Journal of Cardiothoracic Surgery, 2006; 1: 17-17 (más artículos en esta revista)

Efectos de médula ósea autólogo de células madre de trasplante en los receptores adrenérgicos beta-densidad y patrón de activación eléctrica en un modelo de conejo de la no isquémica la insuficiencia cardíaca

BioMed Central
Stefan Dhein (dhes@medizin.uni-leipzig.de) [1], Jens Garbade (jgmed93@hotmail.com) [1], Djazia Rouabah (djazia@web.de) [1], Getu Abraham (gabraham @ rz. uni-leipzig.de) [2], Fritz-Rupert Ungemach (ungemach@rz.uni-leipzig.de) [2], Katja Schneider (schneiderle@web.de) [1], Cris Ullmann (cris.ullmann @ t - online.de) [1], Heike Aupperle (aupperle@rz.uni-leipzig.de) [3], Jan Gummert Fritz (gumj@medizin.uni-leipzig.de) [1], Friedrich-Wilhelm Mohr (mohrf @ medizin.uni-leipzig.de) [1]
[1] Clínica de cirugía cardíaca, Centro del Corazón de Leipzig, la Universidad de Leipzig, Alemania
[2] Instituto de Farmacología, Farmacia y Toxicología de la Facultad de Medicina Veterinaria, Universidad de Leipzig, Alemania
[3] Instituto de Patología Veterinaria, Universidad de Leipzig, Facultad de Medicina Veterinaria, Alemania

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Resumen
Fondo

Dado que sólo se sabe poco sobre la terapia con células madre en la no-isquémica insuficiencia cardíaca queríamos saber si a largo plazo de mejora en la función cardíaca no isquémica, insuficiencia cardíaca puede lograrse de trasplante de células madre.

Métodos

White masculino conejos Nueva Zelanda, fueron tratados con doxorubicine (3 mg / kg / semana, 6 semanas) para inducir dilative no cardiomiopatía isquémica. Posteriormente, se obtuvo la médula ósea autólogo de células madre (BMSC) y se inyecta 1.5-2.0 millones de células en 1 ml de medio de infiltrarse en el miocardio a través de una toracotomía anterolateral izquierda en comparación con el simulacro que funcionan con conejos. 4 semanas más tarde intracardiaco contractilidad se determinó in vivo mediante un catéter Millar. Posteriormente, el corazón se extirpados y tratados para la gestión radioligand vinculante ensayos para detectar β 1 - y β 2-adrenérgicos densidad. Además, los niveles de catecolaminas en plasma fueron determinados a través de HPLC. En un subgrupo que investigó electrofisiología cardíaca mediante el uso de la cartografía de 256 canales.

Resultados

En doxorubicine animales tratados con β-adrenérgicos densidad fue significativamente las reguladas en ventrículo izquierdo y el septo, pero no en el ventrículo derecho, lo que indica un típico del ventrículo izquierdo insuficiencia cardíaca. Sham-operado conejos expuestos la misma baja regulación. Por el contrario, el trasplante de BMSC dado lugar a mucho menos los receptores adrenérgicos β-baja regulación en septum y ventrículo izquierdo. Contractilidad cardíaca se redujo significativamente en la insuficiencia cardiaca y la falsa que funcionan con conejos, pero fue significativamente mayor en BMSC corazones trasplantados. Norepinefrina y epinefrina los niveles plasmáticos fueron mayor en la insuficiencia cardiaca y la falsa que funcionan con los animales, si bien estos no eran diferentes de lo normal en BMSC animales trasplantados. Electrofisiológicos cartografía reveló inalterada electrofisiología y no muestran signos de arrhythmogeneity.

Conclusión

BMSC trasplante mejora sympathoadrenal dysregualtion no en la insuficiencia cardiaca isquémica.

Fondo

Transplante de células madre, en particular mesenquimales trasplante de médula ósea autólogo de células madre, está siendo objeto de debate a ser una posible alternativa al trasplante de corazón y pueden ser de interés terapéutico en la enfermedad isquémica del corazón [1 - 3]. El uso de médula ósea autólogo de células madre (BMSC) tiene la ventaja de no immunogeneity. Hasta ahora hay una serie de experimental [4 - 6] y también clínicas [7 - 11] estudios que demuestran efectos positivos de la terapia de células madre en la enfermedad isquémica del corazón. Sin embargo, actualmente sólo hay poco conocimiento sobre el uso de células madre autólogas en no cardiomiopatía isquémica. Por lo tanto, hemos decidido investigar el efecto de médula ósea autólogo de células madre de trasplante en doxorubicine inducida no miocardiopatía isquémica en conejos mediante la infiltración directa epicárdicos para la entrega.

Un problema especial con la evaluación de esa terapia es obtener una impresión de la mejora a largo plazo en la hemodinámica y en la regulación sympathoadrenal. Por lo tanto, ecocardiografía y otros métodos proporcionan una medida de la contractilidad aguda en el momento de la investigación, pero no permiten una visión de la sympathoadrenal dysregulation típico para la insuficiencia cardíaca [12] o su posible normalización de la terapia. La idea de nuestro estudio fue evaluar el efecto de la terapia de trasplante BMSC en no-isquémica insuficiencia cardíaca de medición de la contractilidad y β-adrenérgicos utilizando densidad (-) - 125 [I]-iodocyanopindolol radioligand vinculante ensayo: es sabido que mucho corazón fracaso conduce a la activación compensatoria de sympathoadrenal sistema con una mayor liberación de catecolaminas y baja regulación de cardiaca β 1-adrenorreceptores [13, 14], que se correlaciona con la severidad de la enfermedad [15, 16], que afecta principalmente β 1 -- mientras que adrenorreceptores β 2-adrenorreceptores permanecido inalterado en la mayoría de los estudios [17] y, por último, resultando en una disminución de los receptores adrenérgicos β-densidad. Resto de β-adrenorreceptores están insensibilizados, probablemente su mayor parte a través de la proteína G-receptor acoplado quinasas (GRK2 y / o GRK5) [17 - 22] y, en cierta medida a través de las vías de participación de PKA [23]. La baja regulación de los receptores adrenérgicos β-número que evaluó a través de radioligand vinculante estudios refleja la gravedad de la insuficiencia cardiaca crónica [14]. Esto también vale para los conejos que sufren de insuficiencia cardíaca crónica [24].

El tratamiento de la insuficiencia cardiaca crónica con el β-bloqueante metoprolol resultados en la mejora hemodinámica y sobre regulación de los receptores adrenérgicos β-densidad [25, 26]. El proceso de β-adrenérgicos baja regulación en la insuficiencia cardiaca crónica toma días o semanas y el alcance de esta reducción en los receptores adrenérgicos β-número está directamente relacionada con la gravedad de la insuficiencia cardíaca [13, 14, 27], por lo tanto, lo que refleja la larga plazo situación hemodinámica. Inversamente, una terapia eficaz de la insuficiencia cardíaca deberían llevar a una mejor contractilidad y, en consecuencia, una reducción de la insuficiencia cardíaca inducida por el aumento en los niveles de catecolaminas y, por último, una palabra clave (parcial) normalización de los receptores adrenérgicos β-densidad. Por lo tanto, hemos decidido para medir los receptores adrenérgicos β-densidad, la contractilidad y los niveles de catecolaminas en condiciones normales de conejos, doxorubicine inducida no miocardiopatía isquémica con o sin trasplante autólogo BMSC o simulacro de operación.

Métodos

El estudio se realizó de acuerdo a las leyes alemanas para la salud animal y la protección de declaración y fue aprobado por las autoridades locales, el Gobierno de Leipzig (Reg.-Nr.: 24-9168.11-11/03). Se utilizó varones blancos conejos Nueva Zelanda, de 1500-2000 g de peso corporal (al inicio del estudio) (convencional, normalmente alimentadas ad libitum) (Charles River, Kisslegg, Alemania).

Modelo animal y la investigación de la contractilidad

La insuficiencia cardíaca fue inducida por la inyección iv repetidas doxorubicine de 3 mg / kg / semana durante 6 semanas, seguido de un 14 días doxorubicine-intervalo libre. Los animales que sobrevivieron a 2 semanas después de la inducción de la insuficiencia cardíaca fueron asignados al azar a ningún tratamiento, operación o simulado BMSC trasplante. Después de la anestesia intramuscular con ketamin (50 mg / kg) y xylazina (5 mg / kg), mesenquimales obtenidas autólogo de médula ósea células madre a partir de una punción fémur, la aislados de células madre mononucleares fracción, y después de subcultivos durante 4 días (véase más adelante) , Las células madre se inyectaron directamente en la pared del ventrículo izquierdo. Para el trasplante de conejos fueron anaestetized (0,8% vol isofluran, véase el protocolo [28]. Toracotomía izquierda a través del espacio intercostal y se realizó el ventrículo izquierdo estaba expuesta. BMSC O (1,5 - 2,0 millones de células en 1 ml) o medio (1 ml) se inyectó a las 4 posiciones en el tejido de la pared libre lateral del ventrículo izquierdo en una forma circular con una jeringa de 1 ml en 2 minutos.

28 días después de la operación, los animales fueron sometidos a la prueba final. Una hora antes de la cirugía (la anestesia, tal como se describe más arriba), recogidos 2 ml de sangre venosa en EDTA monovettes potasio (con adición de 1 μ M glutatión / ml de plasma) de los conejos después de al menos 30 minutos en reposo para la determinación de catecolaminas plasmáticas. Después de centrifugación (600 g/10 min / 4 ° C), el plasma se ha retirado, rápidamente congelados en nitrógeno líquido, y se almacenan a -80 ° C hasta su posterior utilización. Hemos introducido un catéter Millar diseñado para conejos (FMI, Alemania) a través de la arteria femoral y la presión registrada volumen bucles bajo la influencia de 1,5 μ g / kg de dopamina, con el fin de evaluar la función contráctil. dP / dt max y dP / dt min se determina a partir de estas mediciones. Posteriormente, se ha eliminado el corazón de la cartografía y los experimentos de ensayo radioligand vinculante. Tras el experimento, el tejido fue inmediatamente colocado en cardioplegic solución. Ventrículo izquierdo, septum y ventrículo derecho fueron extirpados y luego los golpes congelados.

Se investigaron 4 grupos de conejos: los animales sanos de control (n = 10), doxorubicine inducida por la insuficiencia cardíaca (n = 6), doxorubicine inducida por insuficiencia cardíaca con operación simulada (n = 8), y doxorubicine inducida por insuficiencia cardíaca con células madre tratamiento (n = 14). Durante las investigaciones y las evaluaciones posteriores experimentators fueron cegados.

De células madre de purificación y subcultivos

En condiciones estériles que obtuvo 1,5 - 2 ml de médula ósea en 2 mM EDTA que contiene tampón fosfato salino (PBS) de un fémur punción. La mezcla fue centrifugada a 300 g, a temperatura ambiente (RT), 5 min, y el pellet resultante fue resuspendido en PBS que contenía 2 mM EDTA, y separados en un Ficoll (1,073 g / ml) gradiente de densidad de centrifugación (suspensión celular : Ficoll: 1,5: 1,0, 30 min centrifugación a 500 g, RT). La fracción mononucleares interfase se recogerá, lavado dos veces en PBS / EDTA. El final precipitado fue resuspendido en 12 ml Dulbeccos Modefied Eagle Medium (DMEM) un medio de cultivo celular (+ 10% suero fetal de ternera, 100 U / ml de penicilina, 100 μ g / ml estreptomicina, 37 ° C, 5% CO 2) y semillas en recubiertos de gelatina petridishes. Para las primeras 24 horas se incubaron las células con otros 10 μ M de 5 azacytidine. Las células se cultivaron durante 4 días. Un medio de cultivo celular fue cambiado cada 48 h, y no adherente hematopoetic células fueron descartados. Antes de que el trasplante de células fueron separadas con tripsina / EDTA, y se incubaron con 2,5 μ M Vybrand DiI células solución de etiquetado (sondas moleculares) para 0,5 horas de la luz en la incubadora a 37 ° C seguido de 3 pasos de lavado en PBS. Por último, las mesenquimales derivados mononucleares c-kit positivo médula ósea células madre (usando una prueba comercial anti-c-kit de anticuerpos) se suspendieron en DMEM inyectable (1.5-2.0 millones. Células en 1 ml).

Radioligand vinculante estudio

β-adrenorreceptores fueron evaluados por (-) [125 I]-iodocyanopindolol (ICYP) vinculante ensayo descrito en otra parte [29]. Brevemente, las muestras de tejidos de ventrículo derecho, ventrículo izquierdo y el septum se homogeneiza en 10 volúmenes de helado 1 mmol / l KHCO 3 con una Ultra Turrax (Janke y Kunkel, Staufen, Alemania), diluida a 20 ml con 1 mmol / l KHCO 3, se centrifuga a 500 g durante 10 minutos, pasado a través de 4 capas de cheesecloth, y se centrifuga de nuevo a 50000 g durante 20 min. "Pellets" se lavaron una vez y por la resuspensión recentrifugation y finalmente resuspendido en buffer de incubación (Tris-HCl 10, NaCl 154, ácido ascórbico 0,55 mmol / l, pH 7,4, 25 ° C) a una concentración de proteínas de 0.1-0.2 mg / ml. El contenido de proteína se determinó por el método de Lowry usando albúmina sérica bovina como estándar.

La densidad de β-adrenorreceptores de la función cardiaca membranas fue determinado por (-) [125 I] ICYP vinculante en seis concentraciones que van desde 5 a 200 pmol / l, según se detalla en otra parte [29]. Unión no específica de ICYP se definía como unión a las membranas que no puede ser desplazada por una alta concentración de la no selectivo β-antagonista de los receptores adrenérgicos (±) CGP 12177 (1 μ mol / l). Vinculantes específicos se definió como menos vinculantes total de uniones no específicas y por lo general era de aproximadamente 70-80% a 50 pmol / l ICYP.

Para determinar las cantidades relativas de β 1 - y β 2-adrenorreceptores, las membranas fueron incubadas con concentraciones crecientes de la β2-antagonista de los receptores adrenérgicos ICI 118551 (10 -10 - 10 -4 M) y una concentración constante de ICYP (100 pmol / l ), Y el específico vinculante evaluarse como se ha descrito anteriormente (utilizando CGP12177). Encuadernación curvas se analizaron mediante el ajuste de curvas iterativo programa GraphPadPrism (GraphPad Software, San Diego, CA, EE.UU.).

Alta presión Lquid cromatografía (HPLC)

Plasma noradrenalina se evaluó el contenido de alta presión, cromatografía líquida (HPLC) y detección electroquímica [30] mediante un ensayo comercial HPLC (Chromsystems, Martinsried, Alemania), basado en el protocolo de Goldstein [31] y de Hjemdahl et al. [32]. En pocas palabras, las catecolaminas son adsorbidos en aluminiumoxide (preenvasados en las columnas; Chromsystems, Martinsried, Alemania) por agitación 1 ml de plasma con 0,5 ml de tampón de extracción (Tris-buffer) y aluminiumoxide durante 10 min. Como patrón interno 600 pg dihydroxybenzylamine se han añadido a la muestra de plasma. Después de 10 minutos, la sonda se lavan dos veces y el lavado de amortiguación se ha retirado. Posteriormente, los sujetos catecolaminas y patrón interno se eluye utilizando 120 μ l de buffer de elución (Chromsystems, Martinsried, Alemania) y la filtración (en 700 g). 40 μ l de volumen sonda se inyectaron en un flujo de 1 ml / min (HPLC autosampler (GINA50) y bomba (P580): Gynkotec, Germering, Alemania; fase móvil 5001; Chromsystems, Martinsried, Alemania) en un pre-equilibrio RP18 columna ( Chromsystems, Martinsried, Alemania). El sistema HPLC fue controlado por el Chromeleon software 4.10 (Gynkotec, Germering, Alemania). Las catecolaminas se detectaron utilizando un detector electroquímico (DECENIO; celda de flujo: VT-03; Fa. Antec comp., Leiden, Países Bajos) (un grupo de trabajo potencial de 0,55 V dado señales máximo con el menor ruido). Un estudio externo de calibración estándar con 5 ng / ml noradrenalina, 5 ng / ml dihydroxybenzylamine, 2,5 ng / ml de adrenalina y 2,5 ng / ml de dopamina también se utilizó para cada experimento. Cada muestra fue inyectada tres veces y la concentración se determinará como el promedio de estas tres detecciones.

Histología

Muestras de tejidos de los corazones fueron embebidas en parafina y 5 μ m secciones de los corazones estaban manchadas de rojo picrosirius de acuerdo a protocolos estándar. Usando microscopía de fluorescencia que hemos identificado la BMSC o sus restos de Vybrand-DiI-fluorescencia de color rojo y contó el número de estos BMSC (o sigue siendo) por campo visual en 200 x magnification. Por otra parte, buscamos signos de inflamación, es decir, leucocitos / infiltración de linfocitos.

Cartografía de los experimentos

Con el fin de investigar, si BMSC inyección podría producir inhomogeneidades en la activación eléctrica cardiaca patrón o autonómica áreas, hemos presentado 4 corazones de cada grupo a epicárdicos cartografía tal como está descrita anteriormente [33]. En pocas palabras, los conejos fueron anaesthetized de isoflurano, el corazón fue eliminado y preparados de acuerdo a la técnica de Langendorff (presión constante: 70 cm H2O, la perfusión con solución Tyrode (+ 161,02 Na, K + 5,36, Ca + + 1,8, Mg + + 1,05, Cl - 147,86, HCO3 - 23,8, PO4 2 - 0,42 y 11,1 mM de glucosa, equilibrado con un 95% de O2 y 5% de CO2 (pH = 7,4), la temperatura de la superficie del corazón fue de 37 ° C). Los corazones, que fueron las palizas a su tasa espontánea, se conecta a un canal de 256 sistema de cartografía HAL4 (Ing. Pedro Buero Rutten, Hamburgo, Alemania, la resolución temporal: 20 kHz por canal; amplitud de resolución: 0,04 mV, interchannel acoplamiento <-60 decibelios; ancho de banda de la sistema: 0,5 Hz - 100 kHz, los datos no son filtrados), tal como se describe anteriormente [33]. 256 AgCl electrodos (1 mm interelectrodes distancia), que se adjunta al corazón en una superficie elástica, de modo que puedan seguir los movimientos del corazón fácilmente sin dislocación. Los cuatro placas se encuentra en (a) la pared derecha (64 canales) (b) la pared frontal (64 canales) (c) la pared izquierda (64 canales) y (d) la pared trasera (64 canales ), A fin de que ambos ventrículos fueron asignadas con un total de 256 electrodos. Activación y tiempo de repolarización de puntos en cada electrodo se determinaron como t (DU / dtmin) o t (du / dt máximo), respectivamente [33 - 35]. Después automática determinación de activación y repolarización timepoints fueron verificadas (o corregido si fuera necesario) manualmente por el experimentator. activación total del tiempo (TAT, [m]) se calculó como la demora entre la activación de la primera y la activación de la última electrodo. Desviación estándar de activación veces (SD (ACT)) se utilizó como una medida para inhomogeneity local. Para cada electrodo de activación de recuperación de intervalo (IRA, lo que refleja epicárdicos potencial de duración) se calculó. Inhomogeneity del ARI se analizó el cálculo de la desviación estándar de las infecciones respiratorias agudas en 256 electrodos (= ARI-dispersión).

Estadísticas

Todas las variables continuas se presentan como medios ± SEM de n experimentos. Los datos experimentales a β-adrenorreceptores fueron equipados y analizada por asistido por ordenador iterativo no lineal de regresión utilizando el programa GraphPadPrism (GraphPAD Software, San Diego, CA, EE.UU.). Significación estadística de las diferencias fue analizada por unpaired dos colas de la t de Student o prueba, si procede, de medidas repetidas ANOVA seguido por t-test de Bonferroni utilizando las correcciones para comparaciones múltiples. P <0,05 fue considerado para indicar una diferencia significativa. La evaluación estadística se realizó mediante el programa SYSTAT (Systat Inc, Evanston, IL, EE.UU.).

Productos Químicos

CGP12177, ICI118, 551 fueron de Sigma (Taufkirchen, Alemania), (-) [125 I] iodocyanopindolol (ICYP, actividad específica: 2200 Ci / mmol) (Perkin Elmer, Boston, MA, EE.UU.), todas las demás sustancias químicas fueron de la disponible comercialmente puro grado y obtuvieron de Sigma.

Resultados

Hemos encontrado saturable ICYP obligatorio en la membrana de los preparativos de todos los corazones. Inespecíficos fue vinculante por debajo del 20% del total vinculante en el K D (por ejemplo, se da en la fig. 1, panel superior). Específicas vinculante puesto de relieve diversas β-adrenérgicos en las densidades de ventrículo izquierdo, septum y ventrículo derecho con valores más bajos en el ventrículo derecho (fig. 1]. El desplazamiento de ICYP de ICI 118551 monofásica reveló una competencia y una curva de casi indetectable β 2-adrenérgicos población (fig. 2].

En cuanto a los efectos de la enfermedad y el tratamiento, encontramos significativa baja regulación de los receptores adrenérgicos β-densidad en la insuficiencia cardíaca no tratada, en comparación con el control (fig. 3]. Esta baja regulación fue atenuada en BMSC de los animales tratados (fig. 3]. En simulacro de animales operados con la inyección de vehículo, sin embargo, hemos encontrado casi la misma baja regulación como en su defecto corazones (fig. 4]. El β-adrenérgicos baja regulación en su defecto corazones se acentuó en el septum y ventrículo izquierdo (fig. 4]. La mayoría curiosamente, en su defecto los corazones que reciben el trasplante BMSC β-adrenérgicos baja regulación fue significativamente atenuada en el septum y ventrículo izquierdo en comparación con el simulacro no funciona corazones (fig. 4]. β-adrenérgicos densidad era casi normalizado en el septo de BMSC tratados corazones y mejora de forma significativa en el ventrículo izquierdo (en comparación con el simulacro operado de corazones), aunque todavía por debajo del nivel normal (fig. 4]. K D fue similar entre todos los grupos de afinidad, indicando sin cambios (en la leyenda de la fig. 4].

En cuanto a las concentraciones plasmáticas de catecolaminas por HPLC reveló clara y nítida picos de noradrenalina, adrenalina y patrón interno (fig. 5, panel A). En conejos con insuficiencia cardíaca no tratada se encontraron significativamente mayor norepinefrina y epinefrina niveles (fig. 5, panel B). Lo mismo vale para los conejos que sufren de insuficiencia cardíaca que reciben simulacro de operación. Por el contrario, en los conejos con insuficiencia cardiaca tratados con trasplante BMSC norepinefrina y epinefrina los niveles plasmáticos fueron significativamente más bajos que en no tratados o simulado que funcionan con conejos (fig. 5, panel B).

De acuerdo con estos resultados, invasoras en vivo de la contractilidad pruebas con catéter Millar reveló mejorado de forma significativa la contractilidad en los animales tratados BMSC (véase el cuadro 1]. Por lo tanto, dP / dtmax y dP / dtmin bajo estimulación con 1,5 μ g / kg de dopamina se redujo en gran medida en los corazones y no simulado-no funcionan los corazones, mientras que en su defecto corazones BMSC que recibió el trasplante de este parámetro fue significativamente mayor (véase el cuadro 1]. Correlación de Pearson de los receptores adrenérgicos β-densidad y la contractilidad (dP / dt máximo) ha puesto de manifiesto una correlación significativa con R 2 = 0,887 y p <0,05.

Histológico de investigación de los corazones se encontraron intactas 2-3 células / campo visual (ampliación a 200 x) y algunos restos que muestran Vybrand DiI fluorescencia de color rojo en BMSC corazones tratados en las proximidades de la inyección de marcas, pero no en simulacro de accionamiento o el control de corazones . Sin embargo, estas pocas células se encontraron sólo en una estrecha vecindad de la inyección. En esa zona también se detectaron células teñidas de rojo fluorescente detritus (fig. 6]. No se observan claros indicios de una respuesta inflamatoria, tales como leucocitos o la infiltración de linfocitos. Sin embargo, en la mayoría de normal, a falta de tratados corazones y una leve fibrosis intersticial se observó (fig. 6], que fue ligeramente más expresó su defecto en todos los corazones. En el sitio de la inyección, se observó una cicatriz fibrótica (fig. 6]. En todos los animales que sufren de insuficiencia cardíaca el peso corporal se redujo y el corazón peso / peso corporal proporción se incrementó. No hubo diferencias significativas entre los grupos de la insuficiencia cardíaca (tabla 1].

En lo que respecta al subgrupo de los corazones que se sometió a experimentos de mapeo, hemos encontrado regularmente con palizas corazones inalteradas propagación de la activación cardíaca frente de onda (fig. 7]. El total de tiempo de activación (TAT) no fue diferente entre los grupos así como la desviación estándar de los tiempos de activación en los 256 electrodos, lo que refleja la inhomogeneity del proceso de activación (cuadro 2, fig. 7]. Por lo tanto, inhomogeneity del proceso de activación no era mayor de BMSC trasplante. La activación de recuperación de intervalos (IRA) no fueron cambiadas por BMSC versus inyección simulada que funciona con los animales y la dispersión de las IRA también no fue modificado (cuadro 2]. Nunca hemos observado espontáneamente despolarizante zonas en los ventrículos o arritmia sostenida. La única conclusión fue que, en su defecto corazón todos los grupos IRA fue algo prolongado, pero sin alcanzar el nivel de significación.

Discusión

Los resultados de nuestro estudio muestran claramente-a lo mejor de nuestro conocimiento por primera vez-una mejora-y según la evaluación de los receptores adrenérgicos β-densidad-largo plazo la mejora de la función hemodinámica cardíaca autólogo de médula ósea mesenquimales transplante de células madre en un modelo de no cardiomiopatía isquémica. Pathophysiologically los resultados pueden ser explicados por la hipótesis de que doxorubicine inducida por insuficiencia cardiaca da lugar a la liberación compensatoria catecolamina (ver fig. 5, grupo B), que a su vez conduce a los receptores adrenérgicos β-baja regulación (ver fig. 4]. Se sabe que los cambios en los receptores adrenérgicos β-densidad como consecuencia de alteración en los niveles de catecolaminas o β-bloqueantes en insuficiencia cardíaca crónica mayoría necesidad días o semanas para desarrollar por estar relacionados con la severidad de la enfermedad [13, 14, 25 - 27, 36]. Si de acuerdo a estos estudios una terapia de la insuficiencia cardíaca es hemodynamically eficaz, uno tiene que asumir la catecolamina que la liberación debe disminuir y β-adrenérgicos hacia una mayor densidad de los valores normales. Esta misma cuestión puede ser demostrado con los datos de este trabajo muestran una normalización de los niveles de catecolaminas y β-adrenérgicos densidad junto con la mejora de la contractilidad BMSC después del trasplante. Como se ha demostrado que la normalización de los receptores adrenérgicos β-densidad de las necesidades de plazos más largos con la mejora de la hemodinámica [25, 26], suponemos que estos resultados indican una mejora a largo plazo de la función cardíaca de BMSC trasplante dentro de las limitaciones de este modelo. La positiva y significativa correlación entre los receptores adrenérgicos β-la densidad y la contractilidad (R 2 = 0,887, p <0,05) apoya la hipótesis de una relación entre estos dos parámetros. Un punto vale la pena debatir es la conclusión de que los efectos de BMSC trasplante son más pronunciadas en el septum que en el libre pared del ventrículo izquierdo: la BMSC fueron inyectados a la libre pared del ventrículo izquierdo en 10 sitios. Cada inyección produce una cicatriz (fig. 6] en el sitio de inyección. En un pequeño corazón como el corazón de conejo 4 inyecciones y las cicatrices resultantes aumentará la cantidad de tejido fibroso, que no se produzcan en el septo, ya que no hay inyecciones hecho debido a razones técnicas de la operación. Las cicatrices y el consiguiente cambio en la composición de tejidos a la izquierda libre muro puede eclipsar en parte los efectos de BMSC trasplante en los receptores adrenérgicos β-densidad, que puede ser mejor visto en la no-inyectada septo, si la situación hemodinámica del paciente es mejor.

En cuanto a la relación entre los niveles de catecolaminas y β-adrenérgicos y la densidad de la contractilidad, es difícil decir qué es primero. Uno puede especular, que la mejora de la situación hemodinámica del paciente no debe dar lugar a disminución de los niveles de catecolamina, y que esto llevaría a la atenuación de los receptores adrenérgicos β-baja regulación. Sin embargo, también es posible que el trasplante de BMSC-principalmente conduce a una mayor β-adrenérgicos o atenuados densidad baja regulación posiblemente por un efecto paracrinos, que debería entonces análoga a un beta-bloqueante tratamiento de conducir a una mejor situación hemodinámica.

Numerosos estudios mostraron efectos positivos de BMSC trasplante en la cardiopatía isquémica o infarto agudo de miocardio (por ejemplo, [4, 8, 11]], bien por infiltración directa o por intracoronaria de células madre de inyección (para una revisión reciente ver [1]]. Se ha supuesto que la isquemia conduce a la expresión todavía desconocidas de la vivienda de los factores de atracción de las células madre [37]. En no miocardiopatía isquémica no está claro si la vivienda de tales factores existen y, por lo tanto, hemos decidido utilizar la infiltración directa de miocardio BMSC técnica de aplicación. La conclusión de que sólo encontramos BMSC o de sus restos mortales cerca de la inyección habla algo en contra de un papel predominante de la vivienda de los factores en este modelo de no miocardiopatía isquémica aunque en el caso de una declaración final sobre este punto (que no era el foco de nuestro estudio ) Por ejemplo, experimentos con intracoronaria solicitud será necesario. Sin embargo, nuestros datos actuales la primera evidencia de la eficacia del trasplante en BMSC no cardiomiopatía isquémica.

En cuanto a los mecanismos subyacentes de BMSC trasplante está en marcha un debate discutir factores como angiogenetic efectos, transdifferentiation, fusión celular y la liberación de factores paracrinos [1, 38]. En primer lugar, la falta de efecto de la inyección de medio de comunicación (véase el simulacro que funcionan con animales) demuestra que no es el trauma de la operación de inyección y, por otra parte, una hipótesis que podría BMSC la inyección podría inducir una respuesta inflamatoria (aunque son las células autólogas ). Sin embargo, no tenemos ninguna indicación de un inflamatoria de linfocitos o la infiltración de leucocitos del miocardio ventricular, lo que claramente está en contra de la hipótesis de una inflamación inespecífica. Por otra parte, el simulacro operado corazones también se les inyectó medio, pero no muestran ni la respuesta inflamatoria ni efecto terapéutico. Una de miocardio transdifferentiation de BMSC, una hipótesis amplia adelante, por ejemplo, por Tomita et al. [4] y otros [5, 39], no puede descartarse por completo, pero con 2-3 células / campo visual en 200 x aumento y sólo en las proximidades de la inyección) no tenemos ninguna indicación de una cantidad de células en transdifferentiation ( o incluso estar presentes ya que son), que sería lo suficientemente grandes como para explicar el contráctil y la mejora hemodinámica. Por el contrario, uno podría imaginar que las células inyectadas liberación factores paracrinos, aún desconocido (o véase más arriba), que causa una respuesta de los tejidos circundantes de miocardio (incluidos todos los tipos de células) se harán cargo de este proceso. Los estudios futuros tendrán que ser dirigidas a la investigación de esta hipótesis y la identificación de posibles efectos paracrinos, si las existentes.

En cuanto a la seguridad de BMSC trasplante de los resultados obtenidos con esqueleto myoblasts indican un posible riesgo de arrhythmogenic terapia celular [40 - 42], a fin de que una investigación más a fondo parece ser necesario. Por lo tanto, decidimos investigar un subconjunto de los corazones por medio del mapeo de potenciales epicárdicos. Se verificaron el número de epicárdicos breakthroughpoints, buscó arrhythmogenic focos y signos de inhomogeneity tales como retraso en la activación o el aumento de la dispersión. Ninguno de estos parámetros es diferente en BMSC corazones trasplantados de corazón no sin terapia. Esto no excluye completamente arrhythmogeneic efectos de esta terapia en otras (en particular, más adelante) las fases de la terapia, pero estos resultados muestran que al menos después de 4 semanas no autónomo o zonas no excitables zonas (de más de 0,5 mm 2) se han visto empujados de la terapia. Tomando el bajo número de células supervivientes en cuenta esto parece razonable. De este modo, con todo cuidado, tenemos en la actualidad ninguna indicación de un efecto arrhythmogenic de trasplante autólogo BMSC no en la miocardiopatía isquémica dentro de las limitaciones de este modelo.

Conclusión

El mecanismo por el cual el trasplante de células madre conduce a la mejora de la función cardíaca es aún incierto y es necesario emprender nuevos estudios sobre la manera de dilucidar esta cuestión. El pequeño número de sobrevivientes BMSC en nuestro estudio está a favor de la hipótesis de efectos indirectos, como por ejemplo efectos paracrinos. Nuestros datos muestran claramente una mejora a largo plazo en la función cardíaca autólogo de células madre en terapia no miocardiopatía isquémica, por lo cual nos permite concluir que este podría ser un interesante nuevo enfoque terapéutico para el tratamiento de no cardiomiopatía isquémica.

Conflicto de intereses

Los autores declaran que no tienen intereses en conflicto.

Autores de las contribuciones

Stefan Dhein tuvo la idea del estudio, realizado el análisis de datos, estadísticas, gráficos, y escribió el documento. Jens Garbade hizo la cirugía en los animales, aisladas y caracterizadas las células madre, y se lleva a cabo investigaciones de la contractilidad; Enero Fritz Gummert y Friedrich-Wilhelm Mohr, ayudado con las técnicas quirúrgicas y añadió importantes observaciones al documento; Djazia Rouabah, Getu Abraham , Y Fritz-Rupert Ungemach realizó la radioligand vinculante estudios y analizado las curvas de carácter vinculante.

Katja Schneider realiza la anestesia de los animales y el postoperatorio cuidado de los animales. Cris Ullmann ha desarrollado el software para el volumen de bucles presión análisis y analizado estos datos, Heike Aupperle histológico realizado todos los trabajos en los corazones, y analizado el número de células sobrevivientes de las células madre.

Agradecimientos

Este estudio fue generosamente apoyada por una beca de la Deutsche Stiftung für Herzforschung dado a Stefan Dhein.