Geochemical Transactions, 2006; 7: 3-3 (más artículos en esta revista)

Pirita inducida por el radical hidroxilo formación y sus efectos sobre los ácidos nucleicos

BioMed Central
A Corey Cohn (corey.cohn @ stonybrook.edu) [1], Steffen Mueller (smueller@ms.cc.sunysb.edu) [2], Eckard Wimmer (ewimmer@ms.cc.sunysb.edu) [2], Nicole Leifer (nicole.d.leifer @ verizon.net) [3], Steven Greenbaum (steve.greenbaum @ hunter.cuny.edu) [3], Daniel R Strongin (dstrongi@temple.edu) [4], Martin AA Schoonen (martin.schoonen @ stonybrook.edu) [1]
[1] Departamento de Geociencias, Universidad de Stony Brook, Stony Brook, NY 11794, EE.UU.
[2] Departamento de Genética Molecular y Microbiología, Universidad de Stony Brook, Stony Brook, NY 11794-2100, EE.UU.
[3] Departamento de Física, Hunter College, Nueva York, NY 10021, EE.UU.
[4] Departamento de Química, Beury Salón 201, 1901 N. 13 Street, Temple University, Filadelfia, PA 19122, EE.UU.
[5] Center for Environmental Science Molecular, Universidad de Stony Brook, Stony Brook, Stony Brook, NY 11794-2100, EE.UU.

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Resumen
Fondo

Pirita, el metal más abundante de sulfuros en la Tierra, es conocido en forma espontánea el peróxido de hidrógeno cuando son expuestos al agua. En este estudio la hipótesis de que la pirita inducida por el peróxido de hidrógeno se transforma a los radicales hidroxilo es la prueba.

Resultados

Mediante una combinación de resonancia spin electrónico (ESR) spin-técnicas de captura y la participación de los basureros reacciones de ácidos nucleicos, la formación de radicales hidroxilo en pirita / suspensiones acuosas se demuestra. La adición de EDTA a pirita lodos inhibe el peróxido de hidrógeno al radical hidroxilo conversión, pero no inhibe la formación de peróxido de hidrógeno. Dada la estabilidad de quelación con EDTA, tanto ferrosos y hierro férrico, esto sugiere que la adición de la EDTA impide la transformación de quelación de hierro disuelto especies.

Conclusión

Aunque el mecanismo exacto o los mecanismos de peróxido de hidrógeno al radical hidroxilo conversión no puede resolverse sobre la base de los experimentos reportados en este estudio, es evidente que la pirita promueve la superficie de reacción. La formación de radicales hidroxilo es significativo porque reaccionar casi instantáneamente con la mayoría de las moléculas orgánicas. Esto sugiere que la presencia de pirita en naturales, ingeniería, o fisiológico sistemas acuosos puede inducir la transformación de una amplia gama de moléculas orgánicas. Este hallazgo tiene implicaciones para la pirita papel puede desempeñar en los ambientes acuáticos y plantea la cuestión de si la inhalación de polvo de pirita contribuye al desarrollo de enfermedades pulmonares.

Introducción

Estudios anteriores han demostrado que la pirita / generar suspensiones acuosas de peróxido de hidrógeno (H 2 O 2) en ausencia de oxígeno [1] y durante la oxidación de pirita [2]. Si bien la formación de H 2 O 2 se ha establecido en pirita suspensiones, su suerte no está claro. Borda y compañeros de trabajo informó de un único experimento en el que la formación de radicales hidroxilo se infiere sobre la base de la transformación de un radical scavenger [3]. Cohn y compañeros de trabajo especulan que el H 2 O 2 reacciona con el hierro ferroso para formar radicales hidroxilo (OH •) Fenton a través de un mecanismo de reacción [4]. Esta noción se basa en dos series de observaciones experimentales. En primer lugar, el ARN es fácilmente degradado por pirita / suspensiones acuosas [4]. En segundo lugar, el ARN es estable en presencia de H 2 O 2 [5], pero se degrada rápidamente en presencia de OH [6, 7]. Esta última observación es también coherente con los datos experimentales de correlación de partículas inducida OH formación y la carcinogénesis y el estrés oxidativo [8, 9]. Especies reactivas del oxígeno incluyen H 2 O 2 y en particular la reacción OH •. La extrema reactividad de OH ha sido implicado en varias enfermedades [10, 11] y la reactividad de OH hacia orgánicos ha sido explotado en la remediación de disolventes orgánicos [12, 13].

En esta contribución, la hipótesis de que la pirita generados H 2 O 2 va a reaccionar con el hierro ferroso en la superficie de pirita o disolución de pirita se prueba. Prueba para la formación de OH se presenta. Esta prueba se basa en una combinación de electrónica convencional espectroscópicas de resonancia spin (ESR) los métodos para detectar OH y la cinética de la degradación de los ácidos nucleicos (ADN y ARN) en pirita / suspensiones acuosas. Los resultados de este estudio podría explicar la reactividad de la pirita hacia otras biomoléculas, como la purina y formato de nucleósidos [14]. La formación espontánea de OH lodos de pirita puede también ser utilizado para desarrollar estrategias de remediación ambiental. En la última década, in situ de contaminantes orgánicos de oxidación técnicas basadas en una reacción entre el peróxido de hidrógeno y hierro que contiene óxidos han sido desarrollados [12, 15 - 18] y aplicada en el campo [19]. Este hallazgo sugiere que la pirita puede ser una alternativa eficaz a óxidos de hierro en estas aplicaciones.

Fondo

En esta sección las vías que pueden conducir a H 2 O 2 en la formación de lodos de pirita y la transformación de H 2 O 2 OH a través de la reacción de Fenton se resumen brevemente.

Formación de H 2 O 2 en pirita lodos

La presencia o ausencia de oxígeno molecular (O 2) dicta la reacción que las vías son posibles para la formación de H 2 O 2. En presencia de O 2, la formación de H 2 O 2 en lodos de pirita puede proceder no a través de dos vías exclusivas. Como pirita se encuentra disperso en el agua, el hierro ferroso se fácilmente ser puesta en libertad de solución. O 2 disuelto reacciona con disuelto Fe (II) a través del Haber-Weiss mecanismo de reacción y formas de H 2 O 2 (NCA 1 y 2) con superóxido (O 2 •) - como una especie intermedia.

Fe II (aq) + O 2 → Fe III (aq) + (O 2 •) - (1)

Fe II (aq) + (O 2 •) - + 2H + → Fe III (aq) + H 2 O 2 (2)

Este itinerario homogéneo se complementa con una reacción muy similar a la que O 2 se reduce la superficie de determinado Fe (II) (NCA 3 y 4). En el sistema de interés aquí, superficie determinada hierro ferroso puede ser Fe (II) que es parte de la pirita estructura cristalina o sorbed pirita en la superficie.

Fe II (pirita) + O 2 → Fe III (pirita) + (O 2 •) - (3)

Fe II (pirita) + (O 2 •) - + 2H + → Fe III (pirita) + H 2 O 2 (4)

Sobre la superficie de pirita esta secuencia de reacciones pueden ser efectivamente realizada por una sola de dos reacción de transferencia de electrones que participan dos Fe (II) de los átomos. Por el contrario, la reacción homogénea (NCA 1 y 2) ha de proceder como un dos-las reacciones de transferencia de electrones, ya que cada hierro ferroso sólo puede donar un electrón. Además, las especies de hierro férrico formado en pirita Mayo fácilmente ser reducido por la pirita sustrato. Esta reducción permitiría rápidamente el ciclo del hierro entre los dos estados de oxidación con el O 2 como aceptor de electrones terminal. Como resultado, la reacción en la superficie de pirita se espera que sea mucho más rápido. Esta idea es apoyada por los resultados de otros procesos de transferencia de electrones mediada por las superficies minerales [20].

Borda et al. [3] mostró que pirita también pueden generar H 2 O 2 en ausencia de oxígeno molecular. Sobre la base de experimentos con agua isotópico etiquetados, propusieron que la formación está impulsada por una reacción entre el agua y un déficit de azufre defecto en la superficie de pirita. En resumen, a granel está compuesto de pirita de hierro ferroso y disulfuro. De azufre en disulfuro de la fracción tiene un estado de oxidación-I. Sin embargo, la ciencia de superficies estudios demuestran que los déficit de azufre defectos son comunes en pirita [21 - 23]. El azufre asociados a estos defectos es de azufre con un estado de oxidación II [24 - 26]. Con el fin de mantener el cargo, esto requiere que algunos de los que nominalmente es de hierro presentes en el III + estado. X-ray espectroscopia de fotoelectrones (XPS) resultados presentados por Borda et al [3] muestran la presencia de algunos Fe (III) sobre la superficie de pirita. Estos Fe (III) de especies de superficie se reduce a Fe (II) de las especies a la exposición al agua. En esta reacción un electrón que se extrae de agua y un radical hidroxilo se forma. La combinación de dos radicales hidroxilo conduce a la formación de H 2 O 2. Por lo tanto, la vía general en ausencia de oxígeno pueden ser representados como:

Fe III (pirita) + H 2 O → Fe II (pirita) + OH + H + (5)

2 OH → H 2 O 2 (6)

El Fe (III) coordinados por grupos disulfuro de energía es muy desfavorable, mientras que la estructura con pirita de hierro en el estado divalente es energéticamente muy favorable. La reacción puede ser promovido por esta diferencia de la energía.

Reacción de Fenton

La reacción de Fenton se refiere a la transformación de H 2 O 2 OH a través de una reacción de la participación de hierro ferroso (eq. 7). La rápida reacción y cuantitativos convierte H 2 O 2 a OH [27]. Si hierro férrico formado en la reacción se reduce, entonces el hierro ferroso se recicla y actúa como catalizador. La reacción de Fenton se utiliza ampliamente en la comunidad la investigación biomédica para generar OH. Vinculante de un complejo de hierro ferroso en una sección particular de una secuencia de ácidos nucleicos, es posible inducir capítulo escisiones en lugares específicos [28 - 30]. Generación de OH a menudo se logra mediante la mezcla de una solución de sal ferrosa, por lo general sulfato ferroso amónico, con una diluir solución de peróxido de hidrógeno. Si un reductant, tales como el ácido ascórbico se añade, el Fe (III) pueden ser reciclados de nuevo a Fe (II) (eq. 8). El proceso general puede ser representada por las siguientes dos reacciones:

Fe II (aq) + H 2 O 2 OH + OH - + Fe III (aq) (7)

Fe III (aq) + Reductant → Fe II (aq) + + Reductant (8)

Si bien la reacción de Fenton, representada por las ecuaciones 7 y 8, es una reacción homogénea, la reacción también puede proceder de hierro ferroso cuando está presente como un sólido. Por ejemplo, Watts y compañeros de trabajo [15] han demostrado que la magnetita facilita la conversión de H 2 O 2 OH a través del mecanismo de reacción Fenton. Incluso Fe (III) y de óxidos (oxi) hidróxidos pueden facilitar la reacción aunque con menor eficacia que magnetita [15, 31]. Por Fe (III)-óxido de minerales, Fe (III) puede reducirse en presencia de H 2 O 2 a través de la siguiente reacción:

Fe III (óxido de mineral) + H 2 O 2 → Fe II (óxido de mineral) + (O 2 •) - + 2H + (9)

Por lo tanto, en este estudio proponemos que pirita puede promover la reacción de Fenton. Dada la rápida oxidación y la liberación de hierro en solución cuando pirita se encuentra disperso en el agua, la pirita puede promover la reacción de Fenton proporcionar hierro disuelto o a través de una superficie de reacción. Independientemente de si la reacción de Fenton se lleva a cabo en solución o en su superficie, pirita puede fácilmente reducir el hierro férrico. La reacción entre el hierro férrico disuelto y pirita ha sido estudiado ampliamente en el contexto de drenaje ácido de minas [32, 33]. Las propiedades de semiconductores de pirita [34] para permitir la rápida reducción del hierro férrico que está bien formado en la superficie o que adsorbe en su superficie.

Estrategia de investigación

Demostrar la presencia de especies de radicales, entre ellos OH, en cualquier sistema es un reto dado el hecho de que estas especies son muy corta duración. El más comúnmente usado la técnica de detección de minerales generados OH es la resonancia electrónica de spin [ESR, también conocido como la resonancia paramagnética electrónica (EPR)] con 5, 5-dimetil, 1-pyrroline N-óxido (DMPO) como una empresa spin-trampa . La vida útil de OH es del orden de unos nanosegundos, pero su reacción a través de otra con DMPO resultados en el único electrón está atrapado en DMPO para formar el DMPO-OH radical aducto. El aducto tiene una vida útil mucho más larga y puede ser detectado. El problema con el uso de ESR spin-captura con DMPO es su susceptibilidad a los artefactos. En el caso de estudios con hierro a los minerales, es importante señalar que la presencia de hierro férrico puede inducir la formación de un DMPO-OH aducto en la ausencia OH [35]. Sin embargo, hay un protocolo estándar para verificar la presencia de los radicales. En este protocolo otro reactivo, que actúa como un radical scavenger (por ejemplo, etanol), se añade a competir con DMPO de reacción con OH •. Cuando el etanol se utiliza como un cambio radical scavenger, su reacción con OH las formas α-hidroxietil radical que se suma a DMPO resultante en el DMPO-CH (CH 3) OH aducto [35]. A falta de OH, pero en presencia de hierro férrico (u otros nucleophiles), el etanol se ataque DMPO además de con su oxígeno y carbono no fracción. Esto da lugar a la creación de un DMPO-OCH 2 CH 3 aducto [35]. El DMPO-CH (CH 3) y DMPO OH-OCH 2 CH 3 aductos tienen diferentes espectros de ESR. Por lo tanto, en este estudio se llevó a cabo una serie de empresas spin-captura experimentos para demostrar concluyentemente la formación de OH lodos de pirita.

Mientras que las spin-ESR captura es el método estándar para demostrar la formación de radicales especies, es difícil de llevar a cabo spin-trampa experimentos bajo condiciones estrictamente anaeróbicas debido al tamaño del instrumento. Por otra parte, la técnica proporciona una indicación del tipo de radicales (s) actual y la aproximación de las concentraciones, pero la técnica no se presta fácilmente para comparar un conjunto de minerales o condiciones de reacción.

En este estudio, hemos utilizado varios métodos que se basan en la interacción de OH con los ácidos nucleicos para complementar las spin-experimentos de captura. Los minerales que inducen la formación de OH Se ha demostrado que causa la rotura en el capítulo de ADN [9, 36], que es de interés en genotoxicology (para revisión ver [36]]. En estudios anteriores, hemos empleado a corto filamento de ARN de levadura como una sonda para minerales generados OH [37]. OH preferentemente los ataques desoxirribosa en fracciones de ADN o ARN capítulos. La consiguiente reducción de los capítulos pueden ser detectados utilizando distintas técnicas, véase el método de la sección a continuación. En este estudio, hemos utilizado diversos procedimientos experimentales para detectar la línea de acortar y ARN o ADN expuestos a pirita lodos. Los experimentos con levadura RNA se realizaron para evaluar si la pirita reactividad hacia los ácidos nucleicos se limita a una única ráfaga a la exposición a una solución acuosa. Levadura RNA fue expuesto a pirita y después de más de 98% de la ARN fue inadvertida, una nueva solución de ARN se añadió a la pirita. Los experimentos con RNA ribosomal y el ADN se realizaron para evaluar su stabilities en presencia de pirita en función del tiempo y en función de la superficie total de pirita, respectivamente.

Control de experimentos con RNA expuestos a la disolución de hierro ferroso se realizaron para evaluar la importancia de los mecanismos de participación de hierro disuelto frente a los mecanismos de participación de la pirita superficie. En estos experimentos, ferrosos y las concentraciones de hierro férrico se midieron al inicio y al final de los experimentos con RNA. En un experimento, el EDTA se añadió a un experimento con la disolución de hierro ferroso. Este experimento se llevó a cabo para evaluar el papel de EDTA en la tasa de degradación del ARN. Para proporcionar la base para una comparación con la tasa de degradación por la presencia de pirita, las concentraciones de hierro disuelto en un experimento donde el ARN se añade a una pirita suspensión también se midió al inicio y final del experimento. Estos experimentos control se realizaron en presencia de oxígeno molecular.

Materiales y métodos
Pirita preparación de la muestra

Todos los experimentos se realizaron a temperatura ambiente (25 ± 2 ° C) con pirita natural (Huanzala, Perú) obtenidos a partir de los distritos. Todos los pirita utilizados en este estudio fue aplastado al mismo tiempo. Después de la molienda se lava con ácido para eliminar los óxidos de superficie utilizando un protocolo descrito en trabajos anteriores [4]. El tamaño fracción utilizada en estos experimentos fue de entre 10 a 90 μ m con un período de cinco punto N 2 adsorción BET superficie de aproximadamente 1,25 m 2 / g. Esta apuesta superficie es una aproximación debido a las variaciones inherentes a baja superficie mediciones [38]. Anaerobios experimentos se realizaron en una caja de guantes (Coy Laboratorio Productos) Pd con catalizador y de O 2 metros en presencia de nitrógeno / hidrógeno (95% / 5%) de gas. La concentración de oxígeno molecular en el N 2-purgado soluciones se determinó utilizando un polarographic sonda de O 2 (Orion).

Peróxido de hidrógeno en la cuantificación

El H 2 O 2 técnica para la cuantificación de hierro que contienen las soluciones se describe en detalle en otra parte [39]. En resumen, H 2 O 2 oxida leucocitos de cristal violeta (LCV) (Spectrum) en presencia de la enzima peroxidasa de rábano (HRP tipo II) (Sigma) que forman un cristal violeta cación, que tiene un máximo de absorbancia en torno a 590 nm [40] . Curvas de calibración se utilizaron para compensar el pH, hierro ferroso, y EDTA. Las diferentes cantidades de pirita se mezcla con agua en la ausencia o presencia de 1 mM EDTA e inmediatamente filtrada (Millipore 0,45 μ m). Catalasa [Sigma (4 a 60) × 10 4 unidades / mg de hígado de bovino] selectiva degrada el H 2 O 2 y se utilizó para verificar que la oxidación LCV se debió exclusivamente a partir de H 2 O 2. Los reactivos se han añadido a la acuoso filtrado en el siguiente orden final con las concentraciones: 100 mM KH 2 P buffer de pH 4, 41 μ M LCV (disuelto con HCl), y 1 μ g HRP.

ESR spin-captura

La trampa de spin 5, 5-dimetil, 1-pyrroline N-óxido (DMPO) fue purificado con carbón activado (Fisher). Todos los spin trampa experimentos fueron realizados con un Bruker EMX ESR equipado con un Aqua-X líquido celular. Pirita muestras fueron expuestas a DMPO soluciones (por aproximadamente 15 segundos), inmediatamente se filtra, se inyecta en el líquido celular y de inmediato analizó a temperatura ambiente (25 ± 2 ° C) en presencia de O 2. El espectrómetro de configuración son los siguientes: campo magnetico de 3470 ± 100 g, horno de microondas de potencia de 20 mW, la modulación de frecuencia de 100 kHz y amplitud de 1 G, receptor ganancia de 2 × 10 5, constante de tiempo de 0,64 segundos, y tiempo de exploración 2 min 47 seg. Reactivos y final durante el análisis de las concentraciones: DMPO (Sigma) 100 mM, H 2 O 2 120 μ M, sulfato ferroso amónico 25 μ M, EtOH 30%, hierro (III) sulfato pentahidratado 100 μ M, pirita 25 mg en 2 mL de solución.

El ácido nucleico y cuantificación de visualización

Levadura de ARN (Spectrum) fue mezclado con agua, seguido por centrifugación (4 ° C, 4500 × g, 5 min) y filtración (0,45 μ m) para eliminar las impurezas. Los experimentos con pirita se realizaron en 50 mL de tubos de centrifugación. 10 g / L pirita se añadió a un 1,5 mg / L de ARN solución, agita y se centrifuga (4 ° C, 4500 × g, 5 min) antes de la toma de muestras. RNA se cuantificó mediante una sonda molecular diseñado específicamente para RNA (RiboGreen de Invitrogen). RiboGreen se añadió solución a las siguientes alícuotas de los fabricantes de protocolo. Fluorescencia mediciones se llevaron a cabo utilizando un instrumento Picofluor (Turner diseños; excitación: 475 ± 15 nm, emisión: 515 ± 10 nm). Con este protocolo es posible medir el ARN capítulos con menos de 100 bases [41]. Cuando la concentración inicial de ARN se redujo a menos del 98% (es decir, los fragmentos eran demasiado pequeñas para interactuar con la sonda), el ARN solución fue sustituida por una nueva solución. Para evitar toda exposición de los purines al aire, los viales se herméticamente cerrado en la guantera anaeróbica, y luego se centrifuga fuera de la guantera. Después de este paso, los viales fueron inmediatamente colocado de nuevo en la guantera, decanta el sobrenadante, y los nuevos N 2-ARN purgado solución añadió. Después de reemplazar la solución de ARN, el periódico de muestreo y análisis de protocolo se reanudó. Además de utilizar una sonda molecular para cuantificar el ARN, también se determinó la concentración de ARN usando la radiación UV-Vis. Longitud de onda de 240 exploraciones nm a 294 nm se realizaron en un espectrómetro DR4000 Hach. Bases de ácidos nucleicos tienen un máximo de absorbancia a 260 nm. Ferrosos hierro disuelto a partir de la pirita superficie absorbe la luz en esta región con más luz de absorción como la longitud de onda disminuye. Un fondo similar ocurre con la absorbancia de soluciones de ARN. Con el fin de simplificar la interpretación de los resultados, esta pendiente del fondo ha sido absorbancia restará de la totalidad de las curvas.

Para corroborar los estudios que utilizaron la sonda molecular del ARN o UV-Vis, que también llevó a cabo experimentos con humanos ribosomal RNA y ADN plásmido circular. Los experimentos con humanos ribosomal RNA se realizaron agitación de 60 g / L pirita y 100 mg / L humanos ribosomal RNA extraído de células HeLa (línea celular de carcinoma). Los experimentos fueron realizados en 2 mL de tubos de centrifugación. Después de la centrifugación y el periódico de muestreo, electroforesis en gel de agarosa se realizó en la fase acuosa. Con excepción de centrifugación y el análisis, el experimento se realizó en una caja de guantes anaeróbica. Utilizando el mismo protocolo, se realizó un experimento con ADN plásmido circular [5,5 kb de tamaño pCDNA3 (Invitrogen) propagadas por el E.coli DH5-alfa y purificado de HiSpeed plasmídico Maxi Kit (Qiagen)]. A diferencia del experimento con humanos ribosomal RNA, el experimento con ADN plásmido circular se realizó en presencia de oxígeno molecular disuelto.

Disuelto el análisis de hierro

Ferrosos y hierro férrico se cuantificarán mediante HACH UV-Vis utilizando métodos espectroscópicos 1, 10 phenanthroline y ferrozine, respectivamente. Todos los análisis se realizaron sobre muestras filtradas (0,45 μ m de tamaño de poro).

Resultados

Los resultados indican que en una suspensión acuosa, pirita induce la formación espontánea de H 2 O 2 y OH •. Los ácidos nucleicos añadido a pirita suspensiones se degradan rápidamente. Los experimentos con EDTA añadido a la pirita suspensiones demuestran que la adición de este ligando se estabiliza H 2 O 2 y OH impide la formación de ácido nucleico y la degradación.

Pirita inducida por la formación de peróxido de hidrógeno y radicales hidroxilo

Pirita / suspensiones acuosas espontáneamente generar H 2 O 2. En estos experimentos, pirita se mezcla con agua que contiene EDTA y filtrada de inmediato. Debido a la reacción del unchelated Fe (II) con H 2 O 2 o de reacción de quelados Fe (II) con H 2 O 2, aumentando el tiempo de reacción se reduce la concentración de H 2 O 2 (Tabla 1]. Como se observa en el Cuadro 1, el H 2 O 2 aumento de las concentraciones de partículas proporcional a la carga. Catalasa degrada enzimáticamente H 2 O 2 para formar O 2 y H 2 O sin la formación de radicales. Cuando catalasa se añade a la suspensión de pirita antes de su análisis, H 2 O 2 no se observa, lo cual es coherente con H 2 O 2 es el único LCV oxidante. Similares experimentos realizados en ausencia de O 2 no mostró detectable H 2 O 2 (el límite de detección para los LCV técnica es alrededor de 0,5 μ m, en estos momentos estamos trabajando en la elaboración de un protocolo que permitirá la detección de H 2 O 2 en los niveles de nanomolar). En presencia de O 2, H 2 O 2 sólo se detectó cuando el quelante del hierro, EDTA, se añade. En ausencia de EDTA, H 2 O 2 no se observa. La falta de H 2 O 2, cuando no es de hierro quelado con EDTA sugiere que la mayoría de H 2 O 2 formado por pirita suspensiones se transforman rápidamente a OH. Esta pérdida rápida mantiene el nivel de H 2 O 2 por debajo del límite de detección del método LCV. Una segunda serie de experimentos para evaluar la estabilidad de H 2 O 2 en presencia de hierro ferroso y hierro ferroso con EDTA se presenta en la mitad inferior del cuadro 1. Al 10 μ M Fe (II), se añadirá un 10 μ M H 2 O 2 solución, el H 2 O 2 se reduce a 4,2 μ M. Sin embargo, cuando el 10 mM EDTA, se añade, H 2 O 2 se estabiliza.

Para evaluar si pirita OH genera cuando se suspende en el agua, los experimentos se realizaron con ESR spin-captura en presencia de oxígeno molecular disuelto. OH reacciona con el spin-trampa DMPO que forman el DMPO-OH radical aducto, que muestra una cuatro líneas del espectro (Fig. 1A]. A falta de OH, el DMPO-OH aducto también puede ser formado a través de la interacción de los spin trampa con hierro férrico (B). En presencia de OH, el etanol reacciona con el OH para formar el DMPO-CH (CH 3) OH aducto (C). Si se añade etanol a una solución de DMPO y hierro férrico (es decir, no presente OH), el etanol se añade a DMPO resultante en el DMPO-OCH 2 CH 3 aducto (D). DMPO-OCH 2 CH 3 y DMPO-CH (CH 3) OH exhiben diferentes espectros (comparar C y D). Cuando DMPO está en la presencia de pirita, DMPO-OH se forma (E). Pirita lodos contienen cantidades de hierro férrico, por lo que un experimento con etanol es necesario. Con el etanol, dos conjuntos de picos resultado, uno de los DMPO-OH aducto y uno de los DMPO-CH (CH 3) OH aducto (F), lo que confirma la presencia de OH •. Si bien estos experimentos muestran claramente que genera pirita OH, en presencia de agua, no es posible determinar la concentración absoluta de los radicales mediante el protocolo presentado anteriormente.

Pirita de degradación de los ácidos nucleicos

La reactividad de pirita-OH generada hacia los ácidos nucleicos se evaluó en presencia y en ausencia de oxígeno molecular. La Figura 2 muestra la pirita de degradación de RNA de levadura en ausencia de oxígeno molecular. La pirita mantiene esta reactividad hacia el RNA, incluso después de la solución sobrenadante ARN es continuamente actualizado. Para investigar si además de un quelante del hierro afectará a la degradación del ARN, EDTA se añadió. En presencia de EDTA, el RNA se mantuvo estable, lo que indica que el hierro es necesario para la degradación del ARN-mecanismo. La fuente de hierro es la pirita de superficie, pero el mecanismo puede implicar la superficie determinada de hierro o de hierro disuelto. Los resultados han sido corroborados por los obtenidos con mucho mayor ARN (es decir, RNA ribosomal) y analizados mediante electroforesis en gel. Electroforesis en gel de ARN ribosomal humanos expuestos a la pirita muestra una disminución en el fragmento de ARN del tamaño y la cantidad lo largo del tiempo en ausencia de oxígeno disuelto (Fig. 3a]. Un similar de estabilización de ARN con EDTA (Fig. 3b] se ve aquí en comparación con el experimento con levadura RNA. Los experimentos se llevaron a cabo también para hacer frente a los efectos de la pirita en el ADN, pero con un tipo diferente de experimento. Aquí, el ADN fue expuesto a distintas cantidades de pirita en presencia de oxígeno molecular y se tomaron muestras de cuatro horas después de la incubación. Los resultados muestran una mayor degradación del ADN con el aumento de las cantidades de pirita (Fig. 4].

Colectivamente, los experimentos muestran que la presencia de pirita conduce a una disminución de ácido nucleico capítulo longitud y una pérdida de intensidad de fluorescencia. El destino de las bases del ácido nucleico, también fue investigado con la espectroscopía UV. Las muestras de la levadura RNA de muestras expuestas a la pirita se filtra para separar las partículas de pirita y la longitud de onda exploraciones han sido tomadas. Los datos muestran un continuo descenso en la absorbancia centrada en torno a 260 nm cuando el ARN se encuentra expuesta a pirita, que es coherente con una transformación de las bases que conduce a una pérdida de su absorptivity en esta longitud de onda (Fig. 5]. En principio, la disminución de absorbancia por sí mismo podría deberse a la simple extracción de RNA de solución de adsorción. Sin embargo, si bien simple sorción puede explicar la pérdida de intensidad de fluorescencia en los geles, no puede explicar el acortamiento de los capítulos observados en estos experimentos.

Control de experimentos

Los mecanismos por los cuales genera pirita OH, lo que conduce a la degradación del ARN, puede ser una combinación de solución reacciones [por ejemplo, Haber Weiss (NCA 1 y 2) y Fenton (eq. 7)] y de superficie mediada por reacciones (eq. 3 y 4). Los experimentos, en ausencia de pirita, se realizaron para determinar la tasa de degradación del ARN en función de disolverse la concentración de hierro ferroso en presencia y en ausencia de EDTA en presencia de oxígeno molecular (Fig. 6]. Por comparación, los resultados de un experimento con pirita También se incluyen en esta cifra. Las concentraciones de hierro en el inicio y el final de estos experimentos se resumen en la Tabla 2. A partir de estos experimentos, es evidente que el aumento de las concentraciones de solución de hierro ferroso dar lugar a mayores tasas de degradación del ARN. Sin embargo, la disolución de hierro ferroso en las concentraciones homogéneas de control de estos experimentos son significativamente mayores que los de la pirita experimento se muestra en la Figura 6, véase el cuadro 2. Disminuir las concentraciones de hierro en experimentos donde el hierro se añadió al principio del experimento, pero aumentan cuando pirita se añade a una solución de ARN. Estos cambios en las concentraciones de hierro disuelto se deben a la precipitación de hierro ferroso que se añadió al ARN y la disolución de hierro de la superficie de pirita, respectivamente. El experimento con ARN expuestos a hierro ferroso y EDTA no muestra la degradación del ARN.

Discusión

Los resultados de la ESR spin captura experimentos demuestran concluyentemente OH que se forma espontáneamente en lodos de pirita en presencia de oxígeno molecular. Experimentos complementarios con los ácidos nucleicos muestran una reducción rápida capítulo con la pérdida de absorbancia a 260 nm (Fig. 5], lo cual es indicativo de una reacción participación de las bases en los ácidos nucleicos. En trabajos anteriores [4, 39], nos mostró que la tasa de degradación del ARN y la formación de H 2 O 2 es proporcional a la superficie de carga pirita. Dado que los ácidos nucleicos son rápidamente descompuestos por OH pero estable en diluir H 2 O 2, los resultados indican que la pirita promueve la degradación de los ácidos nucleicos a través de un mecanismo que convierte el H 2 O 2 a OH. La exposición a la pirita conduce a la división de los capítulos de ácido nucleico a un tamaño que es en última instancia no detectables con RiboGreen (RNA de levadura experimentos Fig. 2] y demasiado pequeños para ser retenidos en los geles de agarosa (ARN ribosomal humanos, Fig. 3, y circular experimentos de ADN plásmido, Fig. 4].

El mecanismo para el H 2 O 2-OH conversión no está claro. El control de los experimentos presentados en la Figura 6 muestra claramente que la presencia de la pirita superficie promueve la degradación de los ácidos nucleicos y, por extensión, la formación de OH •. Experimentos con el hierro disuelto en concentraciones muy por encima de los lodos de pirita en mostrar un ritmo mucho más lento de la degradación del ARN. Esto sugiere que una reacción mediada por la pirita superficie promueve la degradación. El mecanismo por el cual la disolución de hierro ferroso se degrada el ARN puede deberse a Haber-Weiss Fenton y la química (NCA 1, 2 y 7). La conclusión de que EDTA inhibe la descomposición del ácido nucleico, pero no impide la formación de H 2 O 2, sugiere que el H 2 O 2-OH conversión se lleva a cabo principalmente en la solución. La justificación de esta noción es que EDTA forma complejos con fuerte hierro disuelto, que, con arreglo a las condiciones de estos experimentos, impide que la reacción de Fenton llevando a cabo (véase el experimento control con Fe (II) y EDTA en la Fig. 6]. La conclusión de que el H 2 O 2 está formado por las suspensiones de pirita en presencia de EDTA y el oxígeno molecular se opone a una fuerte interacción del ligando con la pirita superficie. Electroquímico estudios [42], así como modelo de cálculos muestran que la transferencia de electrones de la superficie de pirita adsorbido oxígeno molecular se lleva a cabo en los lugares de hierro en la superficie [43]. Si se EDTA para absorber firmemente en la superficie de pirita, el H 2 O 2 a través de la formación de reacciones 3 y 4 se espera que sean inhibidos. Por lo tanto, especular pirita que promueve la degradación de los ácidos nucleicos y, por extensión, la formación de OH mediante la formación de H 2 O 2 en su superficie que a su vez puede reaccionar con el hierro ferroso disuelto para formar OH.

Quelación con EDTA también puede impedir que el hierro de carácter vinculante con el ARN. Habida cuenta de que OH reacciona casi instantáneamente después de haber sido creada, se ha sugerido que la absorción de hierro a la línea de ácido nucleico es un requisito previo para su división [28, 29]. Esto se debe a que bajas concentraciones de OH formó en solución puede reaccionar antes de llegar a un filamento del RNA. Sin embargo, la reacción de hierro atados a la fosfato fracciones de RNA con H 2 O 2 puede causar una línea de corte en ese lugar. Quelante de hierro disuelto, este sitio-específico mecanismo puede ser inhibido.

A pesar de H 2 O 2 no se detecta en lodos de pirita en ausencia de oxígeno molecular, los experimentos con levadura de ARN, así como el ARN ribosomal humanos llevadas a cabo de una caja de guantes anaeróbica muestran la degradación del ácido nucleico. En trabajos anteriores hemos sugerido que una reacción entre el agua y los defectos en la superficie de pirita puede producir H 2 O 2. Una vez que el H 2 O 2 se produce a través de esta vía es probable que se convirtió al OH. Los niveles de H 2 O 2 formado a través de este defecto del mecanismo impulsado son mucho más bajos que en presencia de oxígeno molecular. El bajo estado de equilibrio de concentración de H 2 O 2 y las limitaciones del H 2 O 2-técnica de detección utilizado aquí puede explicar por qué H 2 O 2 no se detectó en ausencia de O 2. El resultado de los experimentos con levadura ARN en los que el ARN solución fue sustituido periódicamente indican que este mecanismo anaeróbico no es fácil agotado. Si el proceso se limita a defectos de superficie, cabría esperar que la degradación del ARN dejaría después de uno o dos ciclos de reemplazo de líquidos. Por el contrario, la reactividad se mantiene durante tantos como cinco ciclos (Figura 2], aunque la tasa de la reacción disminuye. Se postula que la realización de semi-propiedades de pirita permitir defectos dentro de la mayor parte de los cristales de pirita con eficacia a migrar a la superficie (nota de que un hierro férrico en la pirita estructura electrónica es equivalente a un agujero de electrones [34], lo que puede migrar a través de la banda de conducción a la superficie [44]]. Los experimentos para evaluar esta hipótesis están en marcha. Además, se están realizando experimentos para evaluar cómo el envejecimiento de la pirita después de la molienda influirá en su reactividad.

Los radicales hidroxilo reaccionar no específicamente con la mayoría de las moléculas orgánicas. Por lo tanto, la formación de OH en lodos de pirita, como se demuestra en este estudio, puede conducir a pirita inducida por la transformación de moléculas orgánicas en cualquier entorno en el que pirita reacciona con el agua. Esto incluye entornos humanos encontrados en los pulmones donde pirita puede estar presente a la inhalación de las minas de carbón o el polvo. En otro estudio se presentará un informe sobre la formación de OH en el carbón como una función del contenido de pirita. La falta de reactividad específica de OH hacia las moléculas orgánicas también puede ser explotado para degradar los contaminantes orgánicos. In situ, Fenton basado en técnicas de oxidación química, en el que diluir H 2 O 2 se inyecta en los acuíferos, se han aplicado a degradar los disolventes orgánicos y otros compuestos orgánicos persistentes [12, 13, 15 - 17, 19, 31, 45]. En estos sistemas, hierro (oxi) hidróxidos o están proporcionando los óxidos de hierro para conducir la reacción de Fenton (eq. 7). Los resultados de este estudio sugieren que la pirita podría también ser eficaz como un catalizador mineral Fenton. Su práctica generalizada en los sedimentos reducido [46, 47] se abre la posibilidad de aplicar Fenton basado en técnicas de oxidación química a la reducción de sedimentos. Además, cabe la posibilidad de utilizar la inyección de aire para conducir in situ oxidación química cuando pirita está presente en el subsuelo. Por último, pirita - un producto de los residuos mineros - puede encontrar en el uso ex-situ de ingeniería Fenton basado en sistemas diseñados para tratar el agua contaminada con solventes orgánicos. Aunque el uso de pirita en estos sistemas puede causar un problema secundario de la producción de ácido, rehabilitación de ácido puede ser más sencilla que la degradación de un disolvente orgánico.

Conclusión

Sobre la base de una combinación de spin-ESR captura experimentos radicales y los basureros experimentos con los ácidos nucleicos, llegamos a la conclusión de que OH Se forma espontánea cuando pirita se encuentra disperso en el agua. La formación de OH, pero no la formación de H 2 O 2, se inhibe cuando se añade EDTA a la suspensión de pirita, lo que sugiere que el H 2 O 2-OH conversión se lleva a cabo en solución. Sin embargo, se necesita más investigación para resolver el mecanismo o mecanismos.

Conflicto de intereses

Los autores declaran que no tienen intereses en conflicto.

Material complementario
2 ficheros adicionales
UV-Vis absorbancia datos utilizados en
en formato de hoja de cálculo de Excel.
Archivo Adicional 1
ESR datos utilizando en la figura
1
en formato de hoja de cálculo de Excel.
Agradecimientos

Este trabajo fue financiado por el Departamento de Energía a través de subvenciones a DRS y MAS, Ciencias básicas de energía subvenciones DEFG029ER14644 y DEFG0296ER14633, respectivamente, y el Center for Environmental Molecular de la Ciencia (NSF CHE 0221934). CC reconoce el apoyo de un Consejo Nacional de Defensa de Ciencias e Ingeniería de Becas de Postgrado.