Genetic Vaccines and Therapy, 2006; 4: 4-4 (más artículos en esta revista)

Caracterización de la actividad ribonucleasa en la superficie de la piel

BioMed Central
Jochen Probst (jochen.probst @ student.uni-tuebingen.de) [1], Sonja Brechtel (SonjaBrechtel@compuserve.de) [2], Birgit Scheel (sp@curevac.de) [3], Ingmar Hoerr (ih @ curevac.de) [3], Günther Jung (gunther.jung @ uni-tuebingen.de) [4], Hans-Georg Rammensee (rammensee@uni-tuebingen.de) [1], Steve Pascolo (steve.pascolo @ uni - tuebingen.de) [1]
[1] Departamento de Inmunología, Instituto de Biología Celular, Universidad de Tübingen, Auf der Morgenstelle 15, 72076 Tübingen, Alemania
[2] Genética Microbiana de la Universidad de Tübingen, Auf der Morgenstelle 28, 72076 Tübingen, Alemania
[3] Cure Vac GmbH, Paul Ehrlich Str.15, 72076 Tübingen, Alemania
[4] Instituto de Química Orgánica, Universidad de Tübingen, Auf der Morgenstelle 18, 72076 Tübingen, Alemania

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Resumen

La rápida degradación de los ácidos ribonucleico (ARN) de la ubicuidad ribonucleases limita la eficacia de nuevas terapias basadas en las moléculas de ARN. Por lo tanto, nuestro objetivo fue caracterizar la actividad ribonucleasa natural en la piel y en el plasma sanguíneo es decir. en los lugares donde muchos fármacos en desarrollo se aplican. Sobre la superficie de la piel del Homo sapiens y Mus musculus observamos dominante pirimidina específicos de la actividad ribonucleasa. Esta actividad no se vea impedida por un tope a la estructura 5'-final del ARN mensajero (ARNm) y no es principalmente de una 5'-o 3'-exonuclease tipo. Por otra parte, la actividad ribonucleasa en la piel o en el plasma sanguíneo no es inhibida por modificaciones químicas introducidas a la 2'OH grupo de citidina uridina o residuos. Sin embargo, es inhibida por el inhibidor de ribonucleasa RNasin ® aunque no por el inhibidor de ribonucleasa SUPERase In ™. La aplicación de nuestros conocimientos en el campo de la ciencia médica puede resultar en una mejora de la eficacia de ARN a base de terapias que se encuentran actualmente en desarrollo.

Fondo

La presencia de ribonucleases en humanos y roedores superficies de piel se ha descrito hace más de 40 años. [1, 2] Posteriormente su distribución en las diferentes capas de la piel, fue estudiada por diferentes técnicas. [3 - 5] Sin embargo, la diversidad, la especificidad y la actividad de extracelular (es decir. secretada o procedentes de células muertas) ribonucleases presentes en la piel nunca fue investigado.

Sin embargo, se dispone de información sobre extracelular ribonucleases expresadas en los órganos internos humanos. [6] Estas enzimas pertenecen a la superfamilia de proteínas RNaseA. Sobre la base de estructurales, catalíticas y / o características biológicas que pueden clasificarse en dos grandes grupos [7]: el tipo pancreático (pt) y la falta de tipo pancreático (TNP) ribonucleases. Pt Humanos ribonucleases son similares a las especies bovina RNaseA páncreas. Son activos en poli (A) y doble hundidos RNA (dsRNA) y prefieren como sustrato de poli (C) a lo largo de poli (U). En contraste, NPT ribonucleases no operan en poli (A) ni en dsRNA sustratos y prefieren poli (U) en lugar de poli (C) como sustrato. En la actualidad, ocho distintos extracelular ribonucleases humanos se han descrito a nivel genético. Todos ellos son codificadas por los genes situados en el brazo largo del chromosome14. En el nivel de proteínas, ribonucleasa cinco diferentes actividades se han descrito para el plasma sanguíneo humano. Ribonucleases Estos varían en tamaño entre 14 y 31 kDa [8].

Extracelular ribonucleases son importantes en la formación de nuevos vasos sanguíneos y, por tanto, la progresión tumoral [9]. De hecho, Angiogenin que se identificó por primera vez el tumor derivado secretada angiogénicos es un factor extracelular de proteínas con un pt ribonucleolytic actividad. Esta nucleasa característica es necesaria pero no suficiente para angiogenin angiogénicos de la actividad. Sin embargo, los mecanismos de acción de angiogenin y las formas conexas de poteins (angiogenins) en la angiogénesis y, en particular, el papel de la actividad intrínseca RNasa, todavía no está claramente deciphered (para revisión ver Strydom et al. [10]]. Por otro extracelular ribonucleases se sugiere que desempeñan un papel en la prevención de la infección de microbios [11, 12] o ARN-virus. [13] También podrían controlar la hipótesis de la célula a célula comunicación mediada por la liberación y la absorción de ARN de las células vecinas. [14] Por último, no deseado puede bloquear la activación del sistema inmune de las células muertas que la liberación de ARN que, si no degradado, estimular células presentadoras de antígenos (APC) a través de TLR-3, TLR-7 o TLR -8. [15 - 18]

La caracterización de la actividad ribonucleasa extracelular se ha convertido en un atractivo nuevo tema en el período posterior a la era genómica, donde el desarrollo de terapias génicas seguro que se necesita para la transferencia de la investigación básica a la clínica. Plásmido de ADN recombinante o virus que se propusieron como vectores para la terapia génica enfoques están asociados a los posibles efectos secundarios y tienen una vida media incontrolada. [19, 20] Como alternativa, ARNm, un ácido nucleico con una vida media controlada, está siendo evaluado en pre-clínicos y ensayos clínicos. Varios mRNA basada en métodos de inmunización se han desarrollado (revisado en [21]): ARNm inyecta intradérmica [22 - 26], mRNA atrapados en liposomas y se inyecta por vía subcutánea o intravenosa [27, 28], mRNA cargado en partículas de oro y emitido por intradérmica Gene-Gun [29] y mRNA transfectadas in vitro en APC. [30 - 33]

La rápida degradación de mRNA de ribonucleases ubicua es una de las características de seguridad de mRNA a base de terapias. Este proceso garantiza que la información genética inyectada será completamente degradadas y limpiado del cuerpo en un corto período de tiempo. La inestabilidad, sin embargo, pone un claro límite a la eficacia. Por lo tanto, todos los ARNm basado en terapias se beneficiarán de la utilización de estabilizado mRNA que han mejorado la resistencia hacia ribonucleases que figuran en los fluidos fisiológicos, celulares y medios de cultivo en la superficie de la piel.

Con el fin de adquirir más conocimientos sobre las funciones fundamentales de ribonucleases extracelular, investigamos su diversidad, su actividad y su especificidad. Con el objetivo de mejorar mRNA basado en las terapias, también a prueba diferentes estrategias para estabilizar el ARNm en lo que respecta a la actividad ribonucleasa extracelular. Presentamos aquí la caracterización de la actividad ribonucleasa contenida en la superficie de la piel y en el plasma sanguíneo y los métodos para inhibir ellos. Nuestros resultados son relevantes para aplicaciones en el campo de mRNA a base de terapias.

Métodos
Animales

Ratones BALB / c fueron adquiridos de Charles River (Sulzfeld, Alemania). Los ratones no se mantendrá en especial en condiciones libres de patógenos. Todos los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con cambios institucionales y las directrices nacionales.

Preparación de ribonucleases

Homo sapiens superficie cutánea ribonucleases fueron repetidamente aislado de un individuo sano por orinarse en un área de ~ 10 cm 2 antes de limpiar la piel (esterilizada y posteriormente lavadas con agua y jabón) con 200-300 μ l de agua ~ 3 min. Durante este tiempo la gota de agua se pipeta varias veces hacia arriba y hacia abajo. Por Mus musculus, ribonucleases superficie cutánea se aislaron por incubando una oreja por la noche a 4 ° C por 200-300 μ l de agua. Contacto con el agua de la zona de corte fue evitado.

El contenido de proteínas de superficie de la piel los preparativos de ambos orígenes estaba por debajo del límite de detección de proteínas para la cuantificación de las mediciones fotométricas (Roti ®-Nanoquant, Carl Roth, Karlsruhe, Alemania). Hemos observado sólo poco variaciones en la actividad de ribonucleasa distintas preparaciones, como se indica en la degradación de los ensayos.

De sangre periférica de Homo sapiens y Mus musculus se recogió en tubos conteniendo EDTA para evitar la coagulación. El plasma sanguíneo fue separado por centrifugación de 6 min a 600 g y recogidos.

RibonucleaseA de Bos taurus páncreas fue adquirido de Roche (Mannheim, Alemania) y se disuelven en agua a 10 mg / ml.

Todos los preparativos se aliquoted inmediatamente y se almacenan a -80 ° C.

Ácidos ribonucleico

mRNA fue producido por transcripción in vitro con T7 RNA polimerasa (Opti-T7 mRNA kits, CureVac, Tübingen, Alemania). Modificado nucleótidos fueron adquiridos de TriLink (San Diego, EE.UU.). Todas las transcripciones contenía un poli (A) de cola (70 bases de largo) y si no que se indique un 5'-cap estructura. Esta estructura de la tapa fue presentado durante la transcripción in vitro: se cuadruplicó el exceso de síntesis N7-metil-guanosina-5'-trifosfato de guanosina 5'-en comparación con el GTP se utilizó para garantizar que aproximadamente el 80% de las moléculas de ARNm sintetizada se inició con un tope (mientras que el resto, aproximadamente el 20% de las moléculas de ARNm se inició con GTP). 18-sintéticas mer homopolímeros ARN fueron producidos por CureVac utilizando el método phosphoramidite. Poly (C) fue adquirido de Amersham (Freiburg, Alemania)

Zymogram

Después de desnaturalización a 95 ° C durante 2 min a 1 × Laemmli de tampón de carga, las muestras fueron cargadas en un SDS-PAGE, donde el 12, 5% de gel de apilamiento que figuran ~ 0, 6 mg / ml de poli (C). Posteriormente a la electroforesis (~ 2 h a 150 V), el gel fue lavado dos veces durante 10 minutos con un 25% (v / v) 2-propanol, 50 mM TrisHCl (pH7, 4) y 5 mM EDTA. El gel fue escaneada del documento la posición de la pre-teñidos marcador de peso molecular de proteínas (SeeBlue ® Plus2, Invitrogen, Karlsruhe, Alemania). A continuación, se volvió a lavar cuatro veces durante 10 minutos con 50 mM TrisHCl (pH7, 4) y 5 mM EDTA (lavado de amortiguación). Posteriormente, el gel se incuba a 37 ° C durante 17 h en el lavado de amortiguación complementado con 150 mM NaCl. Ribonucleasa actividad fue visualizado por tinción del gel con tampón de lavado complementado con 0, 2% (w / v) de azul de toluidina O (Sigma, Munich, Alemania) y destaining con el lavado de amortiguación. Para la documentación de gel de escaneado (SG-700, BioRad, Munich, Alemania).

Actividad ribonucleasa ensayo

Ribonucleasa actividad fue ensayada a 37 ° C en PBS (pH7, 2) de co-incubación de 0, 16 μ g / ml de mRNA o 166 nM de 18-mer homopolímeros y se indica la dilución final de los preparativos ribonucleasa.

Productos de reacción fueron analizados de acuerdo con los siguientes protocolos: Para ARNm, 6 μ l muestras fueron trasladadas al 6 de formaldehído μ l de tampón de carga que contengan bromuro de etidio (0, 01 mg / ml) y bomba de calor, la desnaturalización durante 5 min a 80 ° C. El ARNm de ampliar la digestión se analizó por electroforesis en agarosa formaldehído (FA) geles (1, 2% (w / v) de agarosa y 0, 65% (w / v) en formalina 1 × FA buffer).

Por RNA 18-mer homopolímeros 6 μ l muestras fueron trasladados a 6 μ l formamida, calentado por 5 min a 55 ° C, separados por urea-PAGE (42% (w / v) de urea y 20% (w / v) acrilamida (29 : 1) en 1 × TBE) y visualizado por epiillumination de los geles en la cima de una cromatografía en capa fina placa. [34]

Mancha del Norte

El contenido de geles FA fue borrado la noche a la mañana en Hybond-N + membranas (Amersham, Freiburg, Alemania) por la técnica de mancha capilar con 20 × cooperación Sur-Sur como la transferencia de amortiguación. Después de fijación (UV 1300 J / cm 2, más el respaldo de 80 ° C durante 2 h), las membranas fueron equilibrada con buffer de hibridación (5 × cooperación Sur-Sur, 5 × Denhardt y del 0, 5% (w / v) SDS) durante 30 min a 50 ° C antes de la [γ-32 P] marcada con 3'-sonda (5'-GCA AGG AGG GGA GGA GGG-3 ', MWG-Biotech, Ebersberg, Alemania) se añadió la incubación y se continuó durante la noche. Tras reiteradas lavado con la disminución de sal (CDC) las concentraciones, la mancha se vio expuesta a un fósforo de imágenes (PI) placa (Fujifilm, Düsseldorf, Alemania). Después de escanear la documentación de la placa de PI (BAS-1500, Fujifilm) la mancha fue despojado de ebullición en 0, 1% SDS (w / v) y luego hibridizado a la [γ-32 P] marcada con 5'-sonda (5 '-TGA GCG TTT ATT CTG AGC TGC TTC-3', Thermo, Ulm, Alemania). Algunos experimentos se llevaron a cabo también utilizando la primera sonda 5'-y, posteriormente, el 3'-sonda. Densitograms se calcularon con el software Tina2.09d (Raytest, Straubenhardt, Alemania).

Electroporación y FACS

Baby riñón de hamster (BHK21) las células fueron cultivadas a 80% de confluencia en un medio de cultivo celular (RPMI1640 complementado con 100 U / μ g / ml de penicilina y estreptomicina, 2 mM L-glutamina y 10% (v / v) FCS). Las células fueron cosechadas por la tripsina-EDTA, se lava una vez con un medio de cultivo celular y resuspendido en PBS. Electroporación de 1-2 × 10 6 células BHK en 4 mm cubetas se realizó a 250 V y 1050 μ F en 200 μ l de PBS con 10 μ g de mRNA. Después de transfección, las células fueron inmediatamente trasladados a un buque de cultivo celular y se dejan crecer durante 15 h. Ellos fueron cosechadas con tripsina-EDTA, fijado con un 1% (w / v) en PBS formol y analizado por un FACSCalibur (BD, Heidelberg, Alemania) citómetro de flujo y la CellQuest software Pro ™ (BD).

Inhibidores de ribonucleasa

La ribonucleasa inhibidores de RNasin ® y SUPERase In ™ se compraron de Promega (Mannheim, Alemania) y Ambion (Huntingdon, Reino Unido). Estos inhibidores se han añadido a la actividad ribonucleasa ensayos antes de la adición de ribonucleases.

Resultados
Diversidad de ribonucleases extracelular

Humanos y el ratón (BALB / c) extracelular piel ribonucleases (es decir, secretan o procedentes de células muertas) se obtuvieron mediante la aplicación de nucleasa libre de agua sobre la superficie de la piel. La ribonucleasa recuperado contaminados con soluciones aliquoted y almacenados a -80 ° C hasta su uso. Las proteínas contenidas en los preparativos fueron separados por SDS-PAGE en función de su tamaño. Un gel en la actividad enzimática de ensayo (zymogram) fue realizado posteriormente. La actividad perfil superficie de la piel ribonucleases se comparó con la que presenta el plasma sanguíneo. En tales zymograms (Fig. 1] se encontró que la mayor actividad ribonucleasa del ratón sobre la piel está mediada por una proteína de ~ 13 kDa de tamaño. La proteína responsable de la actividad ribonucleasa dominante en ratón plasma sanguíneo es ligeramente más pequeños (~ 12 kDa) que el observado en la piel. No o apenas detectables adicionales actividad ribonucleasa se encontró para las proteínas de mayor o menor tamaño. En contraste con los resultados obtenidos a través del ratón preparados, preparados humano contiene un espectro más amplio de actividades de ribonucleasa. La principal actividad de ribonucleasa en la superficie de la piel humana es muy similar en tamaño (~ 13 kDa) a la una sobre la superficie de la piel del ratón. Por otra parte, algunos sub-dominante ribonucleasa actividades se pueden observar durante siete mayores y un menor de proteínas. La actividad ribonucleasa dominante en el plasma sanguíneo humano se realiza por una proteína de ~ 26 kDa. Así, en los seres humanos, la actividad ribonucleasa dominante está mediada por una enzima diferente en la piel que en el plasma sanguíneo. Debido a que la mayoría actual de las terapias basadas en ARNm se entregan a través de la piel, nos centramos en el resto de nuestro estudio sobre la actividad ribonucleasa superficies de la piel.

La actividad de ribonucleasa en la superficie de la piel es independiente de la 5'-cap

Además de su función en las exportaciones de material nuclear y el inicio de traducción 5'-cap estructura es importante para la estabilidad de mRNA intracelular en células eucariotas. [35] Por lo tanto, hemos probado la capacidad de la 5'-cap para proteger el mRNA contra extracelular ribonucleases. Con este fin, hemos elaborado un límite y no un límite mRNA. Tope del mRNA se hizo añadiendo un 4 veces superiores a N7-metil-guanosina-5'-trifosfato de guanosina 5'-en comparación con el GTP a la transcripción in vitro de reacción. Así, aproximadamente el 80% de las moléculas de ARNm transcrito se inició con una gorra. Purificada transcripciones fueron incubadas con concentraciones crecientes de la superficie cutánea ribonucleases y el ARNm de la degradación fue analizada por electroforesis en gel. Los resultados se muestra en la Fig. 2 indican que un límite y no un límite ARNm se degradan con la misma cinética. Estos experimentos demuestran que el 5'-cap, no influye en la sensibilidad del ARNm para extracelular ribonucleases ni de ratón ni de la piel humana superficie preparativos. De este modo, la piel de superficie ribonucleases no contienen dominante 5'-exonuclease actividad o estas enzimas pueden reconocer igualmente un límite y no un límite mRNA.

La actividad de ribonucleasa en la superficie de la piel no es predominantemente de tipo el exonuclease

Ribonucleases son o bien endo-o exonucleases. Exonucleases tienen un papel preponderante para mRNA intracelular decadencia. [35, 36] Para determinar si la actividad nucleasa que figura en el extracelular ribonucleasa preparaciones hechas de piel es la superficie de la 5'-exo, 3'-endo o exo-nucleasa tipo, hemos realizado ensayos de actividad ribonucleasa seguido por el norte de Blots. En teoría, si el ARNm se degrada desde un extremo, no debe fragmentos de degradación de hibridación con la sonda específica para este fin. Sólo la plena longitud ARNm sería la etiqueta. Experimentalmente, usando ya sea 5'-o 3'-sondas de oligonucleótidos específicos, podríamos detectar un frotis de fragmentos de degradación (Fig. 3A y 3C]. De cuantificación de la degradación de los fragmentos, se observó un relativo aumento de la actividad (por ciento los valores en la Fig. 3B y 3D] de fragmentos de menos de 0, 5 kb (de larga duración 3, 5 kb) y un menor total vinculante para las sondas (curso de los gráficos en la Fig. 3B y 3D] al aumentar la duración de la digestión para ambas sondas. De este modo, el ribonucleases en la superficie de la piel o el ratón no son especialmente degradantes un extremo del ARN. En lugar de ello, la actividad se debe a igualmente activa 5'-y 3'-exonucleases y / o endonucleasas.

La actividad ribonucleasa a la superficie de la piel es específica de pirimidina

Para caracterizar mejor la actividad ribonucleasa superficie de la piel en los preparativos tratamos de determinar su especificidad por el sustrato mediante el uso de sintéticos 18-mer homopolímeros. Tras la incubación con la piel de superficie preparativos, los oligonucleótidos fueron separados de sus productos de degradación de urea-PAGE y visualizado por el epiillumination técnica. Como se muestra en la Fig. 4, poli (A) y poli (G) oligonucleótidos son muy resistentes a la degradación de la superficie de la piel ribonucleases. Por el contrario, poli (C) es fácilmente degradado por ratón y humanos extracelular ribonucleases. El plasma sanguíneo humano ribonucleases muestran un patrón similar de actividad como la piel humana superficie ribonucleases en lo que respecta a la degradación de poli (C) está preocupado pero son diferentes en lo que respecta a la degradación de poli (U) le preocupa: la piel superficial ribonucleases que no degraden poli (U ), Aunque el plasma sanguíneo ribonucleases hacer. Esta diferencia en la especificidad por el sustrato entre el plasma sanguíneo y la piel ribonucleases superficie se correlaciona con el zymogram resultados se muestra arriba (Fig. 1): la superficie de la piel dominante ribonucleasa actividad está mediada por una proteína diferente que el que la mediación dominante plasma sanguíneo actividad ribonucleasa. Para ratones, la actividad ribonucleasa en el plasma sanguíneo se debe principalmente específicas para U, mientras que la superficie de la piel actividad ribonucleasa es principalmente específica para C. Una vez más, esta diferencia se correlaciona con la diferencia de tamaño entre la proteína de mediación de la actividad ribonucleasa dominante en el plasma sanguíneo y la mediación la principal actividad de ribonucleasa en la piel de superficie (Fig. 1]. Para concluir, tanto para los ratones y los seres humanos, la ribonucleasa actividad en la superficie de la piel es específico para C. En cambio (en ratones) o además (en humanos), algunos actividad ribonucleasa específica de U figuran en el plasma sanguíneo.

2 'modificados ARNm no tienen una mayor resistencia hacia extracelular ribonucleases

Desde extracelular ribonucleases reconocer pyrimidines (Fig. 4], una evidente estrategia para mejorar la estabilidad del ARNm sería para producir mRNA que contiene 2'-modificados cytidines o uridines. Con este fin, las modificaciones químicas tienen que cumplir con dos criterios: (i) la incorporación de nucleótidos modificados por la RNA polimerasa en la transcripción in vitro y (ii) la traducción del mRNA modificado por ribosomas. En nuestras manos, sólo 4 de cada 10 nucleótidos a prueba (cytidines o uridines con 2'-amino-2'-deoxy-, 2'-ara-, 2'-azido-2'-deoxy-, 2'-fluoro-2 '-o deoxy-2'-O-metil azúcar fracciones, sustituciones en la posición R2 en la Fig. 5A] se incorporó con éxito en moléculas de ARNm utilizando ya sea T7 o SP6 RNA polimerasa: 2'-fluoro-2'deoxycytidine (datos no presentados) , Así como 2'-fluoro-, 2'-amino-2 'y 2'-azido-2'-desoxiuridina. Sin embargo, la calidad de la transcripción in vitro se ha visto afectado: una gran cantidad de abortivos (corto) mRNA puede verse en geles de agarosa, sobre todo cuando la transcripción de genes como a largo lacZ (3,5 kb, datos no presentados). Al utilizar dos nucleótidos modificados en la transcripción de reacción (2'-fluoro-2'deoxycytidine más 2'-fluoro-2'deoxyuridine, por ejemplo) no todo lo largo del mRNA producto se obtuvo. Sólo uno de los cuatro modificados ARNm se tradujo, aunque a bajo nivel en comparación con los naturales no modificados mRNA, después de transfección en células BHK21 (Amino U, Fig. 5B]. Por otra parte, ninguno de estos cuatro diferentes 2'-mRNA ha modificado una mayor resistencia hacia la superficie cutánea ribonucleases (Fig. 5C]. Por lo tanto, mRNA que contengan una de nucleótidos con una 2 'están mal modificación generada por RNA polimerasas, las plantillas son pobres para los ribosomas en vivo y no tienen mayor resistencia hacia extracelular ribonucleases.

Como alternativa a 2 'de nucleótidos modificados, azufre sustituciones en el grupo fosfato (R1, Fig. 5A], de pyrimidines podría mejorar la estabilidad del mRNA. Sin embargo, hemos obtenido resultados similares en cuanto a 2 'de nucleótidos modificados (datos no presentados): mala transcripción y no hacia una mayor estabilidad ribonucleases cuando se utilizan uno o una combinación de phosphorothioate nucleótidos trifosfatos.

RNasin ®, pero no SUPERase In ™ protege mRNA de la actividad ribonucleasa superficies de la piel

Como una alternativa directa a modificaciones químicas, mRNA puede ser protegida de la degradación de ribonucleasa-inhibidores. Uno de los bien conocidos-los inhibidores de ribonucleasa es pyrocarbonate dietílico (DEPC). DEPC es un agente alquilante reactiva y por lo tanto, muy tóxico. Por lo tanto, no puede utilizarse para la protección de mRNA en el contexto de mRNA a base de terapias. Otra clase de ribonucleasa ampliamente utilizado consiste en los inhibidores de las proteínas. Entre esta clase, RNasin ® es con mucho la mejor manera de describir. Esta proteína de 50 kDa fue purificada a partir de placenta humana. Se une con gran afinidad por ribonucleases de la familia RNaseA formando un complejo 1:1 [37]. Recientemente, una nueva proteína capaz de ribonucleasa-inhibición se caracteriza: En SUPERase ™ (Ambion). En SUPERase ™ se informó de que una gama más amplia de ribonucleasa-que inhiben la actividad de RNasin ®. Se compararon las dos proteínas de su capacidad para proteger in vitro contra el ARNm transcrito ribonucleases que figuran en la piel de superficie preparativos. Por lo tanto, la ribonucleasa-inhibidores se mezclaban con los transcritos in vitro mRNA sustrato antes de ser incubados con el ribonucleases. Sorprendentemente, sólo RNasin ® puede proteger de manera eficaz la actividad de ribonucleasa (Fig. 6]. En SUPERase ™ fue tan activo como RNasin ® para la inhibición de la purificado RNaseA de Bos taurus páncreas, pero ineficaz en la prevención de la degradación del ARNm de ribonucleases piel de la superficie celular del Homo sapiens y Mus musculus. Así pues, aunque SUPERase In ™ cuenta con un amplio espectro de inhibición ribonucleasa, que no está bien adaptado para bloquear la natural actividad ribonucleasa extracelular de la piel. Además, este experimento sugiere que ribonucleases que figuran en la preparación de la superficie de piel no son predominantemente de los de páncreas (RNaseA-like) tipo ya que en este caso, deberán ser igualmente inhibidas por RNasin ® y SUPERase In ™.

Discusión

Hacia la caracterización de la concertada la actividad ribonucleasa extracelular (es decir, secretan o procedentes de células muertas), que fueron evaluados por primera vez el número de proteínas con diferentes tamaños capaz de ribonucleasa actividad en la superficie de la piel o en el plasma sanguíneo (Fig. 1]. Zymograms indicó que la superficie de la piel contiene una actividad ribonucleasa dominante mediada por un ~ 13 kDa proteína. En los seres humanos, varios sub-dominante ribonucleasa actividades son realizadas por grandes y 7 pequeños una proteína. La actividad de ribonucleasa plasma sanguíneo es predominantemente mediada por una proteína de ~ 12 kDa en ratones y ~ 26 kDa en los seres humanos. Además caracterización de la ribonucleasa actividades en la superficie de la piel indicó que no son predominantemente de un tipo específico exonuclease (5'-o exo 3'-exo, Fig. 3], no se altera cuando el sustrato contiene una 5'-cap estructura (Fig. 2], son específicas para pyrimidines (Fig. 4] y puede ser inhibida por eficientemente RNasin ®, pero no SUPERase In ™ (Fig. 6].

Por otra parte, utilizando como sustratos homopolímeros, encontramos en todos los casos (ratón y humano, la piel superficial y el plasma sanguíneo) que la extracelular ribonucleases son específicos para pyrimidines y que C es su sustrato preferido (con excepción de ribonucleases ratón que figura en el plasma sanguíneo, donde U es preferido, Fig. 4]. Este resultado tiene un gran impacto en el desarrollo de RNA a base de drogas. Dado que una especificidad similar se observó para la ribonucleasa extrajeron grandes mamíferos de la epidermis [38, 39] podemos anticipar que la utilización de C-bajo ARN puede ser un método para aumentar la eficacia de las terapias de ARN emitió transcutaneously, intradérmica o subcutánea.

Hemos investigado si la preferencia de ribonucleases extracelular para pyrimidines fue explotado por los virus: un bajo y U C en su contenido transcriptome sería una ventaja para su mRNA vida media (sobre todo cuando el genoma es una molécula de ARN). La comparación de la media (± desviación estándar) C el contenido de ARNm humanos (26, 5 ± 4, 3%) a la media de contenido de C virus RNA (25, 1 ± 7, 3% de retro, 23, 1 ± 5, 4 % Para las más ssRNA y 19, 6 ± 2, 0% para menos ssRNA virus) no podemos detectar una clara tendencia a un menor contenido de C en ARN del virus. De este modo, los virus no parecen haber evolucionado con el fin de resistir extracelular ribonucleases.

En el contexto de mRNA a base de terapias, un posible método para proteger el ácido nucleico en contra de la degradación extracelular ribonucleases sería modificar pyrimidines, haciéndolas resistentes a ribonucleases. Por desgracia, en nuestras condiciones de reacción, la mayoría dispone de UTP o CTP 2 con una «modificación no se sustratos para la polimerización in vitro con T7 o SP6 polimerasa. 2'-fluoro sustituciones, se mostró a ser compatible con la polimerización in vitro [40] pero no para producir mRNA largo que contiene modificados y modificados U C juntos. Un solo 2'-nucleótidos modificados (U ó C) no puede estabilizar el ARNm lo suficiente como para resistir extracelular ribonucleases mientras que derogó la traducción en vivo (en células transfectadas, Fig. 5]. De este modo, la disposición 2'-modificados pyrimidines no permiten la generación de mRNA funcionales resistentes a la extracelular ribonucleases. Por otra parte (datos no presentados), ni el uso de citidina phosphorothioate modificados [41] (sulfuro de oxígeno a la sustitución de residuos de fosfato, R1 posición en la Fig. 5A], ni la adición de poli (C) a la ribonucleasa mezcla (como un competidor para la actividad ribonucleasa) hizo mejorar la estabilidad del mRNA.

En contraste, el inhibidor natural ribonucleasa RNasin ® es eficaz en la prevención de la degradación del ARNm de ribonucleases extracelular (Fig. 6]. RNasin ® fue también más eficaz que SUPERase In ™ para la inhibición de la ribonucleases presente en la superficie de la piel. Este resultado fue inesperado ya que SUPERase In ™ ha informado de un mayor espectro de ribonucleasa inhibición en comparación con RNasin ®. De hecho, SUPERase In ™ puede ser más eficiente que RNasin para inhibir ribonucleases en otras aplicaciones. En el caso de ARN de protección contra la piel de superficie ribonucleases, RNasin ® podría tener algunos desconocidos pertinentes ribonucleasa-especificidad.

Nuestros datos sugieren que el ARNm de las terapias utilizadas como drogas por vía debe ser entregado junto con RNasin ®. RNasin ® es una proteína humana libre, no se espera a tener efectos adversos: Se debe catabolized naturalmente en un tiempo relativamente corto, debería ser no tóxico para las células y, porque se trata de una conserva la libre proteína que se expresa en varios órganos [ 42], no debería desencadenar una respuesta inmunitaria.

Aunque nuestros estudios documento las actividades de ribonucleases extracelular presente en la piel, no proporcionan una explicación para el papel de tales moléculas. Algunos de los extracelular ribonucleases podrán ser presentados por el citosol de queratinocitos muertos que constituyen la superficie de la piel. Esto parece ser poco probable desde intracelular ribonucleases son principalmente de la exonuclease tipo [35] y hemos podido demostrar que este no es el caso de ribonucleases extracelular (Fig. 3]. Por otra parte, la caracterización a nivel del ADN de genes que codifican para secretada (definida por la presencia de un líder secuencia) ribonucleases demuestra que debe haber una necesidad en organismos superiores para tales actividades en su superficie. Las tres hipótesis de estos papeles ribonucleases en la piel (protección contra patógenos como extranjeros ARN-virus, prevención de la activación del sistema inmunológico de ARN liberado de las células muertas o inhibición de la célula a célula a través de interacciones liberación de captura de ARN de células vecinas) no son mutuamente excluyentes. El papel de ARN en la célula a célula comunicación mediada por la secreción y la recaptura de ARN de las células vecinas fue originalmente sugerido por Benner. [14] En consonancia con esta hipótesis se observó un menor contenido de la actividad ribonucleasa en rápida división de tejidos como los tumores ( datos no presentados y [43]].

Se necesitan estudios adicionales para demostrar si extracelular ribonucleases desempeñar realmente un papel en el control del crecimiento celular.

Conclusión

RNases presentes en la piel superficies reconocer pyrimidines y no son inhibidos por 5'cap estructura. En la medida de lo producido enzimáticamente ARN mensajero se refiere, la sustitución de nucleótidos naturales químicamente sustituidos por otros está limitada por la mala utilización de esos análogos de RNA polimerasas. Por otra parte, modificaciones químicas no RNasa disminución de sensibilidad y problemas de traducción. Para la protección exógenos mRNA de RNases y mantenimiento de un eficiente ARNm traducción, encontramos que el mejor método es mezclar no modificados, natural mRNA junto con la proteína RNAsin ®. Se trata de un método sencillo que puede proteger la extracelular terapéutico mRNA. Particularmente en el contexto de mRNA basada en la vacunación, tal transeuropeas de protección de los ARNm adicionales gracias a RNAsin ® pueden preverse como método seguro para mejorar la mRNA'as vida media, por lo que su penetración en las células y, por ende, la eficacia de la vacuna .

Autores de las contribuciones

JP realizado la mayor parte de los análisis y redactó el manuscrito

SB realiza los experimentos presentados en la figura 2 y 3

BS participó en la puesta en marcha de los experimentos

IH, GJ y HGR contribuido al desarrollo intelectual de esta investigación y para su apoyo financiero

SP concebido y supervisado este proyecto.

Agradecimientos

JP fue apoyada por la "Deutsche Forschungsgemeinschaft, DFG" (graduados universitarios 685) y JP.C. por un "Fortüne" donación de la Universidad de Tübingen. BS SP y cuentan con el apoyo de la Stiftung Fritz Bender.