Proteome Science, 2006; 4: 14-14 (más artículos en esta revista)

Un ELISA basado en el procedimiento de ensayo en digiere las proteínas de los leucocitos humanos y líneas celulares, utilizando específicamente seleccionados péptidos y anticuerpos adecuados

BioMed Central
Ori Braitbard (orib@vms.huji.ac.il) [1], Janette Bishara-Shieban (janette1905@hotmail.co.il) [2], HAVA Glickstein (havag@pob.huji.ac.il) [1] , Miriam Kott-Gutkowski (mirita@vms.huji.ac.il) [1], Umberto Pace (paces@zahav.net.il) [2], Deborah G Rund (rund@cc.huji.ac.il) [ 3], Wilfred D Stein (wdstein@vms.huji.ac.il) [1]
[1] Química Biológica, Silberman Instituto de Ciencias Biológicas, Universidad Hebrea de Jerusalén, Israel
[2] Las pruebas MDR Ltd, 28 St Pierre Koenig, Jerusalén, Israel
[3] Departamento de Hematología del Hospital Universitario de Hadassah, Jerusalén, Israel

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Resumen
Fondo

Se describe la aplicación de un ELISA a base de ensayo (el Peptidomatrix) que se pueden utilizar al mismo tiempo, localizan y cuantifican una serie de proteínas en muestras biológicas. La muestra biológica (componente de la sangre, biopsia, la cultura o de otro tipo) es la primera zadas para liberar todas las proteínas, sin ningún tipo de separación adicional. La desnaturalización de proteínas en la muestra se digiere de forma masiva con la enzima proteolítica deseado (s). Los péptidos en el compendio se analizaron por anticuerpos adecuados, utilizando un protocolo de ELISA de competencia.

Resultados

Como ejemplo de su uso, en el presente documento se aplica a la Peptidomatrix el ensayo de cuatro proteínas de la membrana MDR1 (P-glicoproteína o ABCB1), Mrp1 (ABCC1), BCRP / MXR (ABCG2) y la subunidad alfa del Na, K_ATPase ( ATP1A1), presentes en un número de líneas celulares y en linfocitos humanos. Se demuestra que podemos detectar y cuantifican estas proteínas, utilizando una serie de péptido-anticuerpo pares, y que podemos diferenciar entre las líneas celulares de células o preparados que el objetivo de expresar las proteínas y los que no lo hacen.

Conclusión

Hemos elaborado un sencillo, ELISA basada en proteómica ensayo que permite la cuantificación de determinadas proteínas en una célula o tejido muestra, y que puede utilizarse en cualquier laboratorio, con un mínimo de equipo especializado.

Fondo

La revolución en biología iniciada por el Proyecto Genoma se ve estimulado por las actividades de investigación destinadas a la dilucidación de la proteoma, el complemento de proteínas expresadas por un organismo [1]. Proteómica tiene como objetivo desarrollar métodos para proporcionar un total de contabilidad de las proteínas presentes en una muestra biológica, con todas las valiosas ideas que se derivarán de la consecución de este objetivo [2 - 7] Gran parte de investigación proteómica emplea técnicas como la electroforesis en gel de 2D para la separación de las mezclas de proteínas seguido por el uso de HPLC y espectroscopia de masas la tecnología para la identificación de proteínas de la meta [7, 4]. Sin embargo, hay una clara necesidad de más sencillos y menos costosos métodos que pueden identificar un número limitado de proteínas en una muestra biológica, según sea necesario en las pequeñas clínicas o laboratorios de investigación.

En el presente trabajo se describe un ELISA basado en ensayo, la Peptidomatrix, sobre la base de un procedimiento que se ha desarrollado para identificar y cuantifican las proteínas en las biopsias y otras muestras biológicas [8, 9]. Desde el principio del ensayo es el uso de péptidos derivados de un tríptico resumen de la muestra, que puede ser utilizado en las muestras que han sido objeto de desnaturalización. Por lo tanto, una ventaja de la Peptidomatrix es que el procedimiento no requiere que la proteína diana estar presente en su forma nativa. Además, no antes de aislamiento y purificación de la proteína objetivo se requiere para la creación de la prueba. Todo lo que se necesita es el conocimiento de la secuencia de la proteína (o del ARNm que codifica para ello).

La muestra biológica (fracción de sangre, biopsia, la cultura o de otro tipo) es la primera zadas para liberar todas las proteínas, sin ningún tipo de separación adicional. La desnaturalización de proteínas en la muestra se digiere de forma masiva con la enzima proteolítica deseado (s). Los péptidos en el compendio se analizaron por anticuerpos adecuados, utilizando un protocolo de ELISA de competencia.

Peptidomatrix El ensayo se basa en la competencia entre un péptido derivado de un compendio proteolítica de la muestra y un péptido sintético idéntico, que ha sido previamente vinculado a la placa ELISA, de una acción adecuada de anticuerpos [10].

Resultados

El ensayo utiliza Peptidomatrix péptidos que son elegidos como (i) específica para una proteína diana y (ii) presente entre los productos de la digestión de tríptico que las proteínas. Hemos expuesto los transportadores de membrana de proteína MDR1 (o ABCB1 es decir, P-glicoproteína 1), MXR (o BCRP es decir, ABCG2) y Mrp1 (ABCC1) la cadena alfa de Na, K-ATPasa (ATP1A1) a un tríptico virtual y la digestión de los productos de la digestión, hemos elegido la longitud de péptidos de 7 a 15 amino-ácidos. Cada uno de estos péptidos se analizó utilizando el programa BLAST (véase métodos). Un conveniente péptido contiene sólo los partidos que son 5 o aminoácidos más corto, y un número mínimo de ellos. Los péptidos son elegidos figuran en el cuadro 1.

Las posiciones de estos péptidos en la secuencia primaria de cada una de las cuatro proteínas se muestran en la Fig 1. Anticuerpos policlonales se generaron en los conejos de todos estos péptidos salvo en el caso del péptido denominado P494 para que un comercial de anticuerpos monoclonales (C494) estaba disponible.

El Peptidomatrix ensayo, tal como se describe en la introducción, es un concurso de ensayo (Figura 2): Los péptidos están obligados a pozos de plástico. Los anticuerpos específicos para el péptido se añade en solución y se permite que se unen a los péptidos adjunta en la presencia o la ausencia de una muestra digerir. Una curva de calibración se genera en paralelo con cantidades conocidas de libre péptido sintético. La concentración de péptido soluble en la muestra se mide por interpolación.

La Figura 3 muestra un típico experimento en el que péptido P494 (de MDR1) y el anticuerpo monoclonal C494 se utilizaron para detectar y cuantificar los péptidos en las células CEM, en resúmenes preparados a partir de ya sea de tipo salvaje células (WT) o de células resistentes a múltiples (Col1000) . En el panel A la curva de calibración que representa la señal de ELISA en función del libre péptido sintético se muestra como una línea sólida. Esta curva es una hipérbola descendente, desde el más libre péptido, se añadirá la parte inferior la señal. De forma paralela, alícuotas de digerir las células se analizaron de la misma manera. También en este caso, el péptido más presentes en el compendio, menor será la señal será. En la Figura 3A las señales de resúmenes de WT y Col1000 CEM células se muestran (sólidos y vacíos triángulos). La concentración de péptido en el compendio se calcula por interpolación sobre la curva de calibración. Un simple cálculo (véase Materiales y Métodos) produce una estimación de la concentración de péptido (en ng / ml) presente en el compendio. Grupo B de la Fig 3 se resumen los resultados de varios experimentos, como los que figuran en el grupo A. En cada experimento, hemos añadido a un volumen creciente de la tríptico resumen de la naturaleza o tipo de drogas resistentes a las células CEM, que se estiman las cantidades de péptidos en la muestra y trazan estas contra el importe agregado de digerir. La cantidad de péptido detectó la droga en las células resistentes aumenta con cantidades cada vez mayores de digerir, mientras que el nivel en el medio silvestre tipo CEM células se mantenga cercana a cero.

Fig 4 muestra los medios y errores estándar de 15 experimentos realizados como en la Fig 3, con los datos ahora presentados como ng de péptido detectado por millones de células. Hay una muy clara diferencia entre el conjunto de datos para la farmacorresistente Col1000 células y la matriz CEM células. La parcela para la Col1000 células no es lineal, presumiblemente porque los pozos tienen sólo una cantidad limitada de los sujetos péptido. Montar estos datos a una hipérbola (es decir, Michaelis-Menten ecuación) dio una estimación inicial de la pendiente de 19,7 ± 2,5 ng péptido por millón de células y medio de la saturación valor de 5,2 ± 1,7 millones de células. Con un peso molecular de 1158,31 para el péptido, esta pendiente se traduce en 10,2 millones de P-glicoproteína Col1000 moléculas por célula.

Curiosamente, las curvas de valoración como Fig 3A permitir que otra estimación que se hizo de la serie de P-glicoproteína Col1000 moléculas por célula. El promedio de la media de valores de saturación de las 15 curvas de calibración se realiza para generar la figura 4 fue 0,678 ± 0,0678 (SE, n = 15) μ g / ml de péptido. Dado que cada así recibe 100 μ l de solución péptido, es de 68 ± 6,8 ng péptido en la media y en la que el anticuerpo es un medio saturado. En la figura 4, la mitad de la saturación se alcanza a los péptidos presentes en 5,2 ± 1,7 millones de células. Equiparar estos dos valores, uno puede concluir que hay 68/5.2 o 13,0 ± 4,4 ng péptido por millón de células (o 6,7 millones de P-glicoproteína Col1000 moléculas por célula). Esto y la estimación de 19,7 ± 2,5 ng por pocillo de encontrar la pendiente inicial de la parcela de la Fig 4 son menos del 1 SE unidad aparte.

Optamos por aplicar el protocolo Peptidomatrix a la Na, K-ATPasa a fin de proporcionar una "calibrar la proteína" que estarían presentes en cada tipo de célula animal y que permita a la Peptidomatrix usuario para normalizar los datos en términos de esta proteína. Es también un control adecuado en este caso, ya que estas proteínas comparten una gran similitud en su estructura celular y localización con el objetivo de otras proteínas. Fig 5 muestra ese experimento en el que, en la misma placa de ELISA, las muestras de un compendio de la leucemia de células (del paciente ME) fueron ensayadas para MDR1 utilizando el P3 y el péptido adecuado de anticuerpos policlonales y, en paralelo, se analizaron para la Na , K-ATPasa utilizando el P4 y el péptido adecuado de anticuerpos policlonales. Las partes A y B, de esta cifra muestra la concentración de péptido obtenidos (con el procedimiento de Fig. 3] con estas dos proteínas por separado, mientras que la figura 5C muestra el nivel de MDR1 P3 representará gráficamente en relación con la de Na / K-ATPasa P4. La regresión a través de los puntos tiene una pendiente de 0,65, lo que indica que en un lunar para la base lunar, estas membranas de las células contienen tres moléculas de la bomba de sodio por cada dos moléculas de MDR1.

Fig 6 se muestra un resumen de compilación de datos de este y otros cinco experimentos que esta calibración interna protocolo se aplicó a las células blancas de la sangre muestras tomadas de cinco pacientes. En todos estos experimentos, duplicados de las muestras de células de cuatro o cinco pacientes se analizaron en la misma placa de ELISA para ambas proteínas. El ratio de P-glicoproteína polipéptido a la Na, K-ATPasa polipéptido se calculó para cada muestra de paciente y esta relación se normalizó a la de una muestra de referencia (las células del paciente VR, con una media de ratio de PGP P3/ATPase P4 = 0,714 ± 0,237) para mostrar en la Figura 6. El importe de MDR1 es mucho más elevada (valores de p <0.05) en la muestra de pacientes de AR que en los pacientes de VR y SH, y el donante normal, pero no en que de mí. En un experimento de la serie, una muestra de la Col1000 resistentes a drogas células se incluyó en la placa ELISA. La proporción de MDR1 P3 péptido a ATPasa P4 péptido en esta muestra fue 13 veces superior al de la referencia VR células representado en la figura 6. Estas células, al igual que otras líneas celulares, parecen tener un nivel muy bajo de Na, K-ATPasa, que no podrá ser un buen control de la normalización en este caso.

Para probar la validez del protocolo Peptidomatrix se compararon los resultados obtenidos con un método independiente de análisis para la detección de niveles de MDR: un cuadro clínico establecido funcional método basado en la absorción del colorante rodamina 123 (rho123), que se usa en muestras clínicas. En las células que expresan PGP funcional, rho123 es rápida y activamente bombeado fuera de la célula y, dentro de un corto período de tiempo, marcadas diferencias en intracelulares de fluorescencia se consideran entre las células que tienen o no han rho123 extruido a través de este ATP-dependientes de la bomba [11 ]. PGP-revertir las drogas, como Verapamil, puede ser utilizado en el ensayo de retención rho123 preferentemente para bloquear la función PGP [12].

Las muestras clínicas, ya sea fresco o congelado muestras de muestras de glóbulos blancos. Todos los preparativos eran de linfocitos de sangre periférica o de leukopheresis tratamiento. Las muestras congeladas se había mantenido a -70 ° C hasta un máximo de seis años y la rodamina captación de ensayo se ha realizado y registrado en el momento de la colección.

Multirresistencia células sensibles CEM (peso) y resistentes a las células CEM (col) actuaron como controles. Porque contar las células en las muestras congeladas no era posible, el parámetro para el número de células que se utilizó fue la concentración de proteína. La concentración de proteínas se midió utilizando el método de Bradford antes de la lisis de las células y la precipitación de las proteínas. La MDR niveles de proteína en las muestras fueron determinados por el uso de la Peptidomatrix MDR P3 péptido y se expresan como ng péptido por mg de proteína.

El cuadro 2 muestra una comparación de los resultados obtenidos a partir de la Peptidomatrix con los de los análisis funcional. Atención fue adoptado para garantizar que las fechas de las muestras que habían sido probado por el funcional y el ensayo congelado muestras analizadas por el ensayo Peptidomatrix fueron agrupados, debido a la conocida variación de la expresión de la proteína en el mismo paciente en diferentes momentos.

Los resultados en el cuadro 2 se resumen en términos cualitativos (negativo, positivo bajo, positivo y positivo alto) y su correlación fue probado mediante el uso de la correlación de Pearson.

La correlación de Pearson entre el ensayo y Peptidomatrix rodamina la captación de ensayo se ha calculado como 0,79.

Con el fin de validar la cuantificación de PGP por otro método que es independiente de la Peptidomatrix ensayo, PGP también fue cuantificado por la actividad ATPasa de ensayo y los resultados obtenidos por los dos métodos fueron comparados.

La determinación del número de moléculas de PGP sobre la base de ATPasa actividad se realizó en las membranas purificado obtenido a partir de CEM-col células, utilizando la actividad ATPasa asociada con PGP, utilizando tanto la actividad basal y el verapamilo (10 μ M)-estimulado la actividad. En un experimento típico de la actividad basal ATPasa fue 23,2 mM Pi / μ g de proteína / hora y el verapamilo-estimulado la actividad fue 82,7 mM Pi / μ g de proteína / hora. Como se detalla en la sección Métodos del volumen final del Pi liberado determinación es 260 μ l. Estos datos fueron convertidos a número de moléculas / mg de proteína utilizando los siguientes números de volumen de negocios: 2,9 s -1 para la actividad basal y 9,9 s -1 para el verapamilo-estimulado la actividad, respectivamente [13]. El final valores calculados fueron 3,48 × 10 14 moléculas pgp / mg de proteína y 3,63 × 10 14 moléculas / mg de proteína para la estimuló y la actividad basal. Los datos se obtuvieron a partir de cuatro muestras. Para medir la cantidad de PGP Peptidomatrix una curva de inhibición con péptido sintético (PGP P3) se ha ejecutado junto a una curva similar se ejecuta con la dilución de un tríptico resumen de la misma purificada membranas utilizadas anteriormente. El Kd's (la mitad de saturación de puntos) de las dos curvas se 10-2 × 2,87 μ g / ml y péptido 3,11 μ l digerir, respectivamente. Dado que la concentración de la digerir (determinada antes de la digestión) es de 25 mg / ml, el peso molecular del péptido se daltones 1111, y el volumen de la reacción de ELISA es de 100 μ l, la cantidad de PGP en las membranas llega a 3,03 × 10 14 moléculas pgp / mg de proteína, un valor muy cercano a la obtenida a partir de la ATPasa de ensayo. En una serie de experimentos utilizando diferentes preparaciones de membranas, los valores para el número de moléculas de Pgp por mg de proteína de membrana obtenidos por los dos métodos fueron 5,49 ± 1,14 × 10 14 (error estándar n = 4) y 5,46 ± 1,73 * 10 14 (error estándar n = 4) de la ATPasa (que combinan los datos de basal y estimulada verapamilo) y Peptidomatrix respectivamente.

En el gráfico 7 Peptidomatrix se muestran los datos de otras dos proteínas de membrana, Mrp1, estudió en una droga sensible línea celular (VP16) y el padre MCF7 línea celular (Fig 7A y 7B] y MXR, estudió en las drogas sensibles (AdVp) y silvestres MCF7 tipo de líneas celulares (Fig. 7C]. Peptidomatrix El ensayo muestra que la cepa parental es bajo en MRP, mientras que la droga-resistentes línea es rica en esta proteína (Fig. 7B].

Desde el inicial pendiente de la línea trazada a través de los círculos vacíos, puede calcularse que hay algunos 1,69 ± 0,38 millones de moléculas de la proteína Mrp1 por única MCF-7 Vp 16 células. La de tipo salvaje línea celular tiene poca o ninguna de la proteína Mrp1, de este ensayo.

Discusión

Los recientes avances en la investigación proteómica han fomentado la aparición de muchas técnicas diferentes para la identificación y cuantificación de proteínas a partir de células y tejidos. Con el fin de aplicar estos avances científicos al mundo de la rutina clínica de diagnóstico es necesario para un simple y fácil de utilizar el método. Se presenta aquí una posible respuesta a esta necesidad en forma de la Peptidomatrix, y describir, como ejemplo, su utilización para la identificación, y analizaron cuantitativamente, cuatro proteínas de membrana presente en las recopilaciones de tipo salvaje y resistente a múltiples líneas celulares y en blanco las células sanguíneas de pacientes con leucemia. El ensayo está basado en ELISA y utiliza anticuerpos dirigidos contra los pequeños péptidos que han sido seleccionados como (i) probablemente será liberada tríptico de la digestión de las células y (ii) a la única proteína particular objeto de investigación. Hemos encontrado que muchos de los péptidos que hemos sintetizado sobre la base de estos criterios, como aptas para su uso en la Peptidomatrix protocolo, ¿nos dan útil péptido-anticuerpo combinaciones. La mayoría de los péptidos que se han diseñado para su uso con las proteínas P-glicoproteína, Mrp1 y MXR dio satisfactoria las diferencias de señal al tipo salvaje y las drogas de células cepas resistentes fueron comparados (Figs 3 - 4 y 6 - 7], lo que sugiere que se les la identificación de una proteína que estuvo presente en las células resistentes a drogas, pero no en las cepas parentales. Esa prueba no se pueden realizar para el péptido / pares de anticuerpos contra el ubicuo Na, K-ATPasa. La proteína para la que hemos de datos más importante es MDR1 (también conocido como P-glicoproteína o ABCB1) que les confieren carácter multi-resistencia a los fármacos a las células en cultivo y se asocia con la resistencia a los fármacos en pacientes con cáncer. Por esta proteína, el péptido P494, el epítopo del anticuerpo monoclonal C494, permite la identificación específica de la proteína en las células compendios de un fármaco-resistente de la línea T-leucemia linfoblástica de células, las células Col1000. Fig 3 ilustra la competencia de ensayo que usamos en la Peptidomatrix protocolo. Los datos de los distintos experimentos se pueden transformar en parcelas de péptido vs número de células. Fig 4 resume los resultados de 15 experimentos utilizando el protocolo Peptidomatrix en estas células. Montar los datos de una hipérbola lineal permite que el inicial pendiente de la curva que se determine. Esta primera vertiente es en unidades de nanogramos de péptido presente por millones de células. Dado que el peso molecular del péptido que se conoce, los datos pueden traducirse en un número que es equivalente a la cantidad de P-glicoproteína moléculas por célula. El número que se calcula que 10,2 millones de P-glicoproteína Col1000 moléculas por célula. Hemos querido comparar estos valores con otros similares cuantificaciones en la literatura.

Aunque ha habido muchos estudios de la expresión del ARNm MDR1 y niveles de la proteína en las células resistentes a las drogas, este último mediante transferencia Western-Blots o FACS análisis, hemos sido capaces de encontrar sólo dos estudios cuantitativos que registran la cantidad de P - glucoproteína presente en dichas células. Un estudio [14] utiliza la técnica de FACS y el agotamiento de un anticuerpo método en tres líneas de células 3T3 de ratón. La línea de alta resistencia (N3-2400) se observa un 14,2 × 10 6 moléculas de PGP / elemento [15], un valor muy cercano al que hemos detectado en la alta resistencia de células CEM. El otro estudio cuantitativo de la P-glicoproteína moléculas por célula es de Maynadie y colegas [16]. Estos autores también utilizaron una técnica de FACS, pero calibrada la FACS señal con una serie de bolas marcadas con un tinte fluorescente [17]. Se midió P-glicoproteína en un sensible y resistente a las drogas erythroleukemic línea celular (el K562 y K562-ADR células). Estas células tienen 291 y 303481 P-glicoproteína moléculas por célula, respectivamente. Cabe señalar que el K562-ADR son realmente las células resistentes a la doxorrubicina, pero mucho menos que el CEM células que hemos utilizado en este estudio y la línea 3T3 se mencionó anteriormente).) [18]. Maynadie y compañeros de trabajo informó también de datos sobre células de leucemia humana y se encontró muy variable el número de sus P-glicoproteína contenido, que van desde 117 a 10.947 (media de 2509 ± 2805) moléculas por célula, en las células de los 25 donantes estudiados [16]. Nuestros resultados parecen confirmar la gran variabilidad individual en la cantidad de PGP en los glóbulos blancos. Comparación entre el método y Peptidomatrix un cuadro clínico establecido método funcional, rodamina 123 absorción, muestra una alta correlación (de correlación de Pearson de 0,79) entre los dos métodos (Cuadro 2]. Peptidomatrix pruebas de MDR 1 proteína en pacientes con AML mostró que el 66% de ellos expresan la proteína. Esto encaja con las estimaciones más o menos en la literatura, que muestran que 35-80% de pacientes con LMA expresar la proteína. Esto proporciona apoyo a la fiabilidad de Peptidomatrix como una herramienta de diagnóstico para identificar la presencia o ausencia de la P-gp proteína en los pacientes.

Los resultados obtenidos con Peptidomatrix fueron comparados con otros métodos bioquímicos aceptado. Western Blot y RT-PCR, que sólo proporcionan resultados cualitativos, son plenamente coherentes con los resultados Peptidomatrix (datos no presentados). Se determinó el número de P-glicoproteína moléculas por célula, midiendo la actividad ATPasa de esta proteína y combinar esto con el número conocido el volumen de negocios de la enzima. Esto proporcionó un resultado cuantitativo, lo que permite una comparación directa con la Peptidomatrix. La especificidad de la ATPasa método de P-gp se garantiza mediante la inclusión en el ensayo de mezcla de todos los inhibidores de la irrelevante ATPases. Los dos procedimientos, Peptidomatrix actividad ATPasa y se encontraban en excelente acuerdo. Así, por lo que pueda evaluarse, la Peptidomatrix protocolo proporciona un método fiable para la identificación y cuantificación de la MDR 1 que se utilizó en el presente estudio.

Un punto importante a debatir aquí es la aplicabilidad general de la Peptidomatrix y su capacidad para detectar baja abundancia de proteínas. En este estudio se trabajó con 4 diferentes proteínas, que, aunque similar en estructura y localización celular tienen diferentes secuencias y la distribución. El procedimiento Peptidomatrix, ejecutada con la adecuada péptido-anticuerpo par es claramente capaz de detectar todos ellos. En los experimentos (no se muestra) en el que coincidentes proteínas, péptidos y anticuerpos, por lo general obtienen valores de referencia y los que no hemos podido construir una curva de calibración, lo que indica que la especificidad del sistema, al menos para la gama de proteínas que hemos examinado, es bastante buena. Prácticamente todos los péptidos elegido, que figuran en el cuadro 1, se activa y específica cuando se trata de ensayos, un hecho que indica claramente la amplia aplicabilidad del método. En cuanto a la sensibilidad del método, debemos decir que hay margen de mejora. El PGP experimentos se muestra en la Figura 3 y 4 indican una LOD en el submicromolar gama (10 -7 -10 -8 M). Este es un valor muy alto, lo cual no siempre es suficiente, aunque en el contexto de la PGP campo que sea. Sin embargo, un vistazo a los datos en la figura 7B muestra que la LOD para usar el MRP MRP I péptido y afines de anticuerpos está en el rango de 10 -14 M, lo que indica claramente que existe la posibilidad de un ensayo suficientemente sensibles.

Las proteínas que estudiamos fueron elegidos por el mero de este laboratorio de la familiaridad con ellos. Ofrecemos la Peptidomatrix procedimiento, sin embargo, como una solución general al problema de encontrar una forma simple y fácil de establecer un método de estas determinaciones en muchas investigaciones biológicas y situaciones clínicas. Lo único que requiere es adecuada la selección de péptidos en las proteínas que desee analizar y preparar anticuerpos contra ellos. Una vez que estos estén disponibles, estimaciones fiables de las cantidades de la proteína especificada puede hacerse de resúmenes de una gran variedad de material biológico.

Conclusión

Hemos elaborado un sencillo, ELISA basada en proteómica ensayo que permite la cuantificación de determinadas proteínas en una célula o tejido muestra, y que puede utilizarse en cualquier laboratorio, con un mínimo de equipo especializado.

Métodos
Péptido selección

Los péptidos en que la prueba ELISA se basa son elegidos mediante un triple proceso de selección: En primer lugar, es una lista de todos los péptidos que pueden estar presentes en un tríptico resumen de la proteína a ser identificado. Esto puede hacerse mediante un procedimiento sencillo programa de procesamiento de textos o más programas informáticos especializados. A continuación, se seleccionan los péptidos que tienen longitudes de entre 7 y 15 aminoácidos. Cada péptido de esta selección está marcada por su carácter único entre todas las cadenas polipeptídicas que conforman el proteoma humano, utilizando el programa BLAST (parámetros: PAM 30 Gap Costas Existencia 5, Extensión 2). El criterio principal para esta etapa de selección es la presencia de coincidencias con otras proteínas conocidas que son 5 aminoácidos o más corto. A partir de esta lista limitada, hemos elegido la más hidrofílicos péptidos como los que sería más probable que sea buena antígenos [20, 21] Un número de estos péptidos seleccionados fueron finalmente elegidos para la producción de anticuerpos y, a continuación, utilizados en el protocolo se describe a continuación

Los péptidos elegido para esta investigación se muestran en la Tabla 1.

Los anticuerpos

Los anticuerpos policlonales utilizados a lo largo de este estudio se generaron en los conejos de Affinity Bioreagents, Inc (ABR, Golden, CO). El antígeno para la inmunización fue preparado también por ABR, incluida la síntesis de los péptidos, la conjugación de un transportista y la inyección a los conejos. Los conejos fueron sangrados una vez antes de la vacunación y 3 o 4 veces después de la vacunación. Los títulos fueron grabados y las diversas hemorragias mantenerse y utilizarse para el desarrollo del inmunoensayo.

Anticuerpo monoclonal C494 fue adquirido de Dako (Glostrup, Dinamarca)

Células

CEM (WT; Col1000.) Estas células se describen en Kohler y Stein [19].

CEM líneas celulares fueron cultivadas en suspensión en un 5% atmósfera de CO 2 a 37 ° C utilizando RPMI-1640 mediano (biológicas Industries, Kibbutz Beit Ha'emek, Israel), complementado con un 10% de suero de ternera fetal, 2 mM de glutamato, 100 U ml -1 Penicilina, 100 μ g ml -1 estreptomicina, 250 μ g ml -1 anfotericina. La humanos lymphoblastoid línea celular CEM Col1000 se deriva de la línea CEM ADR5000 de cultivo de la original de las células de más de cuatro semanas en medio con 1000 ng ml -1 colchicina. Ellos se mantuvieron en esta concentración de la colchicina.

MCF7 células humanas son células del cáncer de mama. Las dos drogas resistentes a las líneas, VP-16, y AV, fueron generados por la transformación con plásmidos que expresan Mrp1 y MXR, respectivamente. Las células fueron cultivadas en medio DMEM suplementado con suero de ternera fetal y antibióticos, tal como se describe más arriba. El crecimiento medio de la VP-16 se completó la línea con 4 μ M etopósido, mientras que la línea de AV se cultivó en presencia de 5 μ g / ml verapamilo y 3 μ g / ml adriamycin.

Linfocitos de sangre periférica

De sangre periférica de células mononucleares se separaron más de gradientes de Ficoll. Ficoll separación se realizó en la mayoría de los casos el mismo día, y cuando esto no era posible, toda la sangre se mantiene a 4 ° C y separados el día siguiente. Las células se suspendieron en RPM1 1640 con un 10% de suero de ternera fetal hasta el análisis, generalmente el mismo día o hasta 48 h más tarde.

Preparación de la muestra

"Pellets" de 20 millones de CEM o glóbulos blancos (o 5 millones de células MCF7) fueron disueltos por la re-suspensión de la muestra a 250 μ l SDS 2% en PBS e incubadas a temperatura ambiente durante 10 minutos. La proteína fue precipitada por la adición de 4 volúmenes de metanol / ácido acético pH 4,0 (15 ml methanol/40 μ l de ácido acético glacial) y incubando la noche a la mañana a -20 ° C. La proteína fue entonces pildoradas por centrifugación a 13000 rpm, en una centrífuga Eppendorf (16000 g) durante 20 min a 4 ° C. Los pellets se lavaron dos veces con etanol y secado al aire antes de volver a la suspensión.

ELISA

Maxisorp placas ELISA (Nunc, Dinamarca) fueron recubiertas la noche a 4 ° C, con 100 μ l de a0.1-2 μ g / ml de solución de los péptido sintético en 0,1 M de carbonato de buffer de pH 9,6 y bloqueado 2 horas a temperatura ambiente con 200 μ l de amortiguador de bloqueo (3% BSA/0.05% de Tween 20 en tampón fosfato salino, PBS: 0,01 M en tampón fosfato, 150 mM NaCl, pH 7.2). Diluciones seriadas binario del péptido sintético (de 5 a 0,078 μ g / ml) y una muestra en blanco fueron preparadas en 50% la digestión una solución tampón que contiene 1 × PBS, el 3% BSA, 0,05% de Tween 20 y el suero inmune deseada diluido 1:3000. Cuando el anticuerpo monoclonal C494 se utilizó fue diluida a 0,1 μ g / ml. Estas soluciones fueron utilizados para la curva de calibración. Las muestras experimentales figura el 50% de células digerir, como los anticuerpos y no por encima de otros péptidos. 100 μ l de estas soluciones se han añadido a los pozos y incubados a temperatura ambiente 1-3 horas. Los pozos se lavaron 4 veces con 1 × PBS/0.05% de Tween 20 y luego 100 μ l de peroxidasa de rábano (HRP)-Ab secundario conjugado (anti-ratón o anti-conejo) diluido 1:10000 o 1:20000 en tampón de bloqueo se añadido en cada pocillo. Después de la incubación durante una hora a temperatura ambiente y el lavado, como se indica más arriba, los sujetos conjugado HRP se detectó mediante la adición de 100 μ l de tetrametilo de bencidina. La reacción peroxidasa fue detenido después de 5 minutos mediante la adición de 50 μ l 0,5 MH 2 SO 4. Densidad óptica a 450 nm se midió utilizando un lector de ELISA.

Datos determinación

Los datos de la placa de Elisa lector se alimentan en una plantilla de análisis de datos en el programa Sigmaplot (SPSS, Chicago, IL). Una parcela de la OD450 frente a la concentración de los anticuerpos o la concentración de la péptido libre se dibuja. La trama es luego, utilizando un programa de regresión, a una hipérbola instalación de un ascendente (Equation. 1) o de un descendiente (Equation. 2) hiperbólica de 3 parámetro ecuación, tal como se describe en el texto:

MAX donde se calcula la máxima amplitud de la curva, D predijo el mínimo de lecturas de la prueba ELISA, que corresponden esencialmente a la señal de fondo, S la concentración de los anticuerpos o el péptido adjunta (en la ecuación 1) o la libre péptido (en la ecuación 2 ) Y Kd es la concentración que da la mitad de la transferencia entre el máximo y mínimo de lecturas.

Rodamina absorción

Mononucleares de sangre periférica de células, preparado como se ha descrito anteriormente, se colorearon con rodamina-123 utilizando el método descrito por CHAUDHARY y Roninson [22]. Se utilizó 150 ng / ml de rodamina-123 para la tinción, durante 15 minutos a 37 ° C con un flujo de salida tiempo de 2 h, 10 mM verapamilo fue utilizado como un inhibidor de MDR1. Las células fueron counterstained con yoduro de propidio inmediatamente antes de su análisis para identificar las células muertas (en su caso se presente), que fueron retirados del análisis de gating. Hemos definido un resultado positivo como uno en que la Kolmogorov-Smirnov (KS abreviada) el valor D [23] es igual o superior a 0,15 [24 - 26].

Membranas plasmáticas preparación

Las células fueron cosechadas en una tabla de arriba centrifugar a 1000 rpm x 5 min, y lavado dos veces con 20 mM Hepes pH = 7.4/0.9% NaCl buffer. Las células fueron entonces resuspendido en buffer de lisis (10 mM Hepes-Tris pH = 7,4, 2 mM de TDT, 5 mM EDTA, 5 mM EGTA) que contienen inhibidores de la proteasa (cóctel de Sigma) a una concentración de 30 millones / ml. Las células se incubaron en hielo durante 15 minutos y todos los procedimientos se realizaron a 4 ° C. Las células fueron homogeneizada en un vaso de teflón-homogeneizadora (40 golpes), hasta el 70% interrupción. La lisis de las células se examinan bajo el microscopio de luz. The homogenate is centrifuged for 10 minutes at 3000 rpm (300 g) in a tabletop centrifuge to spin down nuclei and unlysed cells. Subsequently the mitochondria were removed by centrifugation at 5500 rpm (4000 g) in a Sorvall centrifuge (rotor SS34) for an additional 10 minutes. The supernatant was then transferred to an ultracentrifuge tube and centrifuged at 35000 rpm (114000 g) in a 70 Ti rotor for 45 min. In this third and final centrifugation the plasma membranes were sedimented. The supernatant was discarded, the membrane pellet was resuspended in 500–1000 μl of lysis buffer and homogenized by aspiration 5 times through a 22 gauge syringe. The isolated membranes were stored at -70°C in aliquots.

ATPase assay

The PgP-associated ATPase was determined colorimetrically as the vanadate-sensitive release of inorganic phosphate from ATP hydrolysis (REF). 1 μg membrane protein were incubated in ATPase buffer (50 mM KCl, 2.5 mM MgSO4, 0.5 mM EGTA, 3 mM DTT, 3 mM ATP, 2 mM oubain, 3 mM sodium azide, 25 mM Tris/HCl pH 7.4) and verapamil ( 10 μM), if desired. The reaction was carried out in 96 well microtiter plates in a final volume of 60 μl in the presence or the absence of 0.25 mM sodium orthovanadate. The microtiter plate was incubated at 37°C for one hour and the reaction was terminated by adding 200 μl of stop solution (0.2% ammonium molybdate, 1.3% sulfuric acid, 0.9% SDS and 1% ascorbic acid). After an additional 30 minutes of incubation the absorbance at 620 nm was read in a microplate reader. ATPase activity was expressed in mmol Pi/hr/mg protein.

Conflicto de intereses

Los autores declaran que no tienen intereses en conflicto.

Autores de las contribuciones

HG and J BS initially developed the Peptidomatrix procedure. J BS worked out the method for preparations of tryptic peptides from biological material. J BS, OB, M KG and HG performed the experimental work and contributed to the discussions. OB, WDS and UP wrote the manuscript. DGR and UP provided intellectual guidance. DGR provided the patient material. WDS initiated the project, developed the mathematical analyses used, and directed the research.