Frontiers in Zoology, 2006; 3: 6-6 (más artículos en esta revista)

Neuroanatomía funcional de la rhinophore de Aplysia punctata

BioMed Central
Adrian Wertz (wertz@neuro.mpg.de) [1], Wolfgang Rössler (roessler@biozentrum.uni-wuerzburg.de) [2], Malu Obermayer (maluob@biozentrum.uni-wuerzburg.de) [2], Ulf Bickmeyer (ubickmeyer@awi-bremerhaven.de) [1]
[1] Biologische Anstalt Helgoland, Alfred Wegener Institute for Polar and Marine Research en la sociedad de Helmholtz, Kurpromenade 201, 27483 Helgoland, Alemania
[2] Fisiología del comportamiento y sociobiología, Biocenter, Universidad de Würzburg, Am Hubland, 97074 Würzburg, Alemania
[3] Instituto Max Planck de Neurobiología del Departamento de Sistemas Computacionales y Neurobiología, Am Klopferspitz 18, 82152 Martinsried, Alemania

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Resumen
Fondo

Para los caracoles marinos, olfaction representa una modalidad sensorial fundamental de larga distancia de recepción, como auditiva y visual la información es limitada. La parte posterior de Aplysia Tentacle, el rhinophore, es un órgano chemosensory de comportamiento y varios estudios demostraron que la rhinophores puede detectar las feromonas, iniciar la locomoción y la orientación hacia los alimentos. Sin embargo, la neuroanatomía funcional de la rhinophore aún no está clara. Aquí aplicamos la serotonina-inmunohistoquímica y marcadores fluorescentes en combinación con microscopía confocal, así como las técnicas de grabación óptica para elucidar la estructura y función de la rhinophore de la babosa de mar Aplysia punctata.

Resultados

Con las técnicas anatómicas una visión general de la organización neuroanatomical de la rhinophore se presenta. Etiquetado con yoduro de propidio reveló una capa de núcleos celulares en el epitelio sensorial y densas núcleos celulares por debajo de la ranura de la rhinophore, que se extiende a cerca de dos tercio de la longitud total de la rhinophore. La serotonina se encontró inmunoreactividad en el glomérulos olfativos por debajo del epitelio, así como en el rhinophore ganglionares. Retrógrada la localización de la rhinophore ganglionares con 4 - (4 - (dihexadecylamino) styryl) - N-methylpyridinium yoduro (DIA), ha demostrado la conexión de glomérulos con el ganglio. Alrededor de 36 glomérulos (diámetro medio 49 μ m) fueron contabilizados en un solo rhinophore. Fluorimétrica mediciones intracelulares de Ca 2 + niveles utilizando Fura-2 AM puesto de manifiesto de carga de Ca 2 +-respuestas en el ganglio rhinophore a la estimulación con aminoácidos. Bath aplicación de diferentes aminoácidos reveló respuestas diferenciales en diferentes posiciones dentro de la rhinophore ganglionares.

Conclusión

Neuroanatomical Nuestro estudio reveló que el número y la posición de glomérulos en la rhinophore y el ganglio rhinophore como etapa de procesamiento de información sensorial. La serotonina-inmunorreactiva procesos se encontraron ampliamente en el rhinophore, pero no se detectó dentro de cualquier órgano periférico de células. Los aminoácidos se utilizan como estímulos olfativos en las grabaciones ópticas y sensoriales respuestas inducidas en el rhinophore ganglionares. La complejidad de los cambios en intracelulares de Ca 2 +-indica los niveles, que el tratamiento de la información olor se lleva a cabo dentro de la rhinophore ganglionares. Nuestro neuroanatomical y estudios funcionales de la rhinophore abrir una nueva vía para analizar el sistema olfativo en Aplysia.

Fondo

La percepción de señales químicas representan una parte importante de comunicación y es utilizada por una gran variedad de organismos de protozoos [1] y levaduras [2] a los insectos [3], moluscos [4, 5], peces [6], los mamíferos [7] y los seres humanos [8]. Mar babosas del género Aplysia se han investigado intensamente en lo que respecta a comportamiento y estudios neurobiológicos, y las agallas reflejo de retirada se ha convertido en una conocida modelo de circuitos neuronales para el estudio de la base celular del aprendizaje y la memoria [9 - 11]. Menos estudios se han centrado en el sistema olfativo de Aplysia [12 - 14]. En Aplysia, chemosensation desempeña un papel importante en el contexto de diversos comportamientos, por ejemplo, localización de los alimentos [14, 15] y el comportamiento sexual [16]. El rhinophore es considerado como el órgano olfativo en Aplysia [15] y se sugirió a ser importante para la detección de feromonas [16, 17]; diferentes péptido-feromonas fueron identificados en el género Aplysia [4, 18, 19]. Recientemente, se pudo demostrar que metabolitos secundarios (alcaloides) de esponjas marinas estimular las neuronas en el ganglio rhinophore de la rhinophore de Aplysia punctata [20].

A pesar de la importancia biológica olfaction, poco se sabe acerca de estructurales y aspectos funcionales de la vía sensorial olfativo en Aplysia. La neuroanatomía de la Tentacle se ha investigado en los caracoles terrestres Achatina [21], que pertenecen al grupo de PULMONATA a stylommatophoran y caracoles. Los tentáculos de Achatina fulica contener un ganglio Tentacle, glomérulos y cuatro vías para la proyección de las neuronas sensoriales olfativas se describen. Aplysia ha demostrado poseer un ganglio rhinophore pero en contraste con Achatina el ojo está en la base y no en la parte superior de la rhinophore, y fotorreceptores se encuentran en el epitelio rhinophore [21 - 24]. En Phestilla sibogae la presencia de serotonina, la dopamina y la noradrenalina en la rhinophores fue confirmada [25], posiblemente, revelando glomérulo-al igual que las estructuras a lo largo de la vía olfativa [26]. La serotonina-inmunorreactiva elementos se encuentran también en la rhinophores de Pleurobranchea californica y Tritonia diomedea [27]. Phestilla sibogae, Pleurobranchea californica y Tritonia diomedea están estrechamente relacionados con la Aplysia punctata pertenecientes a la sistemática del grupo de ophistobranchia. Aquí buscamos serotonina inmunoreactividad en la rhinophore de Aplysia punctata. Además, neuroanatomical la localización e histología se utilizan para analizar la estructura de la rhinophore.

Los aminoácidos son demostrado ser potentes estímulos olfativos para los animales acuáticos [28 - 31] y obtener respuestas a la alimentación Pleurobranchaea californica [32]. Murphy y Hadfield [33] estudiaron la inervación de la rhinophores y los tentáculos orales de Phestilla sibogae y técnicas electrofisiológicas utilizadas para demostrar que sólo el rhinophores son muy selectivos a los aminoácidos libres. Por ello utilizamos la técnica de imágenes ópticas y aminoácidos como estímulos, para investigar chemoreceptive transformación en la rhinophore. El presente estudio tiene por objeto contribuir a nuestra comprensión de la vía sensorial olfativo en caracoles marinos y chemosensory la capacidad de estos animales.

Resultados y discusión
Neuroanatomía de la rhinophore

La anatomía de la rhinophore de Aplysia fue investigado anteriormente sólo con respecto a la ubicación de las células sensoriales [13] y como parte de un estudio filogenético de seahares [34]. La presencia de Neuromoduladores como las catecolaminas se ha demostrado en la rhinophore de Aplysia californica de Croll [35]. Este es el primer estudio que se centran en la neuroanatomía funcional de la rhinophore de Aplysia punctata con respecto al número y la ubicación de glomérulos, serotoninérgicos inervación y vías neuronales. El rhinophore de Aplysia punctata contiene una ranura, que se extiende a cerca de dos tercio de la longitud total de la rhinophore. Figuras 1A y 1B muestran un ejemplo de seccionaron longitudinalmente rhinophore etiquetados con phalloidin y serotonina-inmunoreactividad (IR). El rhinophore generalmente contratados durante el proceso de disección, y prominentes músculos longitudinales se convirtió en firme etiquetados con phalloidin vinculante para muscular f-actina (Figs. 1A, B, F]. La serotonina-IR se detecta en varias regiones del rhinophore: rhinophore el nervio, el ganglio rhinophore a la base de la ranura, y los glomérulos (Figs. 1A, B, G]. Serotoninérgicos procedió fibras de los nervios rhinophore a través del ganglio rhinophore a los glomérulos. Dado que no serotonina-IR fue detectable en la celda dentro de los órganos creados en virtud de rhinophore, todos los serotoninérgicos neuronas innervating la rhinophore deben ser de origen extrínseco. Croll [35] se describe la tirosina hidroxilasa inmunoreactividad en grandes y pequeñas somata debajo del epitelio en la rhinophore, homogéneamente distribuidos a través de las paredes de toda la estructura, mientras que serotoninérgicos immnureactivity se encontró en los procesos celulares, pero no la somata dentro de la rhinophore. Croll et al. [26] no encontró serotoninérgicos de células en órganos creados en virtud de la periferia en la nudibranch Phestilla, similar a nuestros hallazgos. Esto indica una función fisiológica de catecolaminas y serotonina en el procesamiento olfativo mediada por las neuronas centrífugas en el caso de la serotonina y la modulación más local en el caso de las catecolaminas. Serotoninérgicos inervación de glomérulos olfativos se encuentra comúnmente en los insectos y ha demostrado mejorar la respuesta de las neuronas olfativas de proyección (por ejemplo: [36, 37]].

Una serie de secciones transversales phalloidin demuestra que llevan la etiqueta de fibras musculares paquetes orientada en el longitudinal y el eje horizontal de la rhinophore (Figs. 1 C, D, E]. Glomérulos estaban situadas debajo del epitelio sensorial cerca de la pared interna de todo el surco (Figs. 1B, 2A, C]. La tinción de células con núcleos de yoduro de propidio indica que los glomérulos no están rodeados de un borde de periglomerular de células somata (Figs 1G, 2A, H]. En las secciones histológicas, sin embargo, glomérulos parecía estar rodeado por una capa de neuroglia-al igual que los procesos (Fig. 2I]. En contraste con los insectos y vertebrados, donde se convirtió en glomérulos olfativos brillantes etiquetados con phalloidin debido a la totalización de los neuronal f-actina [38], dentro de los glomérulos rhinophore de Aplysia punctata no eran etiquetados con phalloidin, y el ganglio rhinophore fue sólo ligeramente manchadas de phalloidin (Fig. 2F]. Secciones histológico reveló que el ganglio rhinophore tiene una estructura plegada (Fig. 2G]. Retrógrada etiquetado de los glomérulos de inserción de 4 - (4 - (dihexadecylamino) styryl) - N-methylpyridinium yoduro (DIA) en el ganglio rhinophore demostrado la conexión entre la rhinophore ganglionares y el glomérulos (Fig. 2H]. DIA coloraciones mostrar la conexión neuronal entre el ganglio y rhinophore glomérulos. Retrógrada etiquetado con DIA reveló su mayoría neuropil manchas que indican que los procesos neuronales se extiende desde el ganglio rhinophore a los glomérulos son preferentemente etiquetados. No sabemos si las células de órganos creados en virtud de estas neuronas se encuentran en el ganglio rhinophore (porque masiva de tinción) o más en la periferia, o en las secciones adyacentes. Los estudios futuros se centrarán más en detalle sobre las distintas proyecciones de las neuronas sensoriales patch clamp utilizando / neurona sola y teñir grabaciones técnicas de relleno.

El número de glomérulos se estimó en una completa serie de secciones de la rhinophore etiquetados con 5-HT de anticuerpos. El número total de glomérulos contados en un rhinophore fue de 36 en un rhinophore, y el diámetro medio de cada uno de los glomérulos un promedio de 49 μ m + / - 27 μ m con un rango de 25 μ m a 135 μ m.

Investigaciones anteriores en Aplysia californica han demostrado que la ranura casas de diversos tipos de células sensoriales [13]. Emery y Audesirk [13] sugiere que las células intraepiteliales con 30 μ m de largo cilios producen un constante flujo de agua en torno a las células epiteliales de la rhinophore a facilitar olfaction. Anterógrado etiquetado experimentos en un caracol terrestre (Achatina fulica) de Chase y Tollozcko [21] han demostrado que las neuronas sensoriales para el proyecto glomérulos y directamente a la rhinophore ganglionares o más centros en los ganglio cerebral. Los futuros experimentos son necesarias para determinar si patrones similares de proyección de las neuronas sensoriales están presentes en Aplysia.

Etiquetado de los núcleos celulares con yoduro de propidio y secciones histológicas mostraron la gran cantidad de núcleos de células en el epitelio sensorial (Figs 1F, G, 2A, H, I]. La capa de núcleos de células sensoriales esté claramente separado de los núcleos más basal (Fig. 2H]. Glomérulos se encuentra debajo de este epitelio (Figs 2H, I].

Yoduro de propidio y Mallory tinción de núcleos de células reveló su tamaño es muy variable en torno a los glomérulos. Ambos métodos reveló muy pocos núcleos en el interior del glomérulos similares a las condiciones en los vertebrados y en los insectos (Figs. 2H, I]. Yoduro de propidio tiene una afinidad muy elevada, a los ácidos nucleicos, y dado que las secciones de agarosa utilizado con excelentes propiedades de penetración estamos convencidos de que todos los núcleos fueron etiquetados. En contraste con los glomérulos, núcleos celulares estuvieron presentes en el interior del rhinophore ganglionares (Fig. 2G]. Núcleos celulares pueden ser de ambos neuronales y células gliales órganos.

La anatomía de la rhinophores con glomérulos distribuidos en todo el groove deja abiertas posibilidades distintas a las centrales de las proyecciones de las neuronas olfativas del receptor (ORNs). La opinión general de un patrón uniglomerular proyección, que parece ocurrir en la mayoría de los insectos [39, 40] y vertebrados [41, 42], sería complicado con la actual disposición de los glomérulos. Posiblemente, ORNs del mismo tipo se encuentran debajo de un glomérulo y no están distribuidas de manera uniforme durante el epitelio sensorial, o, en el otro caso, axonal de las proyecciones individuales ORNs a sus glomérulos objetivo sería muy largo y en todo el rhinophore. Estudios recientes en Xenopus laevis se describe una inervación de más de un glomérulo individual de ORNs [43]. Multiglomerular proyección patrones también aparecen en los crustáceos [44]. En Aplysia, los futuros estudios sobre la proyección patrón de ORNs combinado con estudios de neuroimagen funcional de los glomérulos proporcionará una mayor penetración en el papel funcional de los glomérulos en los moluscos.

El calcio de imágenes de olor evoca respuestas en el ganglio rhinophore

Para investigar si el ganglio rhinophore responde a la estimulación olfativa del epitelio sensorial de la rhinophore, hemos aplicado diferentes aminoácidos como olores y las respuestas registradas ópticamente. En primer lugar hemos probado nuestro sistema por la aplicación de agua de mar artificial (ASW), con alto K + (Fig. 3A]. El Ca 2 +-respuesta inducida por un alto K +-solución podría ser reproducido y casi mostró un aumento similar después de la aplicación repetitiva.

Elegimos aminoácidos diferentes, ya que fueron utilizados en experimentos anteriores en los moluscos gasterópodos [32, 33]. Para evitar la excitación directa de las neuronas en el rhinophore de los estímulos, no uso glutámico y el ácido aspártico, más alto que las respuestas inducidas en el nudibranch Phestilla sibogae [33]. En más de 10 experimentos no se encontraron Ca 2 + - respuesta en el ganglio rhinophore inducida por la aplicación de methionin a diferentes concentraciones (200 μ m - 20 mM).

Borrar Ca 2 +-respuestas en el ganglio rhinophore se encontraron durante la estimulación con alanina (ALA). Figura 3B muestra tres respuestas a ALA a partir de tres diferentes animales. En todos los experimentos 2 mM ALA se aplicó. Hemos encontrado una disminución de Ca 2 +-, así como un aumento (Fig 3B traza superior). Aplicación de diferentes aminoácidos (2 mM cada uno) durante un experimento reveló respuestas diferenciales en la acumulación intracelular de Ca 2 +-a distintos niveles de regiones (Fig 3C]. Las huellas en la Fig 3C muestran Ca 2 +-mediciones en dos diferentes regiones de interés. Arginina (ARG) y glutamina (GLN) indujo una respuesta en una región, mientras que la otra región no mostraron respuesta, pero ambas regiones respondieron con un cambio en Ca 2 +-nivel a la estimulación con glicina (Gly) y valina (VAL) . Ambas regiones mostraron una disminución de Ca 2 +-a todos los niveles de estímulos (Fig. 3C], lo que indica una inhibición o la reducción de la actividad celular de estos estímulos. Estimulación con 2 mM de fenilalanina (PHE) inducida por las respuestas no detectables.

Las respuestas a diferentes concentraciones de ALA (2 μ M - 20 mM) fueron altamente dependientes de la grabación posición dentro del ganglio. Diez respuestas de diez regiones dentro del ganglio rhinophore se demuestra en la figura 4. Regiones de interés (ROIs) fueron seleccionados más o menos al azar en todo el ganglio rhinophore al comienzo de un experimento, y sólo responda regiones se muestran en las cifras. El tamaño de cada uno de los ROIs puede ser estimado a partir de la barra de escala (Fig. 4B]. Suponemos que en muchos casos pueden tener ROIs no incluía una sola neurona ya que el diámetro ROIs tenían entre 15 y 60 μ M y sólo los organismos celulares más grande llegar a 50 μ M.

En el transcurso de un único experimento, las respuestas inducidas por el olor a aminoácidos registrados procedentes de diferentes regiones se mantuvo similar. Se aplicaron ALA en la concentración de 2 μ m de 20 mm. En baja concentración (<2 mM) es difícil decidir si un observó Ca 2 +-respuesta fue estímulo dependiente. En una concentración de 2 mM de ALA, respuestas claras se puede observar en tres regiones (Fig 4C VIII-X). Regiones VIII y IX mostraron una disminución de la Ca 2 +-, mientras que en la X región de Ca 2 + a nivel de aumento.

En respuesta a 20 mM ALA todas las regiones seleccionadas mostraron un cambio en intracelulares de Ca 2 +-los niveles. Era ya sea una disminución o un aumento del Ca 2 +-, o incluso una combinación de ambos como se indica en el rastro II. Curiosamente, las respuestas de las regiones vecinas (II y III, IX y X) mostraron opuestos Ca 2 +-respuestas que indican un posible inhibidor de acoplamiento. La respuesta de los patrones espaciales son complejas. Estimulación con 20 mM ALA inducida por un aumento de Ca 2 +-niveles en cuatro regiones (Fig. 3A-I,-V,-VI-X], mientras que en otras cinco regiones se observó una disminución de Ca 2 +-niveles ( Fig. 3A-III, IV, VII, VIII, IX), y en la región una disminución II fue seguida por un aumento de Ca 2 +-los niveles.

En todos nuestros experimentos, el más alto de Ca 2 +-respuestas fueron inducidas por el ALA. Desde el rhinophore se corta durante la preparación, no podemos excluir parcial de la lesión rhinophore los ganglios. Sin embargo, el calcio de imágenes experimentos demuestran que las partes de la rhinophore ganglionares responden diferencialmente a la estimulación del epitelio sensorial con los aminoácidos que indica que los estímulos olfativos son transmitidas y transformadas en la rhinophore ganglionares. En una investigación anterior que hemos probado esponja alcaloides y reveló respuestas claras a sceptrin a 200 μ M de concentración [20]. Olfaction El término se utiliza en animales terrestres de sustancias químicas en suspensión en el aire, sino también en los animales acuáticos de agua a cargo de las sustancias químicas detectadas principal receptor de las neuronas en la nariz (por ejemplo, peces, anfibios) o en las antenas (crustáceos) [45]. En los vertebrados se denomina recepción de larga distancia en contraste con una estrecha gama chemoreception gusto a través de los receptores (los receptores de las células secundaria). En Phestilla sibogae diferentes densidades de células sensoriales subepitelial y intraepitelial células sensoriales se encuentran en la fase oral del Tentacle y el rhinophores [46]. Estos datos morfológicos, junto con las pruebas electrofisiológicas de una mayor sensibilidad de la rhinophores [33] llevó Boudko y colegas [46] a la conclusión, que rhinophores servir de larga distancia chemoreception o olfaction. A nuestro entender, una clara separación basada en la morfología de las células del receptor que no se ha hecho para Aplysia, por lo que preferimos utilizar el término "olfaction" a causa de la aparente similitud en relación con la organización central de la vía en glomérulos.

En Limax, el procesamiento de información olfativa fue investigado principalmente a nivel de la procerebrum [47 - 49], olor y compleja inducida por las oscilaciones se describen. En Aplysia, calcio utilizando técnicas de imagen no encontramos ninguna indicación de olor inducida por las oscilaciones en el nivel de la rhinophore ganglionares. Sin embargo, la complejidad de los cambios en intracelulares de Ca 2 +-indica que los niveles de procesamiento de información olor se lleva a cabo dentro de la rhinophore ganglionares.

La distribución espacial de olor inducida por la actividad registrada en este estudio indica que la actividad en la rhinophore ganglionares depende de la naturaleza química y la intensidad del estímulo.

Diversos estudios en los insectos, así como los vertebrados sugieren que glomérulos olfativos representan unidades funcionales para el procesamiento de olor, y olfativa información está representado en un mapa espacial de glomérulos diferencialmente activado (por ejemplo: [50, 51]]. Será interesante determinar si este es también el caso en Aplysia glomérulos y si representan unidades funcionales para el procesamiento de olores. Glomérulos diámetros oscilaban entre 25 μ m y 135 μ m indicando un número diferente de neuronas que convergen en un solo glomérulo. En los insectos, se encontraron macroglomeruli a desempeñar un papel importante en la feromona de comunicación (por ejemplo: [52, 53]]. Como la rhinophore de Aplysia desempeña un papel importante en la detección de feromonas [17], sería interesante investigar la gran glomérulos y su potencial función en el tratamiento de feromonas. La medición de las respuestas de las neuronas sensoriales en el epitelio también puede ayudar a identificar las neuronas sensoriales olfativas. Muchos organismos marinos producen metabolitos secundarios de la defensa, la disuasión y como feromonas. Mar babosas, así como muchos otros animales marinos dependen de chemosensory información de su medio acuático, como la óptica sentido desempeña un papel menor en las tempestuosas y fangosas aguas someras o las profundidades del mar y acústico / mecanoterapéuticas sentidos sensoriales dar sólo información limitada acerca de, por ejemplo, la calidad de los alimentos . La química sentido probablemente es el principal sentido en muchos organismos marinos, y Aplysia representa un modelo prometedor para el futuro sistema de investigaciones de la ecología química del mar, babosas.

Conclusión

Los glomérulos y el ganglio rhinophore representan diferentes etapas de procesamiento de información sensorial. Hemos encontrado 36 glomérulos en la rhinophore retrógrada y etiquetado con DIA revelado la conexión entre los glomérulos y rhinophore ganglionares. Los glomérulos se encuentran cerca de las capas epithelials hacia el lumen de la ranura y parecen estar rodeado por una delgada neuroglia-al igual que vaina. La serotonina-inmunoreactividad se encontró a fondo en el rhinophore, pero no se detectó en cualquier órgano periférico de células. Por tanto, estas fibras serotoninérgicos parecen ser las proyecciones eferentes de los ganglios centrales. Los aminoácidos se utilizan como potencialmente importantes estímulos olfativos para los animales acuáticos, ópticos y grabaciones demuestran que los aminoácidos inducir las respuestas sensoriales en el rhinophore. La complejidad de los cambios en intracelulares de Ca 2 +-niveles nos ha llevado sugerir, que el tratamiento de la información olor se lleva a cabo dentro de la rhinophore ganglionares. Nuestro neuroanatomical y estudios funcionales de la rhinophore abrir una nueva vía para analizar el sistema olfativo en Aplysia, que conduce a la comprensión de procesamiento neuronal de señales químicas en el medio marino.

Métodos
Preparación de tejidos, inmunocitoquímica, y trazadores fluorescentes

Los especímenes de Aplysia punctata fueron recogidos de las aguas en torno a la isla de Helgoland. Los animales se enfría en hielo, fijado en el 4% de formaldehído en agua de mar artificial (ASW; pH 7,5; en mm: 460 NaCl, KCl 104, 55 MgCl, 11 CaCl 2, 15 y Na-HEPES (N-(2-hidroxietil) piperacina-N-2-ácido ethansulfonic Na-sal). Antes de rhinophores a otros tratamientos, se lavaron tres veces en 0,1 M tampón fosfato salino (PBS, pH 7.2). Para el etiquetado con fluophore-conjugado phalloidin, inmunocitoquímica, la localización con marcadores lipofílicos y nucleares tinción, la rhinophores fueron incorporados en el 5% de bajo punto de fusión de agarosa (Agarosa II, Amresco, Solon, OH, N º 210-815) y seccionadas en un frontal o plano sagital a 150 μ m de espesor con una vibración micrótomo (VT Leica 1000S , Wetzlar, Alemania). Libre flotación de agarosa secciones se preincubated en PBS con 0,2% Triton X-100 y el 2% de suero normal de cabra (ICN, Biomedicals, Orsay, Francia, Cat. No.191356) durante una hora a temperatura ambiente. Diferentes combinaciones de doble coloraciones se realizaron. Etiqueta serotoninérgicos Para las neuronas, las secciones fueron incubadas con un anticuerpo primario contra 5-HT, planteadas en conejo (1:4000, DiaSorin, Stillwater, MN, Ref. N º 20080, Lote N º 051007) en PBS con 0,2% Triton X-100 y el 2% NGS noche a la mañana a temperatura ambiente. Este anticuerpo fue utilizado en estudios anteriores en los moluscos gasterópodos [26, 27]. Después de cinco enjuagues en PBS, las secciones fueron incubadas en Alexa Fluor 488 conjugado de cabra anti - anticuerpo secundario de conejo (1:250, Molecular Probes, Eugene, Oregón, Ref. N º A -11008). etiqueta Para filamentosos (f)-actina en los músculos y neuronas, las secciones fueron incubadas en 0,2 unidades de Alexa Fluor 488 o 568 phalloidin (sondas moleculares, A-12379 y A-12380) en PBS la noche a 4 ° C. Para las manchas núcleos celulares, las secciones fueron incubadas durante 15 min a 25 μ g / ml de yoduro de propidio (sondas moleculares, P-1304) en PBS con 0,2% Tritón X-100 a temperatura ambiente. Secciones finalmente se lavó por lo menos cinco veces con PBS, transferido en el 60% de glicerol / PBS durante 30 min, y en diapositivas montadas en el 80% de glicerol en PBS.

La tinción con marcadores lipofílicos

El tinte fluorescente lipofílicas 4 - (4 - (dihexadecylamino) styryl) - N-methylpyridinium yoduro (DIA; sondas moleculares, D -3883) se utilizó como trazador retrógrado. Cristales de dia fueron trasladados en el ganglio rhinophore con una multa Minuten pin. A raíz de la aplicación de tintes rhinophores fueron fijadas en formol al 4% en PBS e incubadas durante 7 días a 4 ° C. Embedding, seccionando y el doble etiquetado con yoduro de propidio se realizaron como se describe más arriba. Por último, las secciones se enjuagarse en PBS y montadas en PBS en diapositivas microscópicas.

Histología, Mallory de la mancha y la microscopia

Rhinophores fueron fijadas en Bouin la solución de fijación durante 2 días, se lava con etanol, embebido en resina de Spurr y seccionó en un plano frontal (6 μ m). Después de los procedimientos normales histológico, el plástico fueron teñidos después de que el método de Mallory (para más información [54]] en placa. Las secciones fueron lavadas con agua destilada, secado a la placa y montado en Entellan (Merck,. Darmstadt, Alemania). Las imágenes fueron tomadas con una cámara digital (Spotinsight Color, Vistron Systems, Puchheim, Alemania) montada sobre un microscopio (Zeiss Axiophot, Carl Zeiss GmbH, Jena, Alemania). El procesamiento de imágenes se realizó con CorelDRAW Graphics Suite (Corel Corporation, Ottawa, Ontario, Canadá).

Marcadores fluorescentes y los anticuerpos se visualizaron utilizando un láser de barrido microscopio confocal (Leica TCS SP). Glomérulos cuenta por el tramo se corrige con la doble contabilidad en rodajas adyacentes utilizando el método después de Weibel [55]. El procesamiento de imágenes se realizó con el siguiente software: Zeiss Image Browser (Zeiss GmbH, Jena, Alemania), Corel Photopaint y CorelDRAW Graphics Suite (Corel Corporation, Ottawa, Ontario, Canadá), y Adobe Photoshop (Adobe, San Jose, EE.UU.).

Fluorimétrica mediciones intracelulares de Ca 2 + niveles

Todos los experimentos fisiológicos se realizaron en la estación marina la isla de Helgoland. El rhinophores fueron disecados como se describe más arriba y cortar longitudinalmente utilizando una navaja fuego. El medio que contiene el ganglio se incubó durante 60 min a 4 ° C con ASW con 5 μ M Fura II acetoxymethylester (AM). Tras la eliminación de la incubación de amortiguación de la rhinophores se lavaron durante 10 min. Los cambios en fluorescencia fueron controlados con un sistema de procesamiento de imágenes (Visitron, Puchheim) y una cámara CCD montado en un microscopio invertido (Zeiss Axiovert 100) equipada con un objetivo UV (Zeiss NeoFluar 20X). Las distintas regiones dentro de la rhinophore ganglio se midió utilizando la "región" la función del software (Metafluor, Meta Imaging Series, Universal Imaging Corporation). Los cambios en la fluorescencia se obtuvieron mediciones de ratiometric con excitación a 340 nm y 380 nm de excitación. Los valores se presentan como los cambios relativos en los coeficientes que representan alteraciones en intracelulares de Ca 2 +-los niveles. Fluorescencia imágenes fueron adquiridas con un intervalo de 5 s y un tiempo de exposición de 50 ms por imagen.

Por el olor estimulación cámara de grabación (volumen 3 ml) fue montado en el microscopio etapa, y el flujo de baño se ajustó a 4 ml / min con una bomba peristáltica. El volumen de cámara se intercambió en menos de un minuto. Los aminoácidos, lo que indujo a la mayor respuesta en Pleurobranchea californica [32] fueron elegidos: alanina, arginina, glutamina, glicina, fenilalanina, metionina y valina. Aminoácidos (Sigma-Aldrich, Munich, Alemania) se aplicaron durante un minuto a varias concentraciones con el sistema de bomba peristáltica. En experimentos de control, la rhinophore ganglionares fue removido y tratados similares como el rhinophore no obtener respuesta a los aminoácidos. Cada aminoácido (1 M de existencias en cada una) fue disuelto en ASW final y las concentraciones oscilaron entre 2 μ M de 20 mm. Estímulo soluciones se prepararon inmediatamente antes de su utilización por la disolución de las respectivas existencias solución ASW en. Después de la aplicación de grabación de cámara se lava con ASW durante al menos 10 minutos para eliminar todos los aminoácidos, posiblemente, adjunta a la rhinophore. En la mayoría de los casos, 50 se midieron las regiones simultáneamente. Como control para la viabilidad de los preparativos del último estímulo al final de un experimento fue un alto K + estimulación de amortiguación (400 mM NaCl fue sustituido por 400 mM KCl), que siempre suscitó una fuerte reacción. Calcio-imágenes experimentos se realizaron con 25 (K +)-que responda rhinophores.

Autores de las contribuciones

UB y WR había la idea general para este proyecto y ha diseñado el neuroanatomical experimentos y neurofisiológica. AW realizó el etiquetado con los tintes fluorescentes y las mediciones fluorimétrica. MO hizo la histología. AW, WR y UB escribió el manuscrito.

Agradecimientos

Damos las gracias al grupo de buceo de Udo Schilling y Carsten Wanke (Helgoland) para la recogida de animales y el doctor Christoph Kleineidam (Würzburg) para la discusión crítica de los resultados experimentales.