Ritmicidad circadiana de Autocatálisis
La temperatura compensada in vitro oscilación de cianobacterias KaiC fosforilación, el primer ejemplo de un sistema termodinámicamente cerrado que muestra ritmicidad circadiana, sólo involucra a las tres proteínas Kai (Kaia, KaiB, y KaiC) y ATP. En el presente trabajo se describe un modelo en el que la Kaia-y con ayuda de KaiB autocatalítico fosforilación y dephosphorylation de KaiC son la fuente para la ritmicidad circadiana. Este modelo, basado en Autocatálisis en lugar de transcripción-traducción retroalimentación negativa, muestra la temperatura compensada circadiano límite del ciclo de oscilaciones con KaiC perfiles de fosforilación y ha longitudes período constante de velocidad y los valores que están en consonancia con las observaciones experimentales.
Los ritmos circadianos son ecológicamente adaptable y homeostatically regulado osciladores se encuentran en muchos organismos. En cianobacterias, hongos, moscas, y los mamíferos, transcripcional-translacional ciclos de retroalimentación negativa de los genes reloj han sido identificadas [1, 2] y el modelo [3 - 6] como constituyentes de los marcapasos circadiano. El modelo más simple a los organismos que los relojes se estudian son las cianobacterias [2]. Como es el caso de otras especies, estas prokaryotes se sabe que muestran ritmicidad circadiana debido a la retroalimentación negativa regulación de los genes reloj [7, 8]. Juntos, Kaia, KaiB, KaiC proteínas y regular en términos generales el cianobacterias transcriptome [9, 10], e in vivo, estas proteínas parecen participar en una bona fide transcripcional-translacional retroalimentación negativa del oscilador [2].
Hay pruebas recientes, sin embargo, sugiere que la
Oscilación en KaiC fosforilación es el mejor parámetro observado en este sistema y representa una variable de estado clave para el reloj en vivo. De este modo hemos tratado de cerca a imitar este producto en nuestro estudio. KaiC es una enzima con autokinase y autophosphatase actividades [15, 16]. Kaia aumenta KaiC función [17], mientras que KaiB disminuye el efecto de Kaia en KaiC [16, 18]. Nakajima et al. [12] sugiere, dada la doble función de KaiC y "la cooperación entre Kaia y KaiB," autónomo que KaiC oscilación de fosforilación podría lograrse.
Hemos decidido explorar esta sugerencia explícita mediante el establecimiento de un modelo básico basado en conocido biológicos y bioquímicos observaciones que no implican la transcripción o traducción. En la Figura 1, se resumen los principales pasos que hemos motivado la base de la KaiC oscilador ATP cuando se presenta en exceso. Es un hecho bien establecido que los tres Kai proteínas interactúan en todas las combinaciones posibles [19] y, cuando sea posible, hemos incorporado fase de interacciones específicas obtenidas a partir de la literatura [18]. El modelo (Figura 1], representado como un diagrama de reacción cíclica, contiene siete procesos (R1-R7 con constantes de velocidad k 1 k-7) que representa el proyecto de proteína-proteína y las interacciones de fosforilación-dephosphorylation acontecimientos entre el Kai proteínas. KaiXY denota la interacción entre KaiX y KaiY proteínas. En KaiC *, el asterisco indica completamente fosforilados KaiC. KaiC sin un asterisco representa en gran medida unphosphorylated así como los bajos niveles de forma incompleta fosforilados KaiC moléculas (por ejemplo, los mandantes de hypophosphorylated hexamers) [20]. En el proceso de R1, KaiC une Kaia, formando KaiAC [21]. Dado que no hemos formulado explícitamente el doble fosforilación en KaiC eventos, el modelo no excluye la posibilidad de que los bajos niveles de fosforilados KaiC se requieren antes de Kaia KaiC se une de manera eficiente como se observa por Nishiwaki et al. [20]. Desde Kaia autokinase facilita la actividad de KaiC [17], KaiAC rápidamente se convierte en la forma completamente fosforilados, KaiAC *, proceso de R2. Además, este paso es coherente con la observación de que inhibe Kaia KaiC dephosphorylation [16]. En el siguiente paso, R3, proponemos que KaiAC * adopta una conformación a fin de que pueda facilitar el montaje y la fosforilación de libre Kaia y KaiC en KaiAC *, la ampliación de la propuesta de Kitayama et al. [18] que "Kaia aumenta la acumulación de KaiC ... por autokinase el mejoramiento de su actividad en un processive manera" y que "fosforilados KaiC puede acelerar su unión a Kaia." Curiosamente, un posible "doble-rosquilla" conformación [22] de KaiC hexamers podría ser la base de un andamio-facilitado mecanismo de replicación. En el proceso de R4, KaiB asociados con KaiAC * para formar el complejo ternario KaiABC *. Esto es coherente con los datos experimentales que demuestran que KaiB interactúa con KaiC sólo después de KaiC ha obligado a Kaia [18, 23]. Kaia la estructura cristalina [24] sugiere que KaiB y KaiC vinculante pueden ser regulados de mutuo acuerdo, y esto es coherente con nuestra propuesta por etapas obligatorias. En el proceso de R5, Kaia está desplazada de KaiABC *, y esta reacción sigue una propuesta que podría desplazar KaiB Kaia en KaiC debido a un sitio de unión a KaiC [25]. El in vitro KaiB atenuación de la estimulación de Kaia KaiC podría ser alcanzado por un desplazamiento [26]. Cuando Kaia ya no está presente en KaiABC *, proponemos que KaiB desvincula de KaiBC * (proceso R6). Por último, en proceso de R7, KaiC * autophosphatase utiliza su actividad [15] y se convierte en KaiC. Aunque los procesos de R6 y R7 que podría ocurrir en uno u otro fin o simultáneamente, preferido una reacción de orden secuencial, porque KaiB es en gran medida en complejas con fosforilados KaiC [20]. Ecuaciones 1-8 (Figura 1) son el tipo de ecuaciones del modelo.
La fuente de las oscilaciones es la reacción autocatalítico R3 de la fosforilados KaiC-Kaia complejo (* KaiAC, Figura 1] junto con la posterior eliminación de las especies autocatalítico y la regeneración de dephosphorylated KaiC (reacción R7). El sugirió la formación de autocatalítico KaiAC * es típica para la cinética de las proteínas quinasas que muestran autophosphorylation [27]. El Autocatálisis permisos sostenido oscilaciones en torno a un nonequilibrium el estado de equilibrio inestable, siempre y cuando lo suficientemente ATP está presente para conducir la fosforilación autocatalítico (véase la figura 2], que mantiene el sistema de medida de equilibrio termodinámico [28]. En el modelo, esto es representado por el tratamiento de procesos como componente irreversible. Sin embargo, en ausencia del paso autocatalítico, sostenido oscilaciones no parece posible, pero las oscilaciones de amortiguamiento puede observarse en el enfoque a un nonoscillatory el estado de equilibrio [29].
El in vitro KaiC oscilador se basa en la Kaia / KaiB asistida por fosforilación / dephosphorylation de KaiC constante a los niveles de proteína. Por lo tanto, a diferencia de los osciladores circadianos basada en la transcripción y la traducción [1], reacciones de degradación no desempeñan ningún papel significativo en la in vitro KaiC oscilador.
A pesar de que el paso autocatalítico en la figura 1 se representa como la termolecular proceso R3, hacemos hincapié en que este paso puede ser fácilmente dividida en una serie de reacciones consecutivas bimolecular (véase más adelante) y mediante la inclusión explícita de multímeros formas de Kaia, KaiB, y KaiC. A pesar de que estas adiciones conducir a una mejor descripción cuantitativa de los datos experimentales, las características dinámicas del bucle autocatalítico están bien representados por el modelo en la Figura 1 en que nos centramos aquí.
La mayoría de los modelos de la tasa constante de los valores no se conocen, aparte de primer orden KaiC fosforilación y dephosphorylation constantes (k 2 y k 7), que se han estimado [11, 12] a estar en el rango de 10 -3 s -1 a 10 -4 S -1 (3,6 h -1 a 0,36 h -1).
Una comparación directa del modelo con los experimentos [12] se muestra en la Figura 3, en la que constantes de velocidad se han utilizado para obtener las oscilaciones cerca de la observada experimental y amplitud a los observados experimentalmente fosforilación y dephosphorylation constantes [11, 12]. Una de las características que observamos es que para un determinado conjunto de constantes de velocidad se producen oscilaciones en una gama relativamente limitada de concentraciones iniciales, ilustrado por el análisis de bifurcación se muestra en la Figura 4 bis y 4 B. El modelo también predice la ocurrencia de bistability, por ejemplo, cuando la constante de velocidad de proceso se reduce R6 (Figura 4 C). En tal estado biestable, pequeñas perturbaciones pueden conducir el sistema de un estado de equilibrio estable a otro y viceversa, el cruce de dos umbrales (Figura 4 D). Sobre la base de esta cifra, parece que los cambios sutiles en sólo uno o dos pasos pueden convertir un biestable en un sistema de auto-sostenido oscilador, y especular que tal conversión puede haber ocurrido durante la evolución temprana de uno o más relojes circadianos.
Compensación de temperatura es una propiedad esencial de los ritmos circadianos. En 1957, Hastings y Sweeney [30] sugiere que la temperatura compensada osciladores contener las reacciones que tienen efectos opuestos en el período P. Un análisis cinético de compensación de temperatura mostraron [31] que el Hastings y Sweeney principio de oponerse a las reacciones pueden ser formulados en términos de teoría del control metabólico [32], es decir, compensación de temperatura se produce a nivel local (dentro de un determinado intervalo de temperatura), siempre que la energía de activación (S i) suma ponderada de los coeficientes de control C i = lnP lnP ∂ / ∂ lnk i se convierte en cero, y la siguiente ecuación de equilibrio puede ser escrito:
Porque Σ i C i = -1 [32], y la activación energías son positivas, compensación de temperatura que requiere uno o varios de los coeficientes de control tienen que ser positivos. El análisis de sensibilidad muestra que para las constantes de velocidad indicadas en la figura 2, la C i 's tienen valores negativos, pero sólo proceso R4 tiene un coeficiente positivo de control sobre todo el espacio de parámetros para los que se observan oscilaciones (Figura 5 A-5 D), lo que permite compensación de temperatura (Figura 5 E). Debido a que el C i 's no son ciertas constantes (de los cuales dependen las demás constantes de velocidad y temperatura), Ecuación 1 es válido sólo aproximadamente dentro de un determinado intervalo de temperatura, que es de importancia fisiológica para el organismo. A pesar de que muchas combinaciones de energía de activación es posible a satisfacer la ecuación 1, la selección natural una temperatura de compensación establecido al parecer se produjo durante la evolución. Utilizando el tipo de valores constantes para el oscilador se muestra en la Figura 2, el modelo no sólo puede mostrar los valores de amplitud que están cerca de observaciones experimentales, sino que también muestra un estrecho acuerdo entre calculados y observados experimentalmente el comportamiento de la temperatura del período.
Varios KaiC cepas mutantes tienen longitudes que van período de 17 h a 28 h [12]. Una posible explicación de los diferentes longitudes período cambiado y amplitudes en el fosforilados KaiC (P-KaiC) ratio (suma de P-KaiC en relación con el total KaiC) en estos mutantes parece estar relacionado con la estabilidad de KaiABC completamente fosforilados (KaiABC * ), El único complejo ternario formado en el sistema (proceso R4). A largo plazo mutantes, el ternario complejo se prevé que se formen más rápidamente y / o ser más estables (en comparación con el tipo salvaje), lo que da lugar a oscilaciones con mayores amplitudes en la categoría P-KaiC ratio. Esto es en contraste con simulado a corto plazo mutantes, en la que KaiABC * no es tan fácil formado y / o es menos estable que en las de tipo salvaje (Figura 5 F).
Porque termolecular procesos como reacción R3 parece ser poco probable, hemos probado una versión ampliada del modelo de sustitución de R3 proceso de dos mandatos consecutivos bimolecular reacciones conducen a la formación de autocatalítico Kaia 2 C * 6 (Figura 6]. Además, incluimos en el modelo de la formación de dímeros Kaia [21, 33] y KaiB tetramers [34], así como KaiC hexamers [21, 35]. A pesar de su mayor complejidad, la ampliación del modelo de muestra el comportamiento oscilatorio (Figura 6 y B 6 C) similar al modelo básico.
Recientemente, Emberly y Wingreen sugerido un modelo de reloj de arena [36] para el KaiC oscilador basado en un conjunto de ecuaciones no lineales tipo, la predicción de un intercambio entre KaiC hexamers durante el día y la formación de agrupaciones KaiC hexamer durante la noche. En contraste con el modelo autocatalítico que aquí se presenta, las oscilaciones en el modelo de reloj de arena se producen durante una amplia gama de parámetros y son independientes de las condiciones iniciales [36].
Nuestro modelo hace al menos tres específicas, las predicciones comprobables que no se desprende de la bioquímica en solitario. A pesar de que estas predicciones están implícitos en este documento, resumimos aquí explícitamente: (1) Las diferentes concentraciones iniciales de las proteínas Kai debería conducir a un espectro de respuestas de la pérdida de la periodicidad de cambio real en el período de duración. Esta predicción, sobre todo la última parte, no es evidente de la bioquímica. (2) Hemos simulado el comportamiento de un mutante KaiC. Estimamos que este mutante es KaiC específicamente alterado en su capacidad para formar un KaiABC * ternario complejo, y esto debería provocar un previsible cambio en la amplitud de oscilación. (3) Por último, proponemos que el principal período de contingentes parámetro de compensación de temperatura de reacción es R4. Nuestro modelo predice que si queremos introducir un antagonista de KaiB vinculante para KaiAC * (por ejemplo, la sobreexpresión de KaiAC * vinculante dominio de KaiB), hay que ver, junto con una disminución en el período de duración (debido a la reducción de la concentración libre KaiB) , La temperatura-o en virtud de un exceso de compensación depende de si la energía de activación para el montaje del complejo ternario (E 4) es aumentado o disminuido, respectivamente.
A medida que más datos experimentales y la tasa constante de los valores KaiC in vitro oscilador aparece, los modelos más detallada se puede formular y probar. Sin embargo, la ventaja de "mínimos" modelos como el presentado aquí es que son de fácil aplicación y ampliable. Un ejemplo clásico es el modelo Oregonator de la Belousov-Zhabotinsky (BZ) reacción [13]. A pesar de este producto químico oscilador contiene sólo tres sustratos inicial en una solución ácida, la subyacente química es muy compleja. Sin embargo, el uso del modelo Oregonator, lo que reduce la compleja química en un período de tres variables modelo, fue capaz de predecir y describir la mayor parte del sistema asombroso comportamientos incluidos excitabilidad, bistability, y el caos [13, 14]. A pesar de los bucles no son comunes los mecanismos de control metabólico, nuestro modelo sugiere que el in vitro la fosforilación KaiC ritmo circadiano es un oscilador que se ve impulsado por Autocatálisis. En ella, vemos una nueva relación entre la dinámica no lineal químicas y la cronobiología.