Journal of Negative Results in Biomedicine, 2006; 5: 8-8 (más artículos en esta revista)

VEGF sobre los receptores de las células PC12 mediar transitoria de activación de ERK1 / 2 y Akt: comparación del factor de crecimiento nervioso y factor de crecimiento endotelial vascular

BioMed Central
Ingrid Berger (ingrid_berger@gmx.de) [1], Sonja Stahl (sonja.stahl @ biozentrum.uni-wuerzburg.de) [1], Natalia Rychkova (nrych@mail.ru) [1], Ute Felbor (felbor @ biozentrum.uni-wuerzburg.de) [1]
[1] Departamento de Genética Humana, Universidad de Würzburg, Alemania

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Resumen

Factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) y se endostatin angiogénicos y anti-angiogénicos moléculas, respectivamente, que han estado implicados en la neurogénesis y la supervivencia neuronal. El uso de la fosfatasa alcalina proteínas de fusión, nos muestran que la PC12 línea celular neuronal contiene los receptores de membrana celular de VEGF, pero no para endostatin y el colágeno XV endostatin homólogo. La inmunocitoquímica confirmó que proliferan y las células diferenciadas PC12 expresar los receptores VEGF 1, 2 y neuropilin-1. Si bien no funcional efectos de VEGF PC12 en la proliferación celular y la diferenciación se puede observar una ligera VEGF inducido por la reducción de la caspasa-3 en la actividad diferenciada PC12 células apoptóticas fue acompañado de la activación transitoria de ERK1 / 2 y Akt. En comparación directa, nervio del factor de crecimiento demostrado ser un sorprendentemente más potente agente neuroprotector que VEGF.

Fondo

VEGF, antagonistas de los receptores de VEGF, y el C-terminal de colágeno XVIII fragmento endostatin, un inhibidor de la angiogénesis y el crecimiento del tumor [1], han sido probados para su uso a largo plazo, las terapias para mejorar o reducir la vascularización [2]. Por lo tanto, el conocimiento de VEGF y endostatin receptor de los patrones de expresión, así como de su falta de funciones de la célula endotelial es importante. VEGF fue originalmente identificado como un factor de permeabilidad vascular [3] que resultó ser crucial para vasculo-y angiogénesis [4]. Más tarde, no endotelial VEGF las células diana se han descrito en una variedad de órganos [5]. Más recientemente, autocrina y paracrina funciones se han observado en la neurogénesis y la supervivencia neuronal in vitro e in vivo, tanto en el sistema nervioso central y el sistema nervioso periférico [6]. Endostatin estaba implicado en la migración celular neuronal y guía axonal en Caenorhabditis elegans [7]. FC-endostatin dímeros También se informó de que la actividad en motogenic rata feocromocitoma PC12 células cultivadas en Matrigel [8], una matriz extracelular preparado utilizado para la diferenciación de las células endoteliales en tubo-como las estructuras. NGF-PC12 células tratadas son un modelo establecido para el análisis de la diferenciación neuronal, la supervivencia neuronal y neurotrophin de transducción de señales [9]. Por último, el aumento de neuronal y paracellular endostatin depósitos fueron encontrados en pacientes con enfermedad de Alzheimer [10].

VEGF ejerce su anti-apoptóticos en efecto hipóxico neuronas a través de VEGF receptor 2 (VEGFR-2), neuropilin-1 (NRP1), el barrio de Ras / mitogen-activated proteína quinasa (MAPK) y la phosphatidylinositol 3-kinasa (PI3K) / Akt cinasa vías [11 - 13] como en el VEGFR-2-dependiente del endotelio supervivencia [14]. Ras / MAPK y PI3K/Akt también están involucrados en la supervivencia celular PC12 estimuladas por la señalización del factor de crecimiento del nervio (NGF) [15, 16]. Desde VEGF ha sugerido también a actuar como un neurotrophin en motoneuron degeneración [17], destinado a evaluar los efectos de VEGF y endostatins en la diferenciación neuronal y la supervivencia en comparación directa con la prototypic neurotrophin NGF. PC12 células por primera vez probaron con dimeric proteínas de fusión compuesta por la placenta humana isoenzimas de la fosfatasa alcalina (AP) en la N-terminal y murino (m) VEGF 164 o endostatins en el C-terminal. Si bien la afinidad endostatin sondas no reaccionan con las células PC12, AP-mVEGF 164 firmemente vinculado a la proliferación de PC12 y las células diferenciadas. Aunque las células PC12 fueron posteriormente se indica para expresar los receptores de VEGF 1, 2 y neuropilin-1, sólo un menor efecto neuroprotector se observó para el VEGF en comparación con NGF.

Materiales y métodos
Cultivo celular

PC12 células fueron un regalo de los Dres. Sendtner M. y S. Wiese (Departamento de Neurología, Universidad de Wuerzburg, Alemania). Vaca arteria pulmonar endotelial (CPAE) se compraron las células de ATCC (CCL-209). PC12 células fueron cultivadas en DMEM con glutamax-I (Gibco) complementado con un 10% de suero de caballo, el 5% de suero fetal bovino, 100 U / ml penicilina G, y 100 μ g / ml estreptomicina (Gibco) en el 5% de CO 2 a 37 ° C. Para la diferenciación de los experimentos, las células PC12 se chapada en poly-L-ornitina cultivo de tejidos recubiertos platos y permite adherirse a lo largo de la noche (o / n). Después de un lavado con suero libre de DMEM, las células se diferencian en el suero libre de DMEM contiene 50 ng / ml humana recombinante NGF (PAN Biotech) por 3 días [18]. Aunque Fc-endostatin dímero aplicación inducida por la formación de agregados multicelulares PC12 en Matrigel [8], Matrigel no era elegido para el presente estudio, ya que es una matriz extracelular preparación generalmente utilizados para la formación del tubo endotelial ensayos.

Fosfatasa alcalina tinción de las células PC12

Para la construcción y expresión de proteínas de fusión AP ver [19]. PC12 células fueron cultivadas a 80% confluencia o diferenciado a los 6 y los platos, AP y tinción se realizó tal como se describe en [20]. La tinción se controla con una Nikon Eclipse TE2000-U invertida microscopio y documentado utilizan el Spot Insight QE color de imágenes de software (Visitron). Medición cuantitativa de AP proteína de fusión vinculante para la proliferación de células PC12 se llevó a cabo tal y como se describe anteriormente [21].

La inmunocitoquímica

PC12 células chapada en poli-L-ornitina cubreobjetos de vidrio revestida fueron fijadas en buffer fosfato-salino (PBS) que contenía 4% de paraformaldehído a temperatura ambiente durante 20 min, se lavan tres veces en prewarmed tris-buffer salino (TBS) durante 5 min, y incubadas en el amortiguador de bloqueo (TBS con un 10% de suero de cabra) a temperatura ambiente durante 1 h. Después de lavar una vez con TBS prewarmed, las células fueron incubadas con anticuerpos anti-Flt-1 (sc-316), anti-Flk-1 (sc-504) o anti-Neuropilin (sc-5541) anticuerpos (2 μ g / ml, Santa Cruz Biotecnología) en el amortiguador de bloqueo a 4 ° C o / n. Sin anticuerpos primarios fueron retirados por el lavado, y las células fueron incubadas a 20 mM solución de cloruro de amonio durante 30 minutos para reducir autofluorescence. Las células fueron teñidas por 1 h a 37 ° C con una secundaria Cy3-conjugado de cabra anti-conejo de anticuerpos (1:500, Dianova) en el amortiguador de bloqueo. Después del lavado, los cubreobjetos fueron montados en Kaiser's glicerol gelatina (Merck). Fluorescente preparativos de la proliferación de células PC12 se documentaron en 600 veces magnificación (Nikon Eclipse TE2000-U). Adquisición de imágenes de células diferenciadas PC12 se realizó con un Zeiss Axiophot a 1000 veces magnificación.

La proliferación celular y muerte celular análisis

PC12 proliferación de las células a la estimulación con 50 y 100 ng / ml VEGF 165 (R & D Systems) fue ensayada después de 24 h, 48 h, y 72 h utilizando la CellTiter 96 ® Una solución acuosa proliferación de células de ensayo (Promega). Estos ensayos se realizaron con dos diferentes densidades de células (2 × 10 4 células / cm 2 y 6,7 × 10 4 células / cm 2) y la plena suero, así como suero de condiciones privados (0,1% y el 0,4% de suero de caballo). Además, el aumento de VEGF 165 concentraciones de 0,2 a 400 ng / ml se añadieron a PC12 células cultivadas en el 5% suero bovino fetal, y [3 H] timidina incorporación se midió 72 horas después del inicio de la estimulación. El fluorométricos CaspACE ™ sistema de ensayo y análisis de Western blot con un anti-exfoliados caspasa-3 de anticuerpos (1:1000, Señalización Celular, # 9664) fueron utilizados para controlar la apoptosis de células diferenciadas PC12 (véase más adelante). Todos los experimentos se realizaron por triplicado.

SDS-PAGE/Western mancha de análisis diferenciado de células apoptóticas PC12 lisados

PC12 células fueron cultivadas a 50% en la confluencia de 10 cm de cultivo de tejidos platos y NGF-diferentes en función de las 72 h en suero libre de DMEM. Para la inducción de la apoptosis, las células fueron lavadas tres veces con suero libre de DMEM y se incubarán durante 7,5 h en virtud del suero-privadas en las condiciones de NGF-DMEM libre. Tras la adición de exógeno humana recombinante VEGF 165 (R & D Systems) para los plazos indicados, PC12 células se lavaron una vez con helado de PBS con 100 μ M orthovanadate de sodio, seguido por centrifugación a 5000 rpm durante 5 min a 4 ° C. Las células fueron zadas en 200 μ l de helado de buffer de lisis (HEPES, pH 7,8, 150 mM KOAc, 50 mM ß-glycerolphosphate, NaF 25 mM, 10 mM MgCl 2, 5 mM EGTA, 1 mM EDTA, 10% de glicerol , 1% Tritón X-100, 0,05% (v / v) ß-mercaptoetanol, 1 μ g / ml aprotinina, 6 μ g / ml chymostatin, 1 μ g / ml leupeptina, 1 μ g / ml pepstatin A, 1 mM PMSF, 1 mM de sodio orthovanadate). Sobrenadantes fueron recolectados después de la centrifugación a 14 000 rpm durante 10 min a 4 ° C. Normalizados de las muestras que contienen 50 μ g de proteína en su conjunto (Bradford ensayo) fueron separados 10-20% utilizando geles de gradiente. Las proteínas fueron wetblotted en nitrocelulosa y probaron con anti-fosfato-ERK1 / 2 (1:2000, Sigma, M8159) o anti-fosfato-Ser473 Akt (1:1000, Señalización Celular, # 9271) anticuerpos. Los blots fueron despojados y reprobed la detección de anticuerpos con los respectivos no fosforilados proteínas (anti-ERK1, 1:1000, Santa Cruz Biotechnology, sc-94; anti-Akt, 1:1000, Señalización Celular, # 9272). Peroxidasa de rábano y conjugado con anticuerpos secundarios (1:2000, Dianova) se visualizaron por una mayor detección de quimioluminiscencia (Western Rayo ™ quimioluminiscencia Sistema Reactivo, PerkinElmer). Los experimentos se realizaron por triplicado.

Resultados
Diferencial de células unión de VEGF y endostatins

Para determinar el perfil de expresión de carácter vinculante para los socios murino VEGF 164, endostatin y el colágeno XV endostatin homólogo en neuronal y líneas de células endoteliales, PC12 y CPAE células fueron incubadas con AP proteínas de fusión. La AP-mVEGF 164 afinidad sonda fuertemente teñidas y la proliferación de células diferenciadas PC12 (Fig. 1a, b]. Por el contrario, mVEGF AP-110 que carece de la C-terminal de heparán sulfato vinculante de dominio, el dominio de endostatin colágeno XVIII (AP-mESXVIII), y el colágeno XV endostatin homólogo (AP-mESXV) no se unen a las células PC12. Ambos mVEGF AP-164 y AP-mESXVIII etiquetados CPAE mientras que las células mVEGF AP-110, AP-mESXV y control de AP no (Fig. 1c]. Medición cuantitativa de AP proteína de fusión vinculante para la proliferación de células PC12 confirmó los resultados anteriores (Fig. 1d]. De acuerdo con la falta de AP-mESXVIII y AP-mESXV vinculante para las células PC12, endostatins humana recombinante [22] no contestó ni promover ni inhibir la diferenciación de células PC12 (datos no presentados). De este modo, las células PC12 no son un modelo útil para la comprensión endostatin efectos en las células.

PC12 expresar las células de alta afinidad de los receptores de VEGF

De acuerdo con la tinción de AP, se demostró por inmunofluorescencia PC12 células que expresan la alta afinidad del receptor tirosina quinasas del receptor de VEGF 1 y 2 (VEGFR-1, VEGFR-2), así como la baja afinidad del receptor neuropilin-1 (Fig. 2 ). Estos receptores se expresan en la superficie celular de la proliferación de (Fig. 2a-c] y diferenciado (Fig. 2e] PC12 células y parecen poseer una morfología que recuerda agrupadas de tirosina quinasas activadas. En comparación, los resultados se obtuvieron con anticuerpos de Santa Cruz y Biotecnología Dianova (datos no presentados).

VEGF induce la activación transitoria de ERK1 / 2 y Akt quinasa diferenciadas en células apoptóticas PC12

Si bien la adición de VEGF 165 no tuvo ningún efecto sobre la proliferación de las células PC12 y neurite formación, un coherente pero no significativa reducción de la caspasa-3 actividad se hizo evidente cuando VEGF 165 se administró a diferenciarse las células apoptóticas PC12 (datos no presentados). Para analizar VEGF PC12 señalización en la supervivencia celular, la activación de señales extracelulares reguladas quinasas ERK1 / 2 y Akt fue examinado por análisis de Western blot utilizando fosfato anticuerpos específicos y sus respectivos homólogos no fosforilados. Control de las culturas demuestra que ERK1 / 2 (p44/p42 MAPK) y la activación de Akt son sostenidos por 79,5 h en presencia de NGF (Fig. 3, carril 1). La eliminación de NGF de 7,5 h a las 72 horas de diferenciación dado lugar a una reducción significativa de ERK1 / 2 y Akt fosforilación (Fig. 3, carril 2). Exógenos además de 100 ng / ml VEGF 165 a NGF-PC12 privados dio lugar a células transitoria ERK1 / 2, la actividad dentro de 7-10 min, que disminuyó casi a los niveles de control 20 minutos después de la estimulación (Fig. 3, carriles 3, 4, y los datos no muestra). Mayores concentraciones de VEGF recombinante (200 ng / ml) no aumentar o prolongar ERK1 / 2 de actividad (datos no presentados). Cinética de activación similares fueron observados para la fosforilación de Akt en serina 473 (Fig. 3]. Para la comparación de los mecanismos de señalización, las células apoptóticas PC12 También se NGF-estimulado. NGF-estimulación inducida por una forma mucho más pronunciada y sostenida activación de ERK1 / 2 y Akt que es aún más prominente que en NGF no tratados de control de las células apoptóticas (Fig. 3, carriles 5, 6).

Discusión

Estamos aquí que endostatin informe afinidad sondas derivados de colágenos XV y XVIII no se unen a las células PC12 que indica que estas células no expresan endostatin receptores de membrana celular. Esta observación es consistente con la ausencia de efectos recombinante endostatins en neurite fruto (datos no presentados) y la falta de unión de AP-mESXVIII y AP-mESXV embrionarias murinas a los tejidos del nervio [19]. AP-mESXVIII predominantemente etiquetados los vasos sanguíneos, mientras que la AP-mESXV vinculante se limita a la lense cápsula [19], que se correlaciona con los resultados actuales que sólo AP-mESXVIII, pero no AP-mESXV, fuertemente teñidas CPAE células. A diferencia de las sondas endostatin afinidad, mVEGF AP-164 registró un fuerte unión a las células PC12. Indiferenciado de células PC12 se sabe expresar VEGF para estimular la angiogénesis [23]. Ahora demuestran que proliferan y las células diferenciadas PC12 también expresar VEGFR-1 y -2 y NRP1. NRP1 actúa como una isoforma-específicos VEGF co-receptor se une que sólo VEGF 165 [24]. Desde el C-terminal suprimido mVEGF AP-110 no se unen a las células PC12, NRP1 parece ser necesario para la interacción del VEGF con 165 células PC12.

A pesar de prominentes expresión del VEGF sobre los receptores de las células PC12, exógenos VEGF 165 no tuvo ningún efecto sobre la proliferación de las células PC12 y neurite formación. Una de las razones podría ser endógeno VEGF-expresión de la proliferación de células PC12 que es downregulated sólo 48 horas después de la inducción de diferenciación con NGF [23]. Esto también explica la ligera anti-apoptóticos efecto de VEGF 165 en células PC12 que se habían diferenciado durante tres días antes de VEGF 165 estimulación. Sin embargo, sólo una insignificante disminución de la proliferación celular se puede observar a tratamiento con un anticuerpo contra la rata VEGF 164 (datos no presentados). Por lo tanto, nuestros datos están en consonancia con la observación de que VEGFR-1-que expresan las células muestran una pobre respuesta mitogénica a VEGF estimulación [5]. Análisis de VEGF 165-inducida por la transducción de señales diferenciadas en células apoptóticas PC12 demostrado la activación de ERK1 / 2 y Akt. La naturaleza transitoria de VEGF 165-desencadenó ERK1 / 2 de fosforilación en células PC12 proporciona una nueva explicación para la observación de que VEGF 165 no fue capaz de inducir la diferenciación de células PC12 que se sabe que exigen una activación de la cascada MAPK [25]. La ineficacia de rescate de células PC12 de la apoptosis a través de VEGF 165 es probablemente también debido a su corta duración y efecto relativamente pequeño en ERK1 / 2 y Akt.

Inducida por VEGF neuroprotectores de señalización a través de VEGFR-2, NRP1 y los dos antes mencionados cascadas de señalización se muestra en hipóxica y de glucosa-privados neurona del hipocampo × neuroblastoma (HN33) células híbridas [11], en hipocampo de rata primaria neuronas que habían estado expuestos a glutamato [12], y, en hipóxica murino primaria neuronas corticales [13]. En estos modelos in vitro de los sistemas de isquemia cerebral, no la comparación de VEGF y NGF cinética de activación se realizó. Nuestros resultados en el factor de crecimiento estimulado PC12 células muestran que tanto los anti-apoptóticos efecto y la activación de ERK1 / 2 y Akt fueron transitorias y leves en comparación con NGF. Queda por aclarar si esto es una consecuencia de las condiciones experimentales, línea celular específica o una característica general de VEGF inducido por neuroprotección.

Conclusión

Sobre la base de experimentos con la privación del factor de crecimiento, el presente estudio sugiere que NGF protege a las células neuronales de la muerte de la célula mucho más eficazmente que VEGF 165. El significativo NGF inducida por la reducción de la caspasa-3 en la actividad diferenciada PC12 células apoptóticas se correlaciona con una forma mucho más pronunciada y prolongada activación de efectores abajo en comparación con el VEGF 165. De este modo, los compuestos angiogénicos VEGF 165 sólo podrán ser desempeña un papel menor en la neurogénesis y la supervivencia neuronal y sólo podrán tener poco terapéutico y los efectos secundarios en las células neuronales.

Agradecimientos

Esta labor fue apoyada por un Emmy Noether a la concesión de la Deutsche Forschungsgemeinschaft (Fe 432/6-4). Sonja Stahl recibe un estipendio de la Graduiertenkolleg 1048.