BMC Neuroscience, 2006; 7: 48-48 (más artículos en esta revista)

Anti-apoptóticos y efectos neuroprotectores de Tetramethylpyrazine la médula espinal después de la isquemia en los conejos

BioMed Central
Li-Hong Fan (drfan2140@163.com) [1], Kun-Zheng Wang (drwangkz@eyou.com) [1], Bin Cheng (drchengb@eyou.com) [1], Chun-Sheng Wang (drwangcs @ eyou.com) [1], Xiao Qian-Dang (drdangxq@eyou.com) [1]
[1] Departamento de Ortopedia, Hospital Segunda Afiliadas Xi'an Jiao Tong University, Xiwu Road, Xi'an, Shaanxi, 710004, China

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Resumen
Fondo

Tetramethylpyrazine (PGT) es uno de los más importantes ingredientes activos de una hierba china Ligusticum wallichii Franchat, que se utiliza ampliamente en muchos tratamientos de trastornos de isquemia. Sin embargo, el mecanismo exacto por el cual TMP protege la médula espinal isquemia / reperfusión (I / R) perjuicio es aún desconocido. Con este fin, los conejos fueron divididos aleatoriamente en simulacro de grupo, grupo control y grupo de TMP. Después de la evaluación de la función neurológica, las médulas espinales fueron inmediatamente retirados de bioquímica y análisis histopatológico. La apoptosis se midió cuantitativamente por la terminal transferasa UTP nick de fin de etiquetado (TUNEL) método y confirmado por el examen microscópico de electrones, la expresión de Bax y Bcl-2 se immunohistochemically evaluados y cuantificados a través de Western blot.

Resultados

Los resultados neurológicos en el grupo de TMP-fueron significativamente mejores que los del grupo control (P <0,05). TMP disminuyó la médula espinal malondialdehido (MDA) y mejorado los niveles en la regulación de la médula espinal superóxido dismutasa (SOD). TMP redujo significativamente la pérdida de motoneuronas y TUNEL-positivas. Mayor Bcl-2 y Bax expresión atenuada se encontró en el PGT el tratamiento de conejos.

Conclusión

Estos hallazgos sugieren que ha TMP efectos protectores contra la médula espinal de I / R perjuicio de la reducción de la apoptosis a través de la regulación de Bcl-2 y Bax expresión.

Fondo

La médula espinal isquemia / reperfusión (I / R) pueden presentar lesiones inmediato o paraplejia que se produce el 4% y el 33% de los pacientes sometidos a cirugía en la aorta torácica [1]. Por lo tanto, en un intento por evitar esta complicación, diversos métodos de protección de la médula espinal se han sugerido, incluyendo derivaciones temporales o parciales de circunvalación, la hipotermia, el drenaje de líquido cefalorraquídeo, y las medidas farmacológicas [2 - 4]. A pesar de su uso, paraplejia sigue siendo una complicación persistente [5].

Aunque el mecanismo exacto de I / R lesión no está completamente entendido, se cree que el estrés oxidativo juega un papel fundamental en el desencadenamiento de la peroxidación lipídica, daño en el DNA y la expresión de genes específicos [6]. Además, la sangre-cerebro-barrera interrupción, mediado por radicales libres de oxígeno, los resultados en la médula espinal edema [7]. El estrés oxidativo resultante de especies reactivas del oxígeno (ROS) de producción es también implicados en la apoptosis. Aunque isquémica muerte celular neuronal se ha interpretado tradicionalmente por necrótico mecanismos, el papel de los mecanismos de apoptosis se ha propuesto recientemente a la muerte celular neuronal tras la médula espinal de I / R lesión [8]. Varios estudios han sugerido que los mecanismos de apoptosis se iniciaron a nivel molecular en I / R células neuronales [9, 10].

En la medicina tradicional oriental, Ligusticum wallichii Franchat (Chuan Xiong) se aplica en el tratamiento de neurovascular y las enfermedades cardiovasculares. Tetramethylpyrazine (PGT), purificado y químicamente identificadas componente de Chuan Xiong, tiene fuertes efectos a scavenge los radicales libres de oxígeno [11]. Se ha demostrado que puede aliviar TMP renal y daño cerebral inducido por I / R basura a través de los radicales libres [12, 13]. Sin embargo, sigue siendo incierto si los efectos protectores de TMP en la médula espinal de I / R lesiones están relacionadas con la basura los radicales libres y la supresión de las vías de apoptosis.

En este estudio, los autores investigaron el efecto de TMP en la función neurológica, bioquímica y los cambios histopatológicos y estudió su impacto en la expresión de pro-y anti-apoptóticos proteínas, así como el número de células apoptóticas tras la médula espinal de I / R lesiones en conejos.

Métodos

Todos los protocolos experimentales fueron aprobados por nuestra Comisión de Asuntos Institucionales en Investigación Animal, y se llevaron a cabo de conformidad con los Institutos Nacionales de Salud directrices para la utilización de animales y el cuidado (Institutos Nacionales de Salud no publicación. 96 - 23, revisado 1996). Los experimentos se realizaron en 36 varones adultos de Nueva Zelanda Blanco conejos (proporcionado por el Centro Experimental Animal de la Universidad Jiaotong de Xi'an) con un peso de 2,5 a 3,0 kg. Los animales fueron anestesiados con pentobarbital sódico (30 mg / kg IV, sigma, EE.UU., NO: 20030709), seguida de una dosis media que resulten necesarias durante la intervención quirúrgica. No animales recibieron hemodinámica o soporte ventilatorio. La oreja izquierda vena se cannulated con un calibre de 24 catéteres para la administración de drogas por vía intravenosa. La arteria femoral derecha se cateterizó para la presión arterial y frecuencia cardíaca de vigilancia (Spacelab, EE.UU., modelo 90206A). La tensión arterial se tomaron muestras para determinación de gases en sangre (AVL-2, Suiza) y de glucosa en la sangre (One Touch II, EE.UU.). La temperatura corporal rectal se mantuvo cerca de 38 ° C con la ayuda de una almohadilla de calefacción durante el estudio.

Grupos experimentales y los modelos con animales

Conejos fueron asignadas aleatoriamente a 3 grupos (n = 12 cada uno). En el grupo de TMP, TMP (30 mg / kg) (farmacológico Co Changzhou, China, n º: 99091401) se inyectó a través de la vena oreja 30 min antes de la aorta y de sujeción al inicio de la reperfusión. Control de animales sometidos a norma de oclusión aórtica y la inyección intravenosa de cloruro sódico al 0,9% en condiciones idénticas a las de inyección de TMP. Sham operado animales sometidos a operativos disecciones sin oclusión aórtica.

Cada grupo de animales se dividieron en cuatro grupos experimentales: grupo A para análisis bioquímicos (n = 3), el grupo B de hematoxilina y eosina coloración (H & E), Terminal Deoxynucleotidyltransferase mediada por dUTP Nick Fin-Etiquetado (TUNEL) y tinción inmunohistoquímica (n = 3), grupo C para microscopía electrónica (n = 2), grupo D para el ensayo de Western blot (n = 4). El modelo de conejo de la médula espinal de I / R lesión se estableció en función de Savas'discription [14]. En pocas palabras, después de la preparación estéril, a 10 cm de la línea media se realizó la incisión. Después de 400 anticoagulación con heparina de la unidad, la aorta abdominal transversal se fija en el nivel inferior sólo al origen de la arteria renal izquierda y, a nivel de bifurcación aórtica durante 30 min. Reperfusión fue iniciado por la eliminación de la oclusión y se prolongaron durante 48 h. El abdomen era entonces cerrado.

Evaluación neurológica

La función neurológica se observó en el 24 y 48 horas después de reperfusión de acuerdo con la puntuación de Johnson [15].

0: Hind-parálisis de extremidades;

1: paraparesia grave;

2: Functionalmovement, no hop;

3: Ataxia, disconjugate hop;

4: Minimal ataxia;

5: la función normal.

Dos personas sin conocimiento del tratamiento neurológico clasificado funcionar de manera independiente.

Estudio histológico

Los animales fueron sacrificados por la administración intravenosa de una alta concentración de pentobarbital a la 48 horas y la médula espinal fueron rápidamente retirados. La médula espinal se sumergieron en un 4% de paraformaldehído en 0,1 mol / l de tampón fosfato y se almacenan a 4 ° C durante 2 semanas. Las muestras para microscopía fueron preparados por la obtención de la médula espinal las secciones transversales de la L2 o L3 vértebra. Las muestras fueron embebidas en parafina, cortado en secciones de 5 μ m de espesor, teñidas con hematoxilina-eosina (H & E). Las muestras fueron examinadas bajo el microscopio de luz por un neuropathologist que fue cegado para el estudio.

Preparación para el examen microscópico de electrones de cordones extirpados

Las muestras fueron fijadas en 2,5% glutaraldehído durante 6 h, lavada con tampón fosfato (pH 7.4), postfixed en el 1% de tetróxido de osmio en tampón fosfato (pH 7.4), deshidratado y en el aumento de las concentraciones de alcohol. A continuación, los tejidos se sumergieron en óxido de propileno y embebido en resina epoxi que encaja los medios de comunicación. Ultrathin secciones (grosor de 60 nm) fueron cortadas y teñidas con acetato de uranilo y citrato de plomo, y examinó con una ZEISS-EM902 microscopio electrónico de transmisión (Carl Zeiss, Thornwood, NY).

Análisis bioquímico

La médula espinal tejidos fueron lavados dos veces con solución salina fría y se almacenan en una congelación profunda mantenerse a -30 ° C hasta su análisis. Tejidos de MDA se determinó por el método descrito por Wasowicz [16]. En pocas palabras, MDA se reaccionó con ácido tiobarbitúrico de incubación de 1 h a 95-100 ° C. Tras la reacción, la intensidad de fluorescencia se midió en el n-butanol fase con un espectrofotómetro de fluorescencia (Hitachi, Modelo F-4010, Japón), mediante la comparación con un estándar de solución de 1,1,3,3 tetramethoxypropane. Los resultados se expresaron en términos de nmol / g de tejido húmedo. Total (Cu-Zn y Mn) SOD se midió la actividad de reducción de nitrobluetetrazolium (NBT) de la xantina-xantina oxidasa sistema. Actividad de la enzima conduce a la inhibición del 50% fue aceptado como una unidad. Los resultados fueron expresados como U / mg de proteína [17]. Las concentraciones de proteínas se determinará de acuerdo con el método de Lowry [18].

TUNEL y tinción inmunohistoquímica

TUNEL tinción se realizó en secciones de parafina utilizando un in situ la muerte celular kit de detección (Rochev, Alemania), con arreglo a las instrucciones del fabricante. Las secciones se counterstained con hematoxilina. Un control negativo se realiza de manera similar con excepción de omitir TUNEL mezcla de reacción. Sólo las células que muestran la condensación nuclear y la fragmentación y la apoptosis en los órganos creados en virtud de falta de reactividad frente al citoplasma de TUNEL se consideraron apoptosis. Por inmunohistoquímica, las secciones, bloqueado utilizando el 2% de suero normal de cabra en PBS, se incubaron por la noche a 4 ° C con el anticuerpo monoclonal de ratón contra Bcl-2/Bax a una dilución de 1:50 (Maxim Biotech Inc, China), seguida de seguida por una oveja con biotina anti-ratón de anticuerpos y avidina-biotina complejo (Vector Laboratories, Burlingame, CA, EE.UU..) durante 2 h. Las rebanadas se coloreada con DAB / H 2 O 2 solución y, a continuación, fueron núcleos de células counterstained con hematoxilina. Cada procedimiento fue seguido por varios enjuagues en PBS. Blank tinción se llevó a cabo de la misma manera que el anterior, excepto para la eliminación de los anticuerpos primarios. Brown color de los núcleos se tomó como positiva la tinción de células apoptosis neuronal y de color marrón citoplasma se tomó como positiva la tinción de Bcl-2/Bax. Para el análisis cuantitativo, 10 campos microscópicos fueron tomadas, y todas las neuronas, incluidas las neuronas con tinción TUNEL fueron contados. Los valores medios del porcentaje de neuronas con tinción TUNEL positivas fueron tomadas para su posterior procesamiento.

Western blot ensayo de Bcl-2 y proteínas Bax

La médula espinal del tejido se colocó en tampón de lisis que contiene inhibidores (leupeptina, pepstatin A, y aprotinina), homogeneizada y, a continuación, se centrifuga (12000 × g). Después de determinar la concentración de proteína en cada una de las muestras utilizando una proteína de ensayo (Bio-Rad, Hercules, CA, EE.UU.), las muestras fueron cargados (50 mg de proteína / carril), electrophoresed en un 15% SDS-electroforesis en gel de poliacrilamida (SDS-PAGE ) Gel y borró a un filtro de nylon. Blots se probaron con anticuerpos monoclonales de ratón contra Bcl-2/Bax a una dilución de 1:200 (Maxim Biotech Inc, China) y visualiza con peroxidasa de rábano y conjugado con anticuerpos secundarios por una mayor detección reactivos quimioluminiscencia (Amersham). Bcl-2 y Bax proteínas se detectaron en 26 y 21 kDa bandas, respectivamente, con peso molecular marcador bandas. El filtro fue escaneada por FluorImager 595 (Amersham) y cuantificados con NIH Image J.

El análisis estadístico

El análisis estadístico se realizó mediante el SPSS 10,0. Un unpaired t-test fue utilizado para las comparaciones en los parámetros fisiológicos, los niveles de MDA, la actividad SOD, TUNEL-positiva y la tasa de Bcl-2/Bax expresión entre los grupos. Neurológicas resultados fueron analizados con el método no paramétrico (prueba de Kruskal-Wallis), seguida por la de Mann-Whitney U test con corrección de Bonferroni. Los datos fueron expresados como media ± desviación estándar y significación estadística se fijó en P <0,05.

Resultados
Parámetros fisiológicos

Fueron las variables fisiológicas dentro de los límites normales en cualquier tiempo evaluar los puntos, y no mostró diferencias estadísticamente significativas entre los grupos [véase la disposición 1].

Función de la evaluación neurológica

Los resultados se muestran en la Tabla 1. No anomalía neurológica se observó en el 24 y 48 horas después de reperfusión en el grupo de tratamiento simulado, con la excepción del leve alteración en un animal. Los valores de la puntuación de Johnson en TMP grupo y grupo control fueron significativamente inferiores en comparación con el grupo de tratamiento simulado en la 24 ª hora. Los valores del grupo control fueron significativamente inferiores a la 48 horas en comparación con el mismo grupo. Otra conclusión fue que, tanto en la 24 ª y 48 horas, los valores de la TMP grupo fueron significativamente mejores en comparación con el grupo control.

Estudio histopatológico

Representante de fotografías HE-manchado secciones se muestra en la Fig 1. No signo de alteraciones histopatológicas se observó en el simulacro que funcionan con los conejos con la función motora normal (Figura 1A]. Sin embargo, las médulas espinales de los conejos en el grupo control que ha sufrido paraplejia (Johnson Resultado 1) exhibió cambios necrótico con karyolysis y neurophil vacuolización (Figura 1B]. La médula espinal de los conejos evaluado Johnson Resultado 4 de PTM grupo mostró leves grados de destrucción como forma triangular, y la pérdida de Nissl gránulo en algunas neuronas motoras (Figura 1C].

Microscopía electrónica

Bajo el microscopio electrónico de transmisión, núcleo de neuronas en simulacro grupo muestra la morfología normal, incluida la forma normal de los núcleos y distribuidas de manera uniforme chromtin nuclear (Figura 2A]. En el grupo de control, mostró características de neuronas de la apoptosis, entre ellos el encogimiento núcleo, denso agregación de la cromatina (Figura 2B, flechas) y la cromatina marginación (Figura 2C, flechas),. Los resultados en la Figura 2B y Figura 2C indican que la apoptosis de las células neuronales se produjo en la médula espinal a las 48 h siguientes 30 min de isquemia.

El análisis bioquímico de marcadores de estrés oxidante en la médula espinal

Una disminución significativa en las actividades de SOD en el grupo control se determinó si se compara con la de simulacro grupo (p <0,01). TMP tratamiento significativamente impedido los descensos en la SOD producidos por las actividades de I / R (Figura 3]. I / R producido un aumento significativo de MDA nivel en la médula espinal si se compara con el simulacro de grupo (p <0,01). I / R-inducida por los incrementos en el contenido de MDA fueron significativamente impedido de TMP tratamiento (Figura 4].

TUNEL y tinción inmunohistoquímica para Bax y Bcl-2

No TUNEL-positivas se detectaron células en simulacro de grupo (Figura 5A], mientras que muchas células se tiñen intensamente en el cuerno anterior de la médula espinal después de I / R (grupo control) (Figura 5B]. Sin embargo, TMP tratamiento disminuyó la coloración y redujo el número de TUNEL de células positivas (Figura 5C]. Microphotograph Representante de la tinción inmunohistoquímica para Bax y Bcl-2 se muestran en la Figura 6, 7, respectivamente. La expresión de Bax es débil en el grupo de tratamiento simulado (Figura 6A] y Bax más positivo neuronas en el grupo control (Figura 6B] que en TMP-los animales tratados (Figura 6C]. La expresión de Bcl-2 fue importante en simulacro de grupo (Figura 7A] y moderada de Bcl-2 expresión en el grupo control (Figura 7B], en comparación con la fuerte sobre regulación de Bcl-2 en la TMP-grupo tratado (Figura 7C] .

Expresión de Bcl-2 y proteínas Bax

La expresión de Bcl-2 y proteínas Bax se visualizan a través de Western blot, como se muestra en la Figura 8. La médula espinal isquemia reperfusión, evidentemente reducido Bcl-2 de expresión y el aumento de Bax expresión en comparación con el grupo de tratamiento simulado. El tratamiento con TMP se asoció con una mayor Bcl-2 y Bax expresión atenuadas en relación con el grupo de control del vehículo.

Discusión
Efectos neuroprotectores del PGT

Este estudio demuestra un efecto considerable neuropotective de TMP, un ingrediente activo de la hierba china Ligusticum wallichii Franchat, en los exámenes neurológicos, bioquímicos y estado histopatológico de la médula espinal de I / R en conejos. Cada vez hay más pruebas de que los radicales libres son generados por I / R y contribuyen a las lesiones de tejidos [19]. ROS ataque de una variedad de moléculas biológicas esenciales, entre ellos los lípidos de membrana, las proteínas celulares esenciales, y el ADN [20]. Se estudió el efecto de TMP en la peroxidación lipídica, que se mide en términos de MDA. TMP invertir el aumento en los niveles de MDA en una medida considerable, confirmando así su papel antioxidante en I / R. Por otra parte, puso de manifiesto que el aumento de los niveles de SOD siguientes TMP tratamiento. La SOD es la primera línea de defensa contra la generación de radicales libres. Se ha informado de que el total de SOD es regulado por la médula espinal después de I / R [21]. Disminución de SOD hace un tejido susceptibles a lesiones oxidantes. Por lo tanto, los elevados niveles de SOD inducida por TMP puede contribuir a reducir los radicales superóxido tras la médula espinal I / R.

En nuestro estudio, la histología de la médula espinal confirma las observaciones clínicas. En general, la gravedad de las lesiones correlacionan bien con el grado de daño neuronal. En los animales que tenía una participación importante en el deterioro de la función motora, las pruebas de ambas necrosis y la apoptosis era evidente. Sin embargo, TMP aumentaron la proporción de animales que habían función motora normal, y en estos animales, se redujo la necrosis y más normal motoneuronas fueron preservados. Esta mejora de la función neurológica y los hallazgos histopatológicos revelan el efecto protector de TMP en la columna vertebral del tejido contra de I / R lesión.

Bax/Bcl-2 dependientes anti-apoptóticos efectos de TMP

El principal hallazgo de este trabajo es que el aumento de TMP Bcl-2 junto con la expresión significativa disminución de la expresión de Bax médula espinal. Además, TMP redujo significativamente el número de TUNEL-positivos en las células cuerno anterior de la médula espinal, y la expresión Bax/Bcl-2 parece que son equivalentes a los anti-apoptóticos.

Se ha sugerido que la apoptosis neuronal se produce simultáneamente con la necrosis tras la médula espinal de I / R y puede contribuir fundamentalmente al retraso en la aparición de la muerte de las células neuronales [22, 23]. El principal mecanismo de I / R inducida por la apoptosis se atribuye a la liberación ROS. ROS induce la apoptosis de causar daño en el DNA, la oxidación de los lípidos de membranas, y la activación de las proteínas responsables de la apoptosis [24, 25]. Entre estas proteínas reguladoras de apoptosis, la Bcl-2 la familia se compone de dos promotores de la muerte celular y prevención de la muerte celular. La proporción de anti-a pro-apoptóticos como moléculas Bcl-2/Bax determina la respuesta a una señal de muerte. De hecho, el papel de la Bcl-2 en la regulación de la familia apoptosis se ha caracterizado por CNS isquemia [26, 27]. Además, la sobre expresión de Bcl-2 puede jugar un papel protector en neuropatológicos CNS secuelas después de los insultos [28].

Estudios recientes han revelado que los antioxidantes atenuada isquémica neuronal apoptosis a través de Bcl-2 sobre regulación paralela a Bax baja regulación [29]. TMP ha informado a atenuar el daño oxidativo y apoptosis tanto in vitro como in vivo [30, 31]. En el presente estudio, el tratamiento con TMP está relacionado con un registro actualizado, regulado a nivel de los anti-apoptóticos proteína Bcl-2 y una baja regulado pro-apoptótica Bax proteína, lo que sugiere que TMP exhiben un efecto inhibidor sobre la muerte de las células apoptóticas debido a la columna vertebral cable I / R gracias a la modulación de Bcl-2 familia.

Conclusión

TMP muestra una potente protección contra la médula espinal de I / R en perjuicio de conejo modelo, reduce la apoptosis y muerte celular a través de Bcl-2 sobre regulación paralela a Bax baja regulación.

Autores de las contribuciones

Li-Hong Fan llevado a cabo todos los estudios in vivo, han participado en el diseño del estudio y ha contribuido a la preparación de manuscritos. Kun-Zheng Wang ayudó en el diseño del estudio, examinó todos los datos, y ayudó a escribir el manuscrito. Bin Cheng asistida en el análisis histopatológico y las pruebas neurológicas. Chun-Sheng Wang llevado a cabo todos los análisis estadísticos. Xiao Qian-Dang ayudado el diseño del estudio y participó en la escritura manuscrita. Todos los autores han leído y aprobado el manuscrito final.

Material complementario
Archivo Adicional 1
Pysiologic Variables MABP: presión arterial media; RT: temperatura rectal; BG: nivel de glucosa en sangre. No hubo diferencias estadísticamente significativas en ninguno parámetros fisiológicos entre los grupos.
Agradecimientos

El apoyo de Xi'an Jiao Tong University es reconocida. Damos las gracias al Prof Kun-Zheng Wang por la generosa oferta de Tetramethylpyrazine.