Respiratory Research, 2006; 7(1): 93-93 (más artículos en esta revista)

De la vasoconstricción hipóxica parcial muscular intra-acinares arterias pulmonares en murino precisión cortar rebanadas de pulmón

BioMed Central
Renate Paddenberg (Renate.Paddenberg @ anatomie.med.uni-giessen.de) [1], Peter König (Peter.Koenig @ anatomie.med.uni-giessen.de) [1], Petra Faulhammer (Petra.Faulhammer @ anatomie . med.uni-giessen.de) [1], Anna Goldenberg (Anna.Goldenberg @ anatomie.med.uni-giessen.de) [1], Uwe Pfeil (Uwe.Pfeil @ anatomie.med.uni-giessen.de ) [1], Wolfgang Kummer (Wolfgang.Kummer @ anatomie.med.uni-giessen.de) [1]
[1] Universidad de Giessen Lung Center, Instituto de Anatomía y Biología Celular, Justus-Liebig-University, Giessen, Alemania

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Resumen
Fondo

Aguda hipoxia alveolar pulmonar provoca vasoconstricción (VPH) que sirve para que coincida con la perfusión pulmonar a la ventilación. Los mecanismos subyacentes no están totalmente resueltas aún. El principal segmento vascular que contribuyen a VPH, las intra-acinares arteria, se encuentra principalmente en esa parte del pulmón que no puede ser alcanzado de forma selectiva las técnicas disponibles actualmente, por ejemplo, estudios de hemodinámica aislados perfundidos pulmones, grabaciones de disecados los segmentos proximal arterial o análisis subpleural de los buques. El objetivo del presente estudio fue establecer un modelo que permite la investigación de VPH y sus mecanismos subyacentes en los pequeños intra-acinares arterias.

Métodos

Intra-acinares arterias de los pulmones del ratón se estudiaron a 200 μ m de espesor de precisión de corte rebanadas de pulmón (PCLS). La organización de la capa muscular de estos buques se caracterizó por la α-actina de músculo liso inmunohistoquímica. Características básicas de intra-acinares VPH se caracteriza y, a continuación, el impacto de especies de oxígeno reactivas (ROS) basureros, los inhibidores de la cadena respiratoria y ciclo de Krebs metabolitos se analizó.

Resultados

Intra-acinares arterias están equipadas con una espiral discontinua de α-actina de músculo liso de las células inmunorreactivas. Ellos exhiben una monofásica VPH (medio gaseados con 1% O 2) que comenzó a desaparecer después de 40 min y se perdió después de 80 min. Este VPH, pero no la vasoconstricción inducida por el tromboxano analógica U46619, fue bloqueado por nitro azul tetrazolio y diphenyleniodonium, indicando la participación de ROS y flavoproteins. La inhibición de los complejos mitocondriales II (3-nitropropionic ácido, thenoyltrifluoroacetone) y III (antimycin A) específicamente interferido con el VPH, mientras que el bloqueo del complejo IV (azida sódica) unspecifically inhibido tanto el VPH y U46619 inducida por constricción. Succinato bloqueado mientras que el VPH fumarato había menores efectos sobre la vasoconstricción.

Conclusión

Este estudio ha permitido establecer el primer modelo para la investigación de las características básicas de VPH directamente en los intercambios intracomunitarios, acinares pulmonar murino buques. Los datos son coherentes con una participación crítica de ROS, flavoproteins, y de los complejos mitocondriales II y III en el intra-acinares VPH. En vista de la falta de especificidad de cualquiera de los inhibidores clásicos utilizados en estos tipos de experimentos, validación está a la espera del uso de cepas adecuadas eliminatorias y siRNA injerencia, para que el actual modelo representa un enfoque adecuado.

Fondo

Aguda hipoxia alveolar pulmonar provoca vasoconstricción [1]. Esta vasoconstricción pulmonar hipóxica (VPH) dirige el flujo de sangre hacia áreas bien ventiladas del pulmón, y, por tanto, optimiza el intercambio gaseoso pulmonar de perfusión se pongan en venta para la ventilación. Este beneficioso principalmente reflejo puede convertirse en un mecanismo patogenético en condiciones de hipoxia alveolar crónica resultante en la hipertensión pulmonar se caracteriza por la remodelación de la vasculatura pulmonar y la hipertrofia ventricular derecha. Los estudios encaminados a dilucidar los mecanismos moleculares que subyacen aguda VPH identificados varios candidatos que pueden servir como el primer sensor de oxígeno celular (s). Estos incluyen componentes de la cadena respiratoria mitocondrial, la no generación de enzimas mitocondriales especies reactivas del oxígeno (ROS), y plasmalemmal canales de potasio [2]. Sin embargo, en parte en conflicto datos se han obtenido un consenso y no se ha llegado aún.

Sin embargo, es bien aceptado que, a lo largo del lecho vascular pulmonar, existe una marcada diversidad regional en la reactividad a la hipoxia [3, 4]. En la rata, por ejemplo, conducto arterial pulmonar anillos responder a la hipoxia después de una primera pequeña constricción con una relajación por debajo de línea de base, mientras que los anillos de los buques con menos de 300 μ m de diámetro exterior responder por una constricción monofásica [3]. Así, al menos una parte de la que se observa incoherencia de los datos entre los estudios es probable que sea debido a la investigación de los diferentes segmentos arteriales y al uso de distintos enfoques experimentales. Estudios hemodinámicos de los pulmones perfundidos [5 - 7] proporcionará información valiosa en la medida en que más estrechamente relacionadas con la situación clínica, pero la diferencia de las contribuciones de los distintos segmentos del árbol vascular pulmonar puede ser discriminado. Electrofisiológico y la fuerza de las grabaciones aisladas segmentos de arteria pulmonar o de miocitos disociarse de ellas están destinadas principalmente a llevarse a cabo en los pequeños vasos o resistencia. Los tamaños para este tipo de buques aislado de rata pulmón gama de <300 μ m de diámetro exterior [3] a 490 μ m de diámetro interior [8]. Las arterias de ese tamaño son plenamente muscular y suele acompañar a los conductores en las vías respiratorias adventitial su vaina, aunque algunas ramas supernumerarios que pasar directamente a la región alveolar inmediatamente adyacente a la bronchoarterial vaina llegar a este diámetro [9].

Micropuncture técnicas de los buques subpleural introducido por Bhattacharya y Staub [10], sin embargo, que se encuentra la más importante caída de la presión de perfusión para mucho más segmentos vasculares periféricas en muchas especies (para su revisión, ver [11]], con una especial sensibilidad a la hipoxia de la parte arterial de la microcirculación [12]. Visualización de rata subpleural de microvasos en tiempo real de escaneo láser confocal de luminiscencia microscopía localizados mayor sensibilidad a la hipoxia inmediato a pre-capilar (diámetro: 20-30 μ m), segmentos vasculares [4]. A lo largo del curso de arterias pulmonares más pequeños hacia los capilares alveolares, su primera capa de músculo se convierte en incompleta con células musculares lisas que se suele presentar como una espiral antes de que desaparecen y se sustituyen por una capa discontinua de células intermedias y, por último, los pericitos [13, 14]. Estos no muscular, parcialmente muscular y el más delgado muscular arterial segmentos se encuentran dentro de la acinus pulmonar, es decir, la región más allá de la terminal bronchiolus que representa la unidad básica ventilatorio [14]. En contraste con la resistencia de las arterias en el funcionamiento bronchoarterial vainas, estas intra-acinares arterias adventitial falta una capa y de inmediato se flanqueada por septos cuyos alvéolos se adjuntan a la lámina elástica vascular. Por lo tanto, son exquisitamente situado a controlar la tensión de oxígeno alveolar en particular que ventilatorio unidad que perfuse, y, por tanto, sus reacciones a la reducción de oxígeno son de especial interés. Anatómicamente, parcial arterias musculares se coloca entre los más pequeños buques de la resistencia que hasta ahora han sido disecados para los experimentos fisiológicos y la superficie de cerca de microvasos que pueden ser suficientemente alcanzados por subpleural micropuncture o escaneo láser confocal de luminiscencia. En consecuencia, sus respuestas a los cambios en la tensión de oxígeno no han sido aún investigado directamente.

Con el fin de salvar esa brecha que hemos adoptado un método que se introdujo originalmente para el análisis videomorphometric constricción de las vías respiratorias en la precisión de corte rebanadas de pulmón (PCLS) [15] y también es adecuado principalmente para controlar la reactividad vascular, ROS y NO la producción, y las propiedades electrofisiológicas de las células vasculares [16 - 19]. A la vista de una mayor extensión de esta técnica de ingeniería genética de cepas de ratón (cf. [19 - 21]] hemos realizado en este estudio murino PCLS. Desde la arquitectura general de la vasculatura pulmonar en esta especie es menos conocida que en la rata (cf. [13, 14, 22]] que nos llevó a cabo un morfológicos e inmunohistoquímicos estudio estudio sobre murino PCLS a caracterizar brevemente pre-e intra-acinares buques . Esto nos permitió identificar posteriormente intra-acinares arterias videomorphometric en el set-up. En un reciente estudio de PCLS murino pequeños (diámetro interior: 20-150 μ m) los barcos que las pruebas obtenidas por la hipoxia inducida por la generación de ROS y para una función esencial del complejo II de la cadena respiratoria en este proceso [18]. Siguiendo esta línea, hemos utilizado el nuevo enfoque desarrollado para evaluar los efectos de la inhibición de los complejos de la cadena respiratoria y la producción de ROS por VPH en murino intra-acinares arterias.

Métodos
Reactivos

9,11-Dideoxy-11 α, 9α-epoxy-methanoprostaglandin F 2 α (U46619; final conc.: 10 μ M), nitro azul tetrazolio (NBT; final conc.: 500 nM), diphenyleniodonium (DIP; final conc.: 10 μ M ), 3-nitropropionic ácido (3-NPA; final conc.: 5 mM), thenoyltrifluoroacetone (TTFA; final conc.: 50 μ m), antimycin A (AA; final conc.: 3 μ g / ml), azida sódica (NaN 3; final conc.: 1 mM), succinato, fumarato, y ácido málico (final conc. Cada uno de: 15 mM) fueron adquiridos de Sigma Aldrich (Deisenhofen, Alemania). Nitroprusiato de sodio (Nipruss; final conc.: 30 μ M) ha sido obtenido de Schwarz Pharma Deutschland GmbH (Monheim, Alemania).

Preparación de PCLS murino de los pulmones

PCLS se prepararon de acuerdo a protocolos descritos por Martin et al. [15] y Pfaff et al. [21]. En pocas palabras, 8-12 semanas de edad FvB ratones (Harlan-Winkelmann, Borchen, Alemania) fueron muertos por dislocación cervical y la sangre se ha retirado de la vasculatura pulmonar de perfusión in situ con 37 ° C-Ringer HEPES buffer (10 mM HEPES, 136,4 mM NaCl, 5,6 mM KCl, 1 mM MgCl 2, 2,2 mM CaCl 2, 11 mM de glucosa, pH 7.4) que contiene heparina (250 UI / ml) y penicilina / estreptomicina (1%) a través del ventrículo derecho. Posteriormente, las vías respiratorias se llenaron a través de la tráquea cannulated con 1,5% de bajo punto de fusión de agarosa (Bio-Rad Laboratories GmbH, Munich, Alemania) disueltos en Ringer-HEPES buffer. Pulmones y el corazón se retiraron en bloque y transferidos en hielo-frío-Ringer HEPES buffer para solidificar la agarosa. Los pulmones se redujeron en 200 μ m de espesor utilizando un rebanadas vibratome (VT1000S, Leica, Bensheim, Alemania). La agarosa se ha retirado de incubación en phenolred libre de medio esencial mínimo (MEM) continuamente gaseados con el 21% de O 2, 5% de CO 2, el 74% de N 2 por lo menos 2 horas a 37 ° C.

Inmunohistoquímica de PCLS

Para el examen de la morfología de los vasos pulmonares, 200 μ m de espesor PCLS se redujeron desde la izquierda del lóbulo de 4 animales, tal como se describe más arriba, a excepción de dos cambios en el protocolo. 1) Los pulmones se llenaron con 3% de bajo punto de fusión de agarosa para facilitar la reducción de los bronquios que estaban orientadas longitudinalmente a la dirección de corte. 2) Las secciones se redujeron en el plano frontal para visualizar mejor el curso de los vasos sanguíneos. Después de eliminar la agarosa, las secciones fueron fijadas durante 20 min en hielo-acetona fría y se lavan repetidamente en 0,1 M tampón fosfato. Las secciones fueron cubiertos durante 1 h con el bloqueo a medio (10% suero de caballo normal, 0,5% de Tween 20, un 0,5% de albúmina sérica bovina en PBS), seguida por la noche a la mañana de incubación con un anticuerpo monoclonal marcado con FITC anti-α-actina de músculo liso (α SMA) de anticuerpos (1:500, clon 1A4, Sigma Aldrich). Las secciones fueron lavadas en PBS y coverslipped en carbonato de búfer glicerol, pH 8,6. La morfología de las arterias y las venas se evaluó con un Zeiss Axioplan 2 microscopio epifluorescente (Jena, Alemania).

Para evaluar la morfología de la capa muscular de los buques que fueron objeto de investigación en un análisis videomorphometric, en 23 PCLS la posición del buque fue examinado documentado al final de un experimento. Contraste de fase imágenes fueron tomadas en diferentes aumentos y las rodajas fueron posteriormente procesadas para inmunohistoquímica, tal como se describe más arriba. Después de que el etiquetado, el buque fue identificado y sus α-SMA inmunoreactividad se evaluó utilizando ya sea un epifluorescente microscopio confocal o un microscopio de escaneo láser (TCS-SP2 AOBS, Leica).

Videomorphometric análisis de PCLS

Estudios sobre PCLS se realizaron en un flujo-a través de superfusion cámara (Hugo Sachs Elektronik, de marzo a Hugstetten, Alemania) lleno de phenolred libre de MEM. Las rebanadas se celebraron en el lugar en la sala con cuerdas de nylon que estuviesen conectados a un anillo de platino. Al comienzo de cada prueba la capacidad del buque al contrato en respuesta a la tromboxano U46619 analógica y se dilatan después de la aplicación de los donantes Nipruss NO se verificó. El flujo de las tasas de 0,7 ml / min durante el periodo de incubación con normoxic (21% O 2, 5% de CO 2, 74% N 2) o hipóxica medio (1% O 2, 5% de CO 2, 94% N 2) y 6 ml / min para el lavado de pasos. Inmediatamente antes de alimentar la normoxic hipóxica y gaseado MEM en la cámara de perfusión presión parcial de oxígeno (PO 2) se analizó en un analizador de gases en sangre (ABL510, Radiometer, Copenhague, Dinamarca). La aplicación de U46619 y Nipruss se realizó en el flujo de detención, el soporte de las demás sustancias se añadió a bajas tasas de flujo (0,7 ml / min). Superfusion La cámara se montó en un microscopio invertido (Leica), y las imágenes de los buques intrapulmonar con diámetros interiores entre 20 y 150 μ m se registraron utilizando una cámara CCD (Stemmer Imaging, Puchheim, Alemania). Fotografías fueron tomadas cada 2 minutos usando el software Optimas 6,5 (Stemmer Imaging). Los cambios de la zona vascular luminal fueron evaluados por el forro interior de las fronteras de la mano. El área del lumen vascular al inicio del experimento se estableció un máximo de 100%, y la vasoconstricción y la dilatación se expresaron como relativa disminución o aumento de esta zona.

Para una clara presentación gráfica de los efectos de diversas sustancias en la hipoxia y la siguiente U46619 inducida por la vasoconstricción pulmonar, el valor obtenido inmediatamente antes de la exposición a la reducción de oxígeno se estableció un máximo de 100%. La fase inicial de los experimentos que pusieron a prueba la viabilidad de los buques mediante la aplicación de U46619 y Nipruss no integrados en los gráficos a menos que explícitamente se indique lo contrario.

El análisis estadístico

Los datos se presentan como medios ± error estándar de la media (SEM), de 5-11 intra-acinares por condición de las arterias. Un solo buque por PCLS se analizó. PCLS para cada condición experimental se obtuvieron a partir de 3-5 ratones. El análisis estadístico se realizó mediante el SPSS 11.5.1. Las diferencias entre los grupos experimentales fueron analizados con el Test de Kruskal-Wallis, seguido por el de Mann-Whitney-test, con p ≤ 0,05 se consideró significativo, y p ≤ 0,01 altamente significativo.

Resultados
α-actina de músculo liso de inmunohistoquímica
Arterias pulmonares y su discriminación de las venas pulmonares

Las grandes arterias pulmonares corrió junto a los bronquios. Las células musculares lisas de estas arterias muestran una intensa α-SMA inmunoreactividad y construyó una capa circular (Fig. 2A, B]. Supernumerarios ramas que dejó la arteria principal sin un reparto de los bronquios pueden ser identificados (Fig. 2B]. Regular ramas arteriales entre proseguir con la misma organización de α-SMA inmunorreactiva células o muestras de una malla más grande con menos células como la principal rama o sin procedió α-SMA inmunorreactiva células (Fig. 2C, E, F]. Cuando terminal bronchioli continuado en los conductos alveolares, el intra-acinares arterias seguido el curso de los conductos alveolares con un continuo cambio en la organización de su capa muscular. El continuo circular hoja de α-SMA inmunorreactiva células (Fig. 2E] fue reorganizado en una densa malla que con frecuencia se organizó como una espiral (Figura 2A]. Los agujeros en la malla se convirtió en la más grande segmentos distales (Fig. 2A, C, D], pero, salvo en un breve segmento periférica de la arteria (Fig. 2E, F], la malla era aún más densamente organizada que la amplia malla de las venas pulmonares. En las arterias distales, tramos cortos con una orientación más paralelo de las células fueron observadas (Fig. 2C, E]. Este cambio de orientación fue acompañado por una marcada reducción de α-SMA inmunoreactividad. Más distalmente, ligeramente α-SMA inmunorreactiva células fueron identificadas sólo ocasionalmente arteriolas y siguió sin α-SMA inmunorreactiva células (Fig. 2G, G '].

Las grandes intrapulmonar venas pueden ser fácilmente identificados por su vaina de músculo cardíaco. La discriminación entre arterias y venas es fácil si las arterias poseen α-SMA inmunorreactiva células que están orientados a una densa malla. Venas, en cambio, no poseen una densa malla de α-SMA inmunorreactiva células pero que muestran una gran malla o solo las células ramificadas en su pared. Además, en contraste con las venas, arterias, con la excepción de supernumerarios ramas, siguen un bronchiolus o correr junto a los conductos alveolares. El único segmento arterial que puede ser difícil de discriminar de las venas sobre la base de la α-SMA inmunoreactividad es la pequeña parte que alberga una amplia malla de α-SMA inmunorreactiva células, o si no α-SMA inmunorreactiva en todas las células, si las partes más proximales de la arteria no están presentes en la sección. En videomorphometric experimentos en los cuales las células no pueden ser etiquetados de α-SMA anticuerpos específicos antes de la grabación de reactividad vascular, las secciones transversales de las arterias se distinguen de las venas de su gruesa túnica media y la estrecha vecindad que, por lo general cuatro, los conductos alveolares (Fig. . 3].

PCLS representan un modelo adecuado para el estudio de VPH en parte muscular intra-acinares arterias

Pequeños intra-acinares arterias situadas en los escudetes escudete de septos alveolares junto a los conductos alveolares se identificaron como se ha descrito anteriormente con contraste de fase óptica en 200 μ m de espesor PCLS. Videomorphometric análisis reveló que el tromboxano analógica U46619 indujeron una vasoconstricción inmediata de estos buques se indica por una reducción de la superficie luminal de alrededor de 40-60% de la observada al comienzo de los experimentos. Lave-out de la droga por medio con la perfusión y posterior adición de los donantes NO Nipruss vasodilatación inducida (Fig. 4]. Estos resultados demuestran que intra-acinares arterias mantener su capacidad de vasoconstricción y de dilatación en PCLS.

Para aclarar si estos buques siguen mostrando el VPH, PCLS fueron expuestos a hipoxia medio gaseados. El PO 2 de este medio (previamente gaseados durante aproximadamente 2 h con 1% O 2) se redujo a 40 mmHg. Hemos observado el comienzo inmediato de una, monofásica progresiva reducción de la superficie luminal que alcanzó su máximo después de unos 20-30 min (40% de reducción de la superficie luminal) y lentamente comenzó a desaparecer después de 40 min. En promedio, área luminal regresaron a los valores iniciales después de 80 min de exposición a la hipoxia, pero cada uno mantiene el VPH buques de hasta 120 min (Fig. 4]. Más largos períodos de hipoxia no fueron probados. No hay cambios en el área luminal se produjo en el control de incubaciones con normoxic gaseado medio (PO 2: 160 mmHg). Tras la incubación de la PCLS con U46619 dado lugar de nuevo en una marcada vasoconstricción, independientemente de que el PCLS habían sido previamente expuestos a normoxic a hipóxico o mediano (Fig. 4].

Después de videomorphometric análisis, PCLS fueron teñidos para α SMA como marcador de células musculares lisas. Con la ayuda de bajo aumento las imágenes tomadas al final del videomorphometric experimentos, los buques eran fácilmente re-identificados. Todos los buques de que las respuestas a la reducción de la tensión de oxígeno se han registrado antes fueron parcialmente muscular intra-acinares arterias con una relativamente delgada, discontinua capa de α-SMA inmunorreactiva células normalmente dispuestos en una espiral (Fig. 4G, H].

Intra-acinares VPH requiere ROS

PCLS fueron incubadas con hypoxically medio gaseados en ausencia o presencia de los ROS scavenger NBT (Fig. 5A]. En esta serie de experimentos de exposición a la hipoxia inducida sobre una reducción del 20% de la superficie luminal de intra-acinares arterias. En presencia de NBT, sin embargo, una relajación significativa (20-30% de aumento en área luminal) de intra-acinares arterias se observó en virtud de la hipoxia. VPH en el grupo control fue completamente NBT y mediada por vasorelaxation fue parcialmente revocada por la perfusión con normoxic medio, pero 20 minutos después de este normoxic perfusión todavía había una diferencia significativa entre ambos grupos. Aplicación de U46619 disminuido en ambos grupos las zonas luminal a alrededor del 60% de los observados inmediatamente antes de la exposición a la hipoxia. Estos resultados muestran que el VPH, en contraste con U46619 inducida por la vasoconstricción, requiere ROS.

Intra-acinares VPH requiere un flavoproteínas

Como se muestra en la Fig. 5B, precarga de PCLS flavoproteínas con el inhibidor del Departamento de Información Pública dio lugar a significativos de la vasoconstricción intra-acinares arterias bajo normoxic condiciones. Esta vasoconstricción invertido a la dilatación en virtud de la hipoxia, y el VPH no se observó. La capacidad para responder a U46619 hipóxico después de la exposición fue irreprochable por el Departamento de Información Pública (Fig. 5B].

Intra-acinares VPH exigencias funcionales complejos mitocondriales II

Normoxic precarga con 3-NPA, un inhibidor irreversible de complejos SDH subunidad II-A, inducida por una rápida y distinta vasoconstricción (Fig. 6A]. Cambiar a perfusión con gaseado medio hipóxico causa vasodilatación, y 35 minutos después de inicio de la perfusión hipóxica 3-NPA tratados buques difieren significativamente de los que están expuestos a la hipoxia por sí sola (p = 0,001). Estas diferencias fueron abolidos por el lavado de las secciones con mediana normoxically gaseados. Tras vasoconstrictor respuestas a U46619 no fueron significativamente diferentes entre ambos grupos (Fig. 6A].

Aplicación de otro inhibidor del complejo II, TTFA, claramente se desaceleró el VPH (Fig. 6B]. Diez minutos después del inicio de la exposición hipóxica, la TTFA tratada con los buques que aún no exhibió la vasoconstricción mientras que el área luminal del grupo control se redujo en un 20% (diferencia entre los grupos: p = 0,024). Posteriormente, el VPH se produjo en la TTFA grupo con una tendencia general hacia la disminución de la vasoconstricción en comparación con el control de los buques. La diferencia entre ambos grupos fue significativa al final de la exposición a la hipoxia (p = 0,04). Ambos grupos reaccionaron idéntica a la posterior aplicación de U46619 (Fig. 6B].

Succinato, el sustrato de succinato deshidrogenasa y el producto de fumarato reductasa actividad de complejo II, impide intra-acinares VPH

Para probar si el VPH podría ser acoplado a un cambio funcional del complejo II de succinato deshidrogenasa a fumarato reductasa que investigó los efectos de succinato y fumarato, el sustrato y producto, respectivamente, del succinato deshidrogenasa, y de malato, un precursor potencial metabólico en virtud de fumarato hipóxico condiciones (Fig. 7]. Succinato casi totalmente abolido el VPH. En presencia de succinato, el área luminal se redujo en sólo un 10% bajo condiciones de hipoxia mientras que una reducción de la superficie luminal en un 40% se observó en el grupo control hipóxica (Fig. 7A]. Tras la aplicación de U46619 vasoconstricción inducida por distintos en ambos grupos (reducción de la superficie luminal de alrededor del 60% en el grupo control y de alrededor del 50% en la succinato-grupo tratado). Dado que, en este conjunto de experimentos, después de la vasodilatación hipóxica era incompleta en el grupo sin tratamiento, se observaron diferencias significativas en la respuesta final a U46619 (tiempo el punto 66: p = 0,021; tiempo el punto 80: p = 0,038) cuando luminal zonas se estandarizaron a pre-hipóxico valores, pero no cuando se estandarizaron las respuestas a área luminal después de la post-hipóxico período de lavado.

Correspondientes experimentos con fumarato en lugar de succinato sólo reveló la debilidad de los efectos sobre el VPH. La respuesta a la hipoxia se demoró, pero llegó el mismo grado de vasoconstricción como el control sin tratar después de 30 min (Fig. 7B]. Fumarato no interferir con U46619 inducida por constricción.

Malato casi totalmente impedido el VPH, sino también disminuyó notablemente el U46619 respuesta inducida, con indicación de efectos generales de malato en intra-acinares vasoconstricción (Fig. 7C].

Intra-acinares VPH requiere funcional mitocondrial complejo III

Antimycin A, un inhibidor del complejo III, a causa vasodilatación pronunciada en lugar de constricción en hypoxically gaseado medio (Fig. 8A]. El área luminal de intra-acinares arterias aumentado hasta un 40% después de 30 minutos de exposición hipóxica. Lavado de la PCLS con normoxically gaseado medio durante 20 min parcialmente revertido esta dilatación, y la posterior reacción a U46619 fue irreprochable (Fig. 8A].

La inhibición del complejo IV generalmente afecta intra-acinares vasoconstricción

Administración del complejo IV inhibidor de NaN 3 abolido el VPH y, en su lugar, intra-acinares barcos expuestos ligera dilatación (Fig. 8B]. Vasoconstricción inducida por U46619 fue claramente disminuido por la aplicación de NaN 3 (reducción de la superficie luminal del 40% versus 77% en el grupo control, p = 0,011) (Fig. 8B].

Discusión
Intra-acinares pulmonar murino los buques y de sus constrictor respuesta a la hipoxia

Con respecto a las características estructurales generales que pueden ser evaluados a partir de α-SMA etiquetados PCLS, murino intrapulmonar arterias muestran una notable semejanza con informó que para la rata (véase el examen de [9]]. Estas similitudes incluyen casi rectangular ramificación de las arterias supernumerarios, y paso a paso de transición plenamente pequeñas arterias musculares en primer lugar a los segmentos en los que la capa muscular es incompleta con el músculo suele estar presente como una espiral, y, por último, no muscular segmentos. Juzgado de posición anatómica, el tamaño y el grosor de la pared, intra-acinares los buques que podrían identificarse en la vida PCLS murino. A pesar del hecho de que, por lo general, sólo fueron parcialmente muscular que mostró una larga duración monofásica constricción en respuesta a la hipoxia. En la rata, la parte muscular intra-acinares arterias contienen, además de los típicos músculo liso vascular células, las llamadas "intermedias" las células que se encuentran internas de la membrana elástica. Ellos se consideran como células contráctiles como así, y como precursores de células musculares lisas en condiciones de remodelado vascular [14, 22]. En lo inmediato precapillary, no muscular región, las células intermedias se sustituirán por los pericitos que también son interpretadas como contráctil del músculo liso precursores [23, 24]. Si bien los datos intermedios de las células en el pulmón murino se carece, los pericitos pulmonar han sido identificados y, al parecer, α-SMA negativo o mancha sólo débilmente en la madurez [25, 26]. Por lo tanto, las diferentes de VPH en parte muscular intra-arterial acinares segmentos, es decir, aquellas cuyos α-SMA immunolabelling, no sólo puede depender de α-SMA positivos células musculares lisas, sino también sobre otras células contráctiles como así.

La arteria pulmonar curvas de presión registrada de aislados perfundidos hipóxico murino pulmones alcanzar un pico tan pronto como después de 6 min, se bifásica y no volver a los niveles basales después de 3 h de ventilación, incluso cuando se conecta a normoxic condiciones [27 - 29]. En contraste, el VPH de intra-acinares arterias en PCLS desarrollado más lento, es monofásica, y se perdió totalmente después de 80 min, incluso por los continuos hipoxia. Una obvia diferencia importante entre estos experimental set-ups es la falta de cizalla de estrés que actúan sobre el endotelio en el PCLS modelo. En perfundidos buques, aguda VPH da lugar a un aumento en el estrés de cizalla-con lo que la inducción de mecanismos secundarios como el NO liberación [4, 5, 30]. Inclinar el estrés por sí solo, sin embargo, no se cuenta plenamente para la bifásica versus monofásicos diferencia en el VPH, ya que una respuesta bifásica también pueden ser registrados de los no aislados perfundidos arteria pulmonar anillos montado en un buque myograph (rata: [8]]. Sin embargo, este tipo de preparación difiere de PCLS en dos grandes aspectos que más allá de una especie de diferencia: En primer lugar, se registra la tensión isométrica en virtud de condiciones que los registros de estos últimos cambios métricas (área luminal) bajo condiciones isotónicas, en el supuesto de que la fuerza creada por el estiramiento elástico alveolar archivos adjuntos durante la vasoconstricción es insignificante cuando es el pulmón colapsado. En segundo lugar, la resistencia a los buques analizados por myography, a pesar de ser pequeñas, son todavía claramente situado aguas arriba a la intra-acinares buques controlados en PCLS. Por lo tanto, queda por determinar si una monofásica VPH es una característica exclusiva de intra-acinares buques o si es también una característica básica de otros segmentos de la vasculatura pulmonar cuando cizalla-estrés y otros eventos secundarios se eliminan.

ROS en intra-acinares VPH

En un estudio anterior de PCLS murinos expuestos a la hipoxia se observó una mayor producción de ROS en los pequeños (diámetro interior: 20-150 μ m) intrapulmonar arterias que requiere funcional complejo II de la cadena respiratoria mitocondrial y también fue sensible a bloqueo del complejo III [18] . Los datos actuales aportar pruebas de que estos hipoxia inducida por los acontecimientos están directamente vinculadas a la respuesta contráctil de intra-acinares buques. Prueba de hipoxia inducida por la producción de ROS pulmonar en los buques se ha proporcionado con anterioridad por varios otros enfoques (por ejemplo, [31, 32]], aunque también hay datos contradictorios (por ejemplo, [33]]. Esta controversia se debatió ampliamente en dos estudios recientes [34, 35], y es probable que al menos una parte de las inconsistencias entre los estudios se debe a la investigación de los diferentes segmentos arteriales y el uso de diferentes enfoques experimentales. Con respecto a los efectos de aplicarse ROS exógena, por ejemplo, H 2 O 2, en virtud de normoxia y de los basureros ROS bajo la hipoxia, hay menos diversidad informó: 1) H 2 O 2 limita la circulación pulmonar durante la normoxia [32], 2) la inhibición de la endógena H 2 O 2 scavenger, catalasa, aumenta el VPH [36], y 3) el ROS scavenger NBT previene el VPH en lugares aislados y perfundidos de conejo pulmones [37] y derogó completamente intra-acinares VPH en nuestros experimentos. Por otra parte, el Departamento de Información Pública, un amplio inhibidor de flavoproteínas que suprime la producción de ROS en muchos sistemas incluidos murino PCLS [18, 38], bloques de VPH en los pulmones perfundidos de conejo [6], la arteria pulmonar anillos de gatos [31], y en nuestro modelo murino PCLS. Por lo tanto, los datos actuales están en consonancia con la opinión de que aumentar la producción de ROS se requiere para el VPH de intra-acinares arterias.

Los complejos mitocondriales II y III en el intra-acinares VPH

El transporte de electrones mitocondrial cadena es considerado actualmente como el principal, aunque no necesariamente exclusiva, fuente de hipoxia inducida por la producción de ROS alterado [34, 35]. Se ha prestado especial atención al complejo III, que recibe los electrones de ubiquinol generado ya sea en complejo I II o complejas. La inhibición del complejo III suprime o atenúa el VPH en cada uno de los modelos investigados hasta ahora [7, 8, 32, 33], incluido nuestro actual estudio sobre intra-acinares buques en PCLS murino. Cierta incertidumbre, sin embargo, ha surgido en cuanto a la especificidad de este efecto de la hipoxia inducida por la vasoconstricción, ya que el complejo III inhibidor antimycin A también atenúa la vasoconstricción provocados por el tromboxano analógica U46619 en condiciones de bloquear la síntesis de NO en los aislados y perfundidos de conejo de pulmón [7 ]. En nuestro modelo murino intra-acinares arterias respondió a antimycin A con una inversión de VPH a una vasodilatación aunque U46619 inducida por la constricción fue irreprochable, argumentando para una función crítica de complejo III de VPH en este segmento vascular.

Los datos actuales también proporcionar pruebas de una función adicional de complejos II en intra-acinares VPH. Complejo II es un componente de ambos el ciclo de Krebs, aquí también denominado succinato deshidrogenasa (SDH), y el transporte de electrones mitocondrial cadena. Se compone de dos proteínas integrales de la membrana interna mitocondrial (SDH-C, SDH-D) que en conjunto la hemo proteína citocromo b 560, y dos partes periféricas expuestos a la matriz mitocondrial, SDH-A y SDH-B [39, 40]. El centro de catalizador para la conversión enzimática de succinato a fumarato se encuentra en la flavoproteínas SDH-A, y el flujo de electrones a lo largo de hierro-azufre grupos de SDH-B hacia SDH-C / D, por último, reducir ubiquinon a ubiquinol. Existen condiciones, sin embargo, en virtud del cual los electrones fluyen en dirección contraria para que este complejo actos, entonces, en forma de fumarato reductasa [39]. Esto ha sido demostrado directamente a las mitocondrias aisladas de las especies bovina y corazón para el corazón de rata en la anoxia o hipoxia severa [41, 42]. Recientemente hemos obtenido las pruebas para cambiar de catalizador para SDH fumarato reductasa en el curso de celulares adaptaciones a la hipoxia en las neuronas sensoriales de rata y ratón pequeños vasos pulmonares [18, 43]. Un SDH mutación provoca estrés oxidativo en los nematodos [44], y, en Escherichia coli, donde la oxidación de succinato y fumarato reducción se logra por dos estructuralmente diferentes enzimas, fumarato reductasa es extremadamente eficiente generador de ROS [45]. Por lo tanto, complejo II es esencial para la hipoxia inducida por la generación de ROS en la vasculatura pulmonar [18].

Por lo tanto, hemos presentado la hipótesis de que cambiar de catalizador complejo II de la fumarato reductasa con la consiguiente mayor generación de ROS es parte de la hipoxia de sensores y mecanismos de señalización en la vasculatura pulmonar. De acuerdo con este concepto, succinato, pero no fumarato, impidió el desarrollo de los intercambios intracomunitarios de acinares del VPH en nuestro presente PCLS experimentos, que puede explicarse si complejo II actúa como fumarato reductasa y se inhibe por el exceso de reacción de su producto, succinato. Hay que tener en cuenta, sin embargo, que succinato y fumarato también ejercer efectos adicionales. Por ejemplo, inhibe la succinato prolyl hydroxylases que, en una de oxígeno-dependientes manera, regular la estabilidad de hipoxia-inducible factor de transcripción [46], y succinato también pueden interferir con los receptores de neurotransmisores [47]. Bloqueo de VPH por el inhibidor irreversible de la enzimática centro de SDH-A, 3-PNA, apoyó el concepto de requisito de activos complejos II para intra-acinares constricción hipóxica. Del mismo modo, la inhibición de VPH fue alcanzado por el general flavoproteínas inhibidor del Departamento de Información Pública, que también actúa sobre SDH-A. Por otra parte, TTFA, inhibiendo complejo II de su ocupante ubiquinone sitios de unión [48], no es plenamente eficaz en la prevención intra-acinares VPH. Hay que tener en cuenta, sin embargo, que también TTFA objetivos extra-mitocondriales, como las enzimas esterasas [49] a fin de que en parte para contrarrestar los efectos podrían haber sido provocados.

Dentro de la cadena respiratoria, ROS se generan aguas arriba del complejo IV en cualquiera de los complejos I-III. Por lo tanto, la hipótesis de una implicación de los ROS en la generación de VPH es coherente con la opinión de que el VPH es desencadenado por los acontecimientos situados aguas arriba del complejo IV. En consecuencia, este complejo es por lo general no se consideran como específicamente relacionados con el VPH, aunque una inusual citocromo a3 que residen en complejos IV se ha asociado con crisis de sensores de oxígeno en el cuerpo carotídeo [50, 51] y un estudio reciente sugiere también en su participación sostenida VPH [52]. En nuestro presente experimentos, el complejo inhibidor IV, NaN 3, derogó el VPH y también U46619 reducido en gran medida inducida por la constricción. Estos datos abogan por una inespecíficos menoscabo de los intercambios intracomunitarios de acinares vasoconstricción de NaN 3 más que para una participación específica del complejo IV por el VPH. De acuerdo con estos datos, recientemente hemos demostrado que también NaN 3 no bloquea la hipoxia inducida por ROS en la generación de buques más pequeños intrapulmonar en el ratón [18].

Conclusión

Este estudio ha permitido establecer el primer modelo para estudiar las características básicas de VPH directamente en los intercambios intracomunitarios, acinares pulmonar murino los buques, lo que demuestra una respuesta monofásica constrictory que comienza a desaparecer después de 40 min. En conjunto, los datos obtenidos por diversos inhibidores de la cadena respiratoria y metabolitos aportar pruebas de una participación crítica de la generación de ROS y de los complejos mitocondriales II y III en el intra-acinares VPH. Un inconveniente general de estudios con inhibidores de clásica y metabolitos, sin embargo, es su limitada especificidad. Dado que el actual modelo se basa en murino PCLS mantenerse en corto plazo el tramo culturas, que proporciona una herramienta promisoria para superar estos problemas en el futuro los estudios de uso de ingeniería genética de cepas de ratón y aplicación siRNA in vitro.

Conflicto de intereses

Los autores declaran que no tienen intereses en conflicto.

Autores de las contribuciones

PK y la UP llevó a cabo la caracterización inmunohistoquímica de la vasculatura pulmonar. RP y WK concebido y diseñado el análisis de videomorphometric intrapulmonar arterias. Estos estudios fueron llevados a cabo por fondos de pensiones y AG. RP realizó el análisis estadístico. El manuscrito fue redactado por RP, PK y WK.

Agradecimientos

Los autores se agradecen a Marco Gruß para ayudar en la medición de PO 2 del medio. El apoyo financiero de la Deutsche Forschungsgemeinschaft (Sonderforschungsbereich 547, proyecto C1) se agradece.