diferencias en la reparación del ADN entre las células. En nuestros experimentos, el efecto fue radiosensitising línea celular dependiente, por ejemplo, el aumento de las concentraciones de gemcitabina se necesitaban para inducir radiosensitisation en Panc-1 células (Tabla 1].

Como se ha mencionado es gemcitabina Un promedicamento que requiere sucesivas intracelular phosphorylations en su forma activa trisphosphate [56]. La enzima dCK se requiere para el primer paso en la fosforilación dFdCMP, mientras que los no específicos quinasas son responsables de la fosforilación más pasos. Como se ha informado de que el nivel de actividad enzimática de dCK podría tener una profunda influencia en la resistencia celular a gemcitabina citotoxicidad, las actuales investigaciones también fueron diseñados para abordar la relación entre la gemcitabina radiosensitisation y la actividad de dCK humanos en diversas líneas celulares tumorales. La gama de dCK actividad en las líneas celulares, está de acuerdo con el rango encontrado en otros tumores sólidos líneas celulares, pero más baja que en líneas celulares de leucemia [57]. Por esas líneas de células investigadas en la medida de la cantidad total de gemcitabina fosforilación a dFdCTP está relacionada con la concentración de drogas y la actividad de dCK [37, 45, 57]. Sin embargo, otros enzimas también contribuyen a la acumulación global y en particular la retención de dFdCTP, como Desoxicitidina deaminasa, 5'nucleotidase pirimidina (5'NT), aspecific nucleotidases y fosfatasas, y su incorporación en ADN y ARN.

Nuestros resultados en 8 diferentes tumores sólidos humanos líneas celulares con diferentes radiosensitising efecto de la gemcitabina no validar aún más la correlación entre dCK actividad de las células y los radiosensitising efecto de la gemcitabina. Gregoire et al [58] reportaron una correlación entre la actividad dCK y la gemcitabina radiosensitisation. Esta correlación se celebró tanto para dCK expresión mRNA y la proteína versus radiosensitisation [58]. Contrariamente a esto, que sólo hemos podido mostrar una débil relación entre la DEF y dCK actividad de ocho células tumorales. Posiblemente la variedad de dCK actividad en nuestro grupo no era lo suficientemente grande. En los xenoinjertos investigados por una relación entre la actividad dCK y gemcitabina la actividad antitumoral fue mayor [41].

Varias hipótesis se han propuesto para explicar el potencial de radiosensitisation gemcitabina [59]. De ellos, muy probablemente, la sincronización del ciclo celular [7, 60, 61] y de reparación del ADN [32] juegan un papel importante en la radiosensitisation. Además del metabolismo intracelular de gemcitabina, para que dCK es un factor fundamental, intrínseco variación en la respuesta celular a la analógica después de la radiación ionizante es probable que también desempeñan un papel en la gemcitabina radiosensitisation. La importancia relativa de la actividad dCK entre estos distintos parámetros es, sin embargo, no estaba claro. Es posible que la tasa global de la formación inicial de fosforilación gemcitabina también está determinado por el equilibrio entre las actividades de dCK y la enzima degradante, 5'NT, ya que la ratio de dCK / 5'NT mostró una mejor correlación con la sensibilidad que gemcitabina dCK actividad [62] . Por otra parte, el último modo de acción de gemcitabina de producir un "enmascarado cadena de rescisión" después de su incorporación en ADN, que favorece la reparación del ADN desempeña un papel importante con respecto a la concientización de las células tumorales a la radiación.

Conclusión

Nuestro estudio sugiere que otros socios del metabolismo intracelular de gemcitabina en relación con los efectos del ciclo celular y reparación del ADN podría ser más responsable de la radiosensitising efecto de gemcitabina que dCK actividad de la célula.

Conflicto de intereses

Hemos recibido apoyo financiero para realizar estudios con gemcitabina. Eli Lilly Company no es la financiación de este manuscrito.

Autores de las contribuciones

BP participado en el diseño del estudio, realizado la supervivencia celular experimentos, análisis estadístico y redactó el manuscrito; AEK, participó en el diseño del estudio y la coordinación; GGP y HJL participó en la supervivencia celular y se lleva a cabo experimentos de cultivo celular; JAK llevó a cabo la dCK actividad de medición; CDP participó en la irradiación de experimentos; GJP ha realizado un importante aporte al análisis e interpretación de los datos y ha sido la revisión crítica del manuscrito; FL participó en el diseño del estudio y la coordinación, ayudó a redactar el manuscrito y ha sido la revisión críticamente el manuscrito; JBV participó en la coordinación del estudio, ha participado en la redacción del manuscrito y su revisión crítica.

Pre-publicación de la historia

La pre-publicación de la historia de este documento puede accederse en:

Agradecimientos

Los autores whish dar las gracias al Dr. Balz de la Universidad de Düsseldorf para determinar el estado de p53 y H292 CAL-27 células.

Este estudio fue apoyado financieramente por una donación de la fundación Emmanuel van der Schueren y por una donación del Sr Willy Floren.