Journal of Nanobiotechnology, 2006; 4: 5-5 (más artículos en esta revista)

Quantum dots - una herramienta versátil en la botánica?

BioMed Central
Frank Müller (frank.mueller @ physik.uni-magdeburg.de) [1], Andreas Houben (houben@ipk-gatersleben.de) [1], Peter Barker E (peter.barker @ nist.gov) [3], Xiao Yan (yan.xiao @ nist.gov) [3], una Josef Käs (jkaes@physik.uni-leipzig.de) [2], Michael Melzer (melzer@ipk-gatersleben.de) [1]
[1] Instituto de Genética Vegetal y de Investigación de Cultivos de Plantas (IPK), 06466 Gatersleben, Alemania
[2] Universidad de Leipzig, Facultad de Física y Geociencias, Leipzig, Alemania
[3] Instituto Nacional de Estándares y Tecnología, Gaithersburg, Maryland 20899, EE.UU.

Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License (http://creativecommons.org/licenses/by/2.0], que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que la obra original es debidamente citados.

Resumen

Un dispositivo óptico estable, novedosa clase de fluoróforos (quantum dots) para hibridación in situ análisis se puso a prueba a investigar su señal de la estabilidad y la intensidad en los análisis de cromosomas de plantas. La detección de sitios de hibridación in situ se basa en la fluorescencia de streptavidina-vinculada cristales inorgánicos de cadmio selenide. Comparación de los puntos cuánticos (QDs) con sistemas de detección convencionales (Alexa 488) en experimentos immunolabeling demostrado una mayor sensibilidad que el sistema convencional. En contraste, la detección de QDs por hibridación in situ de varios cromosomas de plantas, utilizando varios de alto copia secuencias, era menos sensibles que Alexa 488. Por lo tanto, semiconductor nanocrystal fluoróforos son más adecuados para inmunoticción pero no para la hibridación in situ de plantas de cromosomas.

Fondo

Quantum dots (QDs) se han introducido como una nueva y prometedora herramienta en las ciencias de la vida, a causa de su único propiedades ópticas [1]. Son muy estables durante la excitación y tienen características de absorción y espectros de emisión [2]. El pico de emisión de estas nanopartículas es relativamente estrecho y los puntos más brillantes que fluoresce orgánicos tintes fluorescentes. Así, las partículas se mejora la visibilidad y la intensidad de láser más débil es necesaria para que el proceso de imágenes. QDs se pueden excitar usando diferentes longitudes de onda de UV hasta la longitud de onda de emisión. Por lo tanto, es posible excitar QDs que emiten simultáneamente en diferentes longitudes de onda potencialmente facilitar una simple manipulación de la etiqueta multicolor muestras.

Los primeros intentos de síntesis de cristales semiconductores como resultado QDs atrapadas en vidrio [2 - 4]. Más tarde, se desarrollaron nanopartículas que pueden ser dispersos en varios solventes y cuya superficie podría ser derivatizado. Después de recubrimiento hidrofílico de QDs con mercaptoacidic ácido, ácido dehydrolipoic u otros reactivos, se convirtió en nanocristales aplicable a la biología [5]. El núcleo de los puntos cuánticos de partículas se compone de una mezcla de cadmio y selenide. Esta esfera, de un diámetro de 20 a 55 Å [6], está recubierto con 1-2 monocapas de ZnS de medición 3,1 Å.

Las proteínas, anticuerpos, ADN o de otras moléculas de interés se puede conectar a QDs que permite una amplia gama de aplicaciones en las ciencias de la vida [7]. La completa QD-streptavidina conjugado tiene un diámetro de 10 a 15 nm [8]. De ahí que los puntos cuánticos se han empleado en las células vivas imágenes [1, 9], de diagnóstico y terapéutica [10], inmunohistoquímica [11] y en la fluorescencia de hibridación in situ (FISH) los experimentos [12, 13]. Sin embargo, hasta ahora no ha habido informes de las solicitudes de QDs en la planta de investigación [14, 15]. Con el fin de comprobar si la aplicación de técnicas de nanopartículas podría mejorar la sensibilidad de hibridación in situ sobre los cromosomas de plantas, realizamos una serie de experimentos de comparación. Además QDs fueron empleados para immunolabelling secciones de tejido.

Materiales y métodos
Material

Por hibridación in situ de plantas jóvenes de Allium fistulosum muestras fueron tratadas previamente en agua helada durante 24 h, fijados en etanol-ácido acético glacial (3:1, v / v) durante 2 días a 4 ° C y almacenarse a una temperatura de 4 ° C en el 70% de etanol. El etanol / ácido acético-fijo material se preparó como se describe en [16]. Por otra parte, meristemas de raíz se fija durante 30 minutos en prepararse de nuevo el 4% (w / v) de formaldehído solución que contenga fosfato-salina tamponada (PBS, pH 7.3), lavado de 45 min en PBS y digerido a 37 ° C durante 25 min en un mezcla de pectinasa 2,5%, 2,5% celulasa Onozuka R-10 y el 2,5% pectolyase Y-23 (w / v) disuelta en PBS antes de la preparación.

Fluorescencia por hibridación in situ (FISH)

La generación de sondas específicas para el A. fistulosum no codificante satélite secuencia [17] se realizó como se describe en [18]. Un plásmido VER17 [19] codificación parte del 18S, 5.8S, la mayoría de los 25s y los espaciadores transcritos interior de Vicia faba 45S rRNA, se utilizó como rDNA específicos de la sonda.

Hibridación in situ las sondas fueron etiquetados por nick de traducción con digoxigenina-11-dUTP o biotina-16-dUTP. FISH se llevó a cabo de acuerdo con [20]. Para el sondeo combinado de ADNr y no codificante del ADN satélite, por hibridación in situ se realizó a través de 20 ng digoxigenina marcado 45S rDNA y 20 ng de biotina que llevan la etiqueta de satélite de ADN por lámina. Hibridación sitios de la digoxigenina-biotina-o etiquetados sondas fueron detectados utilizando los sistemas de detección, anti-digoxigenina-rodamina de anticuerpos, o streptavidina-Alexa 488, respectivamente, cada una con una concentración de 2 μ g / ml. De forma paralela, los sitios de hibridación de la biotina que llevan la etiqueta sonda se detectó mediante el uso de 20 pM QD 565 streptavidina conjugado (Quantum Dot Corporation, EE.UU.). Los tiempos de incubación fueron: 1 h para los 488 y Alexa rodamina, cada una, y 2 h de QD565. Trabajo QDs soluciones de anticuerpos y se prepararon bien en la cooperación Sur-Sur × 4, 1% BSA, 0,1% de Tween 20 de borato o de amortiguación (50 mM de ácido bórico, H 3 BO 3, pH 6,0 o 7,0). Después de lavarse las medidas definitivas y la deshidratación, los tejidos fueron montadas en antifade medio que contiene 10 μ g / ml DAPI. Las señales de fluorescencia se registraron por vía electrónica con un láser confocal de barrido-Microscopio-LSM 510 META (Carl Zeiss Jena GmbH, Jena, Alemania) mediante el uso de láser para la línea 488 Alexa 488, 543 para rodamina y 364 para DAPI QD y 565 de excitación. Además, refrigerado por un CCD de la cámara adjunta a un nivel microscopio de fluorescencia (BX61, Olympus) se utilizó la imagen de manipulaciones se realizaron con el programa Adobe Photoshop.

Immunolabelling de material seccionó

Una hoja mm 2 secciones de Zea mays se hayan fijado para las 3 horas a temperatura ambiente a 50 mM cacodylate buffer (pH 7.2), que contiene 0,5% (v / v) de glutaraldehído y el 2,0% (v / v) de formaldehído, después de la infiltración al vacío. Después de la fijación las muestras fueron deshidratados en forma gradual mediante la adición de aumentar progresivamente las concentraciones de etanol y simultáneamente bajar la temperatura (PLT), utilizando un sistema automatizado congelar la sustitución de las unidades (AFS, Leica, Benzheim, Alemania). Las medidas utilizadas fueron las siguientes: 30% (v / v), 40% (v / v) y el 50% (v / v) de etanol durante 1 h cada uno a 4 ° C, 60% (v / v) y el 75% (v / v) de etanol durante 1 h cada uno a -15 ° C, 90% (v / v) de etanol y dos veces el 100% (v / v) de etanol durante 1 h en cada uno de -35 ° C. Las muestras fueron posteriormente se infiltró con resina Lowycryl HM20 (Plano GmbH, Marburg, Alemania) por incubación en las siguientes mezclas: 33% (v / v), 50% (v / v) y el 66% (v / v) HM 20 resina en etanol de 4 h cada uno y luego el 100% (v / v) HM 20 noche a la mañana. Las muestras fueron trasladados en cápsulas de gelatina, se incubaron durante 3 h en resina fresca y polimerizadas a 35 ° C durante 3 días bajo la luz ultravioleta indirecta. 0,5 μ m de espesor de las secciones de tejidos vegetales incorporados fueron cortadas con un cuchillo de diamante utilizando un Ultramicrotome (Leica Microsystems AG, Wetzlar, Alemania) y en diapositivas montadas a 60 ° C. Estas secciones se lavaron de 3 × 5 minutos en PBS + 1% BSA a temperatura ambiente (RT) y bloquearon durante 20 minutos en PBS + 3% BSA en RT. Un anticuerpo de conejo contra el CF1 (catalizador parte del cloroplasto de la H +-ATP sintasa), en contra de cloroplastos [21], y después un anti-IgG de conejo-Biotina conjugada (30 min, tanto diluida en PBS + 1% BSA, RT) Se adjuntan al presente informe. El anticuerpo secundario fue detectado con el quantum dot 565-streptavidina conjugado. Cada paso, excepto el bloqueo fue seguido por el lavado tal como está descrita anteriormente.

La microscopía electrónica de transmisión

Una alícuota de la QD 565 streptavidina conjugada con una concentración de 0,2 nM fue en una pipeta formvar recubiertos de malla. Las rejillas fueron pre-tratados con poli-L-lisina para aumentar la unión de las partículas. Al cabo de un minuto la red se vació en papel y una gota de 4% de acetato de uranilo se añadió. Después de 15 s el drenaje procedimiento se repitió y las redes se seca al aire. Las imágenes se registraron utilizando un Zeiss EM 902 Un microscopio electrónico (Carl-Zeiss GmbH, Oberkochen, Alemania), equipado con un Megaview III cámara CCD (Soft Imaging System, Münster, Alemania).

Resultados y discusión

Para probar si el único propiedades ópticas de QDs puede ser utilizado para mejorar la intensidad de la señal y la estabilidad de hibridación in situ las sondas, los cromosomas se hibridación con diferentes tipos de secuencias de alto copia. Utilizando el sistema de detección convencionales (Alexa 488, rodamina), fuertes señales de hibridación de la biotina que llevan la etiqueta A. fistulosum digoxigenina o satélite que llevan la etiqueta 45S rDNA fueron detectables a la espera sitios cromosómicas (Fig. 1a]. Después de confirmar la idoneidad de las sondas y de la hibridación, las mismas condiciones se utilizaron para probar la idoneidad de la tecnología de puntos cuánticos para la detección de hibridación in situ de sondas. Por lo tanto, en lugar de la detección de la sonda de biotina-streptavidina Alexa 488 que empleó una QD 565-streptavidina conjugado. Sin embargo, cuando vistos los dos tipos de microscopios de fluorescencia, QDs reveló sólo muy débiles señales de hibridación, mientras que el anti-digoxigenina-rodamina 45S rDNA detectado señales de control siempre han sido claramente visibles (Fig. 1b].

Para controlar la calidad de la QD conjugado empleado para la hibridación in situ los experimentos, los mismos QDs se utilizaron para immunolabelling secciones de la hoja de Zea mays con el anti-CF1 anticuerpos. Láser confocal de imágenes de microscopía de barrido reveló una fuerte y CF1 específicos immunolabelling de cloroplastos (Fig. 2a]. El espectro de emisión picos a 565 nm, por lo tanto, demostrar la funcionalidad de los QDs la prueba de inmunohistoquímica (Fig 2b]. En paralelo, anti-CF1 se detectaron señales usando un Alexa 488 streptavidina conjugado como control. Para comparar la estabilidad de Alexa 488 y QD 565-señales, tanto las sondas fueron escaneadas con láser 100 veces en repetidas ocasiones. Inmunofluorescencia de nanocrystal fluoróforos fue significativamente más brillante y más photostable (Fig. 2c] que la orgánica fluoróforo Alexa 488, como ya se ha demostrado en aplicaciones similares [2].

Para mejorar el rendimiento de puntos cuánticos en la hibridación in situ las siguientes estrategias han sido probadas: (1) en lugar de la fijación en un etanol: ácido acético, material vegetal se fijó en recién preparada 4% parafomaldehyde durante 25 min, (2) para aumentar la accesibilidad de los cromosomas, pepsina diferentes tratamientos se utilizaron los núcleos y se prepararon sin citoplasma y (3) 50 mM borato de amortiguación (a pH 6,0 o pH 7,0) fue utilizado en lugar de 2 × cooperación Sur-Sur. Además, (4) la concentración de la QD solución de trabajo se incrementó hasta diez veces que se han traducido en fuertes antecedentes de fluorescencia (datos no presentados). (5) Hibridación de los cromosomas de plantas utilizando las mismas condiciones que las publicadas para los cromosomas mamíferos utilizando puntos cuánticos basados en la detección de hibridación in situ de sondas [13] también fueron juzgados. A pesar de una serie de diferentes posibilidades se pusieron a prueba, ninguno de estos cambios se debieron a la mejora significativa de puntos cuánticos basados en la hibridación in situ las señales en las plantas. Además, no mejora en la hibridación in situ sitio detección se obtuvo con una QD 605 streptavidina conjugado o mediante el uso de un conejo anti-biotina de anticuerpos detectados por un QD 565 anti-conejo IgG conjugado (ambos: Quantum Dot Corporation, EE.UU.). Por otra parte, resultados similares fueron obtenidos para la detección de la etiqueta 45S rDNA en los cromosomas de la Arabidopsis thaliana y Nicotiana tabacum mediante puntos cuánticos.

¿Por qué fue la señal de detección de hibridación in situ a través de sondas quantum dots comparativamente más bajos en los cromosomas de plantas, cuando la aplicación de esta técnica a los cromosomas de mamíferos era eficiente? Sospechamos que la falta de etiquetas en los cromosomas puede deberse a sterical hinderance de los grandes puntos cuánticos en la más densamente planta de la cromatina, en comparación con los animales cromatina [22]. Además, la formamida tratamiento necesarios para la hibridación in situ de los cromosomas provoca cambios considerables en la estructura de la cromatina [23], lo que podría influir negativamente en la accesibilidad de la cromatina. Medición del tamaño del quantum dots reveló un diámetro de 15 nm por punto (Fig. 3], mientras que la de Alexa 488-streptavidina es sólo el 0,6 nm, lo que sugiere una mayor capacidad para penetrar en la cromatina. En particular, un tamaño de la dependencia de la accesibilidad de immunoreactants fijo en la cromatina se discutió para inmunoelectrónica marcadores [24]. Estos resultados sugieren que, por razones sterical, immunolabelling los cromosomas de la planta podría ser llevadas a cabo por 1,4 nm Nanogold que llevan la etiqueta de anticuerpos, pero no con oro de 10 nm que llevan la etiqueta de anticuerpos.

En resumen, los puntos cuánticos, mientras que a base de immunodetection es una nueva y prometedora herramienta en las ciencias vegetales, parece que los problemas de manejo de los nanocristales se producen en los peces experimentos con plantas cromosomas. Sugerimos que estos grandes semiconductor nanocrystal fluoróforos sufren de steric hinderances que se oponen a su uso en la hibridación in situ a las plantas la cromatina.

Agradecimientos

Me gustaría dar las gracias a Twan Rutten de ayuda en general y Jeremy Timmis para lectura crítica del manuscrito. Damos las gracias a Bernhard Claus, Katrin Kumke Sylvia Marschner y por su excelente asistencia técnica.

Algunas entidades comerciales, equipos o materiales pueden ser identificadas en este documento con el fin de describir un procedimiento experimental o concepto de manera adecuada. Esta identificación no tiene por objeto implicar recomendación o aprobación por el Instituto Nacional de Estándares y Tecnología, ni tiene la intención de implicar que las entidades, materiales o equipos son necesariamente los mejores disponibles para este fin.