Journal of Circadian Rhythms, 2006; 4: 7-7 (más artículos en esta revista)

Validación de un sistema de radar de microondas para el control de actividad locomotora en ratones

BioMed Central
Vittorio Pasquali (vittorio.pasquali @ uniroma1.it) [1], Eugenio Scannapieco (eugenio.scannapieco @ uniroma1.it) [1], Paolo Renzi (paolo.renzi @ uniroma1.it) [1]
[1] Dipartimento di Psicologia, Sezione di Neuroscienze, Università di Roma "La Sapienza", Via dei Sardi 70, 00185 Roma, Italia

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Resumen
Fondo

El general espontánea o la actividad motora de los animales es un marcador útil en la cronobiología. Modificado detectores de movimiento puede ser usado para vigilar los ritmos de actividad locomotora. Hemos modificado un comercial de microondas a base de dispositivo de detección validado y el dispositivo de grabación ultradian circadiano y ritmos.

Métodos

Los movimientos fueron detectados por el radar de microondas basada en el efecto Doppler. El equipo fue diseñado para detectar y registrar de forma simultánea 12 animales en jaulas separadas. Los radares estaban situados en la parte inferior de los mamparos de aluminio. Animal jaulas se coloca por encima de los mamparos. Los radares estaban conectados a un ordenador a través de una E / S digital bordo.

Resultados

El aparato fue evaluada por varias pruebas. La primera prueba puso de manifiesto la capacidad del aparato para detectar la frecuencia exacta de la norma objeto en movimiento. La segunda prueba demuestra la estabilidad en el tiempo de la sensibilidad de los radares. La tercera fue realizada por observaciones simultáneas de video-grabación de un ratón y las señales de radar. Se encontró que los radares son especialmente sensibles a las actividades que implican un desplazamiento de todo el cuerpo, en comparación con el movimiento de sólo una parte del cuerpo. En el cuarto ensayo, registramos la actividad locomotora de Balb / c mice. Los resultados estaban de acuerdo con los estudios publicados.

Conclusión

Detectores de radar pueden ofrecer control automático de un animal de la actividad locomotora en su casa sin jaula de perturbar la pauta de su comportamiento normal o iniciar el impulso de la exploración ocasionados por la transferencia a un nuevo entorno. La grabación dentro de las jaulas de cría permite estudios a largo plazo con el seguimiento ininterrumpido. El uso de ondas electromagnéticas que permite la detección sin contacto y la libertad de interferencia de estímulos externos.

Fondo

El general espontánea o la actividad motora de los animales es un marcador útil en la cronobiología. Dado que este tipo de investigación generalmente requiere una gran cantidad de datos procedentes de varias semanas de seguimiento, la utilización de sistemas automáticos es necesario.

Varios tipos de sistemas automáticos para medir la actividad locomotora de los roedores se pueden encontrar en la literatura: los más comunes son la actividad ruedas [1], capacidad de condensadores [2], efecto Doppler sistemas [3], stabilimeters [4], grabadoras de ultrasonido [5], touchplate grabadoras [6, 7], grabadoras de infrarrojos [8], vídeo-sistemas de seguimiento [9] y los sistemas de telemetría [10]. Evaluación crítica de los sistemas de seguimiento demuestra que deben cumplir los siguientes criterios: 1) el comportamiento que se registran deben estar claramente definidas, 2) la actividad del animal no debe verse afectado por la estructura del aparato de vigilancia; 3) la sensibilidad de los aparato debe ser uniforme en el espacio, 4) la técnica de grabación no debe ser intrusiva, 5) la vigilancia debe ser continua y automática, 6) la salida debe ser sin parar y fácil de analizar, de preferencia con una computadora; 7) el aparato debe tener un simple método de calibración de manera que su sensibilidad es replicable y estable en el tiempo, y 8), el aparato debe ser validado por comparación de su salida con la misma actividad registrada en otras palabras, de preferencia manual de grabación de las observaciones.

Radar basado en los sistemas de seguimiento han demostrado su eficacia en el estudio de comportamiento, tanto en animales muy pequeños como los insectos [11] y en pequeños mamíferos [12]. Los sistemas de radar tienen varias ventajas (para más detalles, ver [11]], especialmente la posibilidad de controlar al animal en su jaula de cría, que es muy importante en los estudios farmacológicos o en la investigación sobre factores de estrés.

El objetivo del presente estudio fue validar un aparato para el control y registro de actividad locomotora en ratones. El aparato se basa en un sistema de registro electrónico diseñado y probado por nuestro grupo de investigación [13], pero posteriormente sometido a una nueva serie de pruebas más riguroso. El aparato, llamado VIVARD-12, permite la supervisión general de la actividad motora de 12 ratones alojados individualmente en jaulas de cría estándar.

Métodos
Sistema electrónico para el registro de actividad locomotora

La actividad locomotriz del animal, se registra automáticamente por medio de microondas de radar basado en el efecto Doppler. Los sistemas de radar de microondas que opere a la frecuencia de 9,9 GHz (Mw-12, Lince Italia Srl), con una longitud de onda de alrededor de 3 cm. La sensibilidad es normalmente controlada por un recortador con un estrecho rango de regulación (22 kOhm). Hemos sustituido el componente con un 100 kOhm recortador para obtener una regulación más fina escala y de un mejor control de la sensibilidad del circuito. La alta frecuencia de las emisiones electromagnéticas producidas por el dispositivo de radar tiene una potencia de alrededor de 10 mW cm -2, lo cual no interfiere con el comportamiento del animal. El radar dispositivos estaban conectados a un ordenador a través de una E / S digital tarjeta (PIO-12, Keithley Instruments). La señal también fueron desviados a un indicador luminoso que señala el registro de movimiento con un impulso de +5 V CC. Un programa sencillo, escrito en lenguaje C (Micaloni, Renzi, Pasquali), leer continuamente los canales de I / O tarjeta. Todos los parámetros - frecuencia de muestreo de mseg 10-2000, intervalo de recogida de los datos dado (velocidad a la que cuenta el acumulado se guardan en el disco, en cuestión de segundos o minutos), la duración del experimento (minutos o días) - son fácilmente modificables a través de el programa. El número de dispositivos de radar apoyado por el ordenador está estrictamente depende del número de canales de I / O tarjeta. Los siguientes controles se llevaron a cabo: a) la interferencia entre radares adyacentes, b) fijación de la sensibilidad (76 kOhm - con este valor el radar sólo respondió a la circulación de todo el cuerpo y no a cualquiera de sus partes por sí solas), c) la medición del mismo número de movimientos, d) la estabilidad temporal de los ajustes, y e) la falta de señal de las emisiones en ausencia de movimiento. Todos los dispositivos de radar se crearon con la ayuda de un objeto mecánico con circulación normalizada.

Estructura del aparato

El aparato fue diseñado para la transmisión simultánea de vigilancia y grabación de 12 animales alojados individualmente. Cada dispositivo de radar se coloca en la parte inferior de una estructura de aluminio (17 × 36 × 40 cm) que apoya la jaula del animal, exhibió la radar dispositivo de posible interferencia de los radares cerca, y aseguró perfecta alineación de la jaula con respecto al área de cobertura del radar (Figura 1]. La alineación fue determinado por varios pedazos de madera adjunta a la estructura de aluminio. Las estructuras de aluminio se coloca en estantes de metal llano a aislar aún más los dispositivos de radar situado en diferentes niveles (Figura 2]. El radar dispositivos estaban conectados a la computadora de la tarjeta de adquisición de datos por un cable eléctrico multipolar (solo cable, 1 mm de diámetro) que se entrelazan para mejorar el blindaje contra los campos electromagnéticos.

El aparato fue evaluada por varias pruebas utilizando los dos objetos mecánicos con uniformes de circulación y los animales de laboratorio.

Prueba 1

El objetivo de la primera prueba era comprobar la capacidad del aparato y el posterior análisis de computadora para registrar la frecuencia exacta de movimiento de un objeto con circulación normalizada. Con este fin, hemos utilizado la segunda parte de un reloj cuya frecuencia fue el 1 º de circulación por minuto.

Materiales

Wellgain Un reloj de pared con la segunda parte fue ubicada en la parte superior de la estructura de aluminio, cuando la jaula del animal por lo general se presentó. Un reflector de radar que consiste en una pieza de aluminio (3 × 6 cm) se adjuntó a la de segunda mano. Una protección de aluminio con una ventana que corresponde a 1 / 4 de un giro completo se fijó en el frente de la zona de rotación de la segunda parte (Figura 3]. La ventana se coloca exactamente en la perpendicular de la grabación del radar de cono, por lo que la segunda parte fue visible (es decir, en movimiento) de tan sólo 15 segundos cada minuto. De esta manera, hemos obtenido un objeto con una frecuencia de circulación de una vez por minuto.

Procedimiento

Doce de 24 horas se realizaron las grabaciones, es decir, uno para cada dispositivo de radar. Los parámetros del software son: frecuencia de muestreo = 500 mseg, recogidos intervalo = 3 segundos, y la duración del experimento = 1440 minutos (1 día). Para cada serie de tiempo, los datos se acumularon en 30 seg papeleras. Análisis de Fourier se aplica para determinar la ritmicidad en la grabación.

Resultados y discusión

Todos los espectros mostraron un pico correspondiente a una frecuencia de 1 movimiento por minuto (Figura 4]. El poder del ritmo a menudo diferentes y otros rhythmicities se puede observar en los espectros. Esto podría haberse debido a la grabación del sistema, es decir, una pérdida de estabilidad de las mediciones de los aparatos de grabación. Sin embargo, es probablemente causado por el mecanismo de engranaje del reloj: no es muy precisa, tal vez han tenido diferentes fricciones e imprecisiones durante las rotaciones. Por lo tanto, llevamos a cabo una segunda prueba para evaluar la estabilidad temporal de la sensibilidad de los dispositivos de radar.

Prueba 2

Una característica fundamental de un sistema de vigilancia es la estabilidad en el tiempo, es decir, las mediciones deberá permanecer constante. La configuración del aparato no debe cambiar con el tiempo o con el uso. Por lo tanto, hemos diseñado una prueba para evaluar esta condición y volver a comprobar el espurio rhythmicities observó en la prueba 1.

Materiales

Para la segunda prueba, nos coloca WITTNER un metrónomo en la parte superior del aparato. Un reflector de radar que consiste en una pieza de aluminio (3 × 2,5 cm) se ha pegado a la cúspide del péndulo. La oscilación mínima metrónomo de la oscilación fue de 1 por segundo, es decir, 60 oscilaciones por minuto. Todo el metrónomo fue colocado en un contenedor de cartón, totalmente cerrada, excepto por un agujero cuadrado (3,5 × 3,5 cm) (Figura 5]. El agujero se enfrentan el radar, los periódicos y aprobación de la pieza de aluminio es visible a través del agujero.

Procedimiento

Se realizó 90 minutos de grabaciones para el 6 de los 12 dispositivos de radar. El software parámetros fueron: frecuencia de muestreo = 500 mseg, recogidos = intervalo de 30 segundos, y la duración del experimento = 90 minutos. Para evaluar la constancia en el tiempo de las grabaciones de cada dispositivo, hemos considerado como las grabaciones que consta de tres de 30 minutos de duración partes. Para el análisis de varianza de los datos, hemos considerado las tres partes de la grabación como las tres condiciones experimentales y los 30 segundos de grabaciones como la de casos aislados.

Resultados y discusión

No hubo diferencias significativas en el número de movimientos de contado en cualquiera de los casos. Esto indica que la sensibilidad de cada dispositivo de radar fue uniforme a lo largo de 90 minutos período (Cuadro 1].

Test 3

Después de las pruebas usando objetos con movimiento normalizado, hemos realizado pruebas de comportamiento con los animales. El objetivo era determinar qué tipos de movimientos el radar detecta eficazmente y para evaluar la sensibilidad del radar a las diferentes clases de movimiento.

Materiales

Dos ratones machos pertenecientes a los C57BL / 6 cepa (Charles Rivers Laboratorio, Calco, Como, Italia) fueron alojados individualmente en 369 × 156 × 132 (h) mm Plexiglas jaulas, con una luz: oscuridad (L: D) 12:12 fotoperíodo, una temperatura constante de 21 ° C, y el agua y la alimentación ad libitum.

Cada animal fue video-grabado con una Sony Handycam de vídeo situado 30 cm por encima de la jaula (Figura 6]. Un LED se conectó a los radares y se coloca en el campo de la vídeo pero fuera del campo visual del ratón. El LED de encendido cuando el radar registró movimiento.

Procedimientos

Cada animal fue video-grabado durante 8 horas. Desde la reproducción de vídeo, analizamos la actividad del ratón durante 1 minuto de cada 10 minutos durante un período total de 48 minutos. Las siguientes categorías de comportamiento se establecieron, y se determinó si el radar registró cuando el ratón les realizó:

• locomoción (caminar, correr, saltar);

• escalada (colgantes o escalada en los barrotes de la jaula, con dos o cuatro patas);

• excavación (el aserrín se traslada hacia adelante o hacia atrás con la cabeza o la frente extremidades);

• beber / comer / mordiendo la jaula (el animal está en posición vertical y lame la botella, mastica los alimentos, picaduras de los bares);

• aseo (roces, limpieza, lamiendo la cara, pelo, orejas, cola, genitales);

• aumento en dos piernas / descenso en los cuatro piernas;

• giro (rotación de la parte anterior del cuerpo, mientras que los dos restantes en las extremidades posteriores);

• amplios movimientos de la cabeza;

• estiramiento;

• arañar la piel con la parte frontal patas.

Las grabaciones fueron examinados independientemente por dos observadores.

Resultados y discusión

La observación de los animales "actividades simultáneas y la iluminación del LED mostraron que el radar dispositivos son muy sensibles a los movimientos que impliquen un cambio de todo el cuerpo (Tabla 2]. Las otras categorías de comportamiento se registró en un menor porcentaje de casos.

Prueba 4

En el cuarto ensayo, se registraron y analizaron la actividad locomotora de ratones cuyos parámetros del aparato locomotor han sido bien descritos, es decir, volumen de actividad, la duración del período circadiano, y la fuerza de la ritmicidad circadiana (indicado por la potencia espectral del período circadiano) .

Materiales

Hemos usado 10 de 8 semanas de edad de sexo masculino de los ratones Balb / c cepa (Charles Rivers Laboratorio; Calco, Como, Italia). Los ratones fueron alojados individualmente con los alimentos y el agua ad libitum, L: D 12:12 (luces encendidas 8-20), la temperatura de 21 ± 1 ° C y la humedad de 55 ± 5%.

Procedimiento

Los ratones fueron alojados individualmente en 369 × 156 × 132 (h) mm Plexiglas jaulas. Después de tres días, que comenzó el período de 28 días de grabación de vídeo: la primera semana en LD 12:12 y las próximas tres semanas en DD. Para el análisis de comportamiento, sólo se consideran los 7 días de LD 12:12 y durante los últimos 7 días en DD. Las grabaciones se llevaron a cabo en una prueba de sonido, aire acondicionado habitación.

El análisis de los datos

Todas las series de tiempo se detrended y tratados con una de tres puntos en movimiento significa procedimiento. La serie se tratan a continuación, analizó con transformada de Fourier discreta [14] para obtener información en el dominio de frecuencias. La salida del análisis de Fourier fue analizado con la prueba de Kolmogorov-Smirnov para la comparación con una distribución aleatoria de los picos. Para serie muy diferente de una distribución aleatoria (todos ellos), sólo con los picos de potencia superior a 2,88 desviaciones estándar de la media Posteriormente, se consideró significativo (p <0,001). Para estimar el período circadiano, que analizaron los datos con el periodograma de Sokolove y Bushnell [15], tal como se aplica por Refinetti [16], los períodos de prueba entre 20 y 26 horas. Los datos sobre el número de movimientos y la duración y potencia espectral de la circadiano período fueron probados por ANOVA.

Resultados y discusión

Se determinó el nivel de actividad de cada animal en términos de número de señales de contado por el software. Los ratones mostraron una diferencia significativa en la duración del período circadiano en LD y DD (23,98 vs 23,04 horas) [t (18) = 17,33, p <0,001]. Sin embargo, ni la potencia espectral del período circadiano (76,0 vs 47,4), ni la cantidad de actividad (139175 frente a 116815) diferían significativamente entre las dos condiciones, a pesar de que disminuyó en DD. Por último, análisis espectral demostró la presencia de ultradian ritmos con varios picos importantes en el rango de 1-8 horas y un pico principal a las 12 horas (Figura 7].

Estos resultados concuerdan con la literatura informa de que la Balb / c cepa tiene una endógeno, genéticamente determinado período circadiano que es inferior a 24,0 horas [17 - 19]. Los otros dos parámetros son también comparables a los reportados en la literatura, en particular la reducción de potencia espectral del pico circadiano en DD [19 - 21]. Por lo tanto, el sistema de vigilancia fiable puede registrar los diversos parámetros de actividad locomotora.

Conclusión

El objetivo de este estudio fue desarrollar un aparato que consta de una batería de sensores de radar para permitir la investigación de los ritmos de actividad del ratón. Además, queríamos volver a validar el sistema de control del aparato locomotor que nuestro grupo de investigación diseñado y validado desde hace varios años. El nuevo aparato permite la grabación más fácil de los animales por medio de una batería de los dispositivos de radar ubicado en elementos concretos y dispuestos en un pequeño espacio en relación con el antiguo sistema.

A diferencia del primer estudio de validación [13], las pruebas actuales no se basan en una comparación con otro aparato, sino sobre la capacidad del sistema de vigilancia para identificar las frecuencias y ritmos de movimiento de objetos con circulación normalizada. Por otra parte, llevamos a cabo pruebas con ratones pertenecen a cepas puras cuyos parámetros de comportamiento son genéticamente determinada y bien conocida, sobre todo la duración del período circadiano endógeno.

En general, nuestro sistema es capaz de registrar con exactitud la ritmicidad de objeto en movimiento en la prueba 1 y constante para desempeñar los cargos en el tiempo. Por otra parte, los resultados registrados por el comportamiento categorías de acuerdo con anteriores informes de "actividad locomotriz general" y de la actividad de los parámetros Balb / c cepa, en particular, el período circadiano es coherente con los resultados de muchos estudios en la literatura. Los ultradian periodicidad también son compatibles con los pocos datos que figuran en la literatura [22 - 29]. De hecho, el estudio de los ritmos ultradian parece ser especialmente difícil, ya que es necesario identificar a corto ritmos que tienen gran variabilidad por medio de algoritmos matemáticos, y el sistema de vigilancia no debe crear efectos de ocultación o influir en el comportamiento normal del animal. Por ejemplo, un instrumento de uso común, el funcionamiento de ruedas, tiende a afectar los patrones de actividad de roedores y debe ser considerada como un activo sistema de registro que oculta la estructura endógena de los ritmos expresadas por los animales, especialmente los ritmos ultradian [30].

Creemos que nuestro sistema de vigilancia es especialmente adecuado para el estudio de los ritmos de actividad en ratones. El uso de las ondas electromagnéticas no interfiere con el comportamiento del animal, los animales y puede dejarse en sus jaulas de cría, evitando así un cambio del medio ambiente y los cambios resultantes en la actividad exploratoria [31]. El sistema de registro computarizado permite también muy largo de seguimiento de los animales, la creación de series de tiempo continuo. Los archivos de datos se guardan automáticamente en el disco duro, lo que permite de inmediato el análisis de los datos.

Conflicto de intereses

El autor (s) declaran que no tienen ningún interés en competencia.

Autores de las contribuciones

VP y ES llevado a cabo los experimentos y preparó el proyecto inicial del manuscrito. PR supervisado los experimentos y produjo la versión final del manuscrito. El estudio fue concebido y planeado por VP. VP y ES contribuido igualmente a la obra. Todos los autores aprobó la versión final del manuscrito.

Agradecimientos

Damos las gracias al Dr Martina Migliore para sugerencias y asistencia técnica en la actividad de grabación de comportamiento y análisis estadístico. Damos las gracias al P. Fermani para las modificaciones en los circuitos electrónicos. Agradecemos a Marco Micaloni como contribución al programa que controla los dispositivos de radar.