Immunity & Ageing, 2006; 3: 7-7 (más artículos en esta revista)

Electroforesis de proteínas y ADN en horizontal dodecyl sulfato de sodio geles de poliacrilamida

BioMed Central
Vincenzo Izzo (enzoizzo1948@libero.it) [1], A Maria Costa (enzoizzo1948@libero.it) [1], Renata Di Fiore (enzoizzo1948@libero.it) [1], Giovanni Duro (duro@ibim.cnr. es) [1], Daniele Bellavia (danielebellavia@virgilio.it) [2], Eleonora Cascone (eleonora.cascone @ libero.it) [2], Paolo Colombo (enzoizzo1948@libero.it) [1], Maria C Gioviale (ailomonte@unipa.it) [3], Rainer Barbieri (barner@unipa.it) [2]
[1] Istituto di Biomedicina e Immunologia Molecolare, CNR, Via U. La Malfa, 153, 90153 Palermo, Italia
[2] Dipartimento di Biologia Cellulare e dello Sviluppo - Università di Palermo, V.le delle Scienze, 90128 Palermo, Italia
[3] Dipartimento GEN.UR.TO. -- Università di Palermo, Italia

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Resumen

Un poco costosa Plexiglas aparato que permite una simple y rápida preparación de geles de poliacrilamida horizontales de diferentes dimensiones para diferentes fines, se describe. Preparación de esos geles es tan fácil y rápido como preparación en gel de agarosa, y polimerizados geles de poliacrilamida se utilizan para fraccionar las proteínas o pequeños fragmentos de ADN utilizando un tanque de electroforesis horizontal. Este aparato fue utilizado para fraccionar por electroforesis de proteínas o ADN de inmuno-blot análisis, particularirly en el estudio de la respuesta a alergénicos PARIETARIA Judaica polen en la senescencia, por Southern-blot hibridaciones y en el estudio de polimorfismos de ADN.

Introducción

Horizontal sumergido electroforesis en gel de agarosa de los ácidos nucleicos es una herramienta básica de la biología molecular moderna [1]. Pouring agarosa fundida en una bandeja de gel horizontal, la rapidez de polimerización, y la sencillez de manejo y el uso de geles de agarosa polimerizados, se encuentran entre las muchas ventajas de esta técnica utilizada universalmente. Por desgracia, las proteínas y muy poco ácidos nucleicos son demasiado pequeños para ser fraccionada de manera eficiente a través de la gran poro de agarosa tamiz molecular. En consecuencia, un refuerzo de la matriz como de poliacrilamida se utiliza para fraccionar por electroforesis tan pequeñas moléculas [2]. Sulfato de sodio dodecyl electroforesis en gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) se utiliza sistemáticamente para obtener el fraccionamiento de las proteínas en función de su masa molecular. Dado que una solución de poliacrilamida no se polimeriza en presencia de oxígeno, su polimerización se obtiene mediante la solución de carga entre dos placas de vidrio., Colocado verticalmente, y un peine de plástico se inserta en la ranura lateral superior para formar los pozos de carga [2]. Este procedimiento, que a menudo necesita un gel de apilamiento en la parte superior de la poliacrilamida polimerizados, es largo y tedioso horizontal en comparación con la preparación en gel de agarosa. De hecho, la polimerización de poliacrilamida acuerdo conjunto implican estos geles a ser verticales, verticales y geles de diferentes dimensiones cada necesidad de un propósito construido el aparato.

Hemos desarrollado un dispositivo de bajo costo para obtener geles de poliacrilamida horizontales de diferentes dimensiones. Preparación de esos geles es tan fácil y rápido como preparación en gel de agarosa, y polimerizados geles de poliacrilamida se utilizan para fraccionar las proteínas o pequeños fragmentos de ADN utilizando un tanque de electroforesis horizontal.

Materiales y métodos

Un bloque paralelepípedo Plexiglas (170 × 70 × 20 mm) fue molido a uno de sus más grandes superficies utilizando una fresadora, para obtener una fila de dientes protuberantes idénticos (5 mm × 1 mm × 1,5 mm) y una frontera marco de 5 mm de ancho y 1,5 mm de profundidad (Figura 1]. Una placa de cristal, 3 mm de espesor, fue silanized en una superficie con una solución silano (0,6% silano 96,4% de etanol - un 3% de ácido acético; silano de Sigma, EE.UU.). Silanization permite polimerizado de poliacrilamida para adherirse firmemente a la superficie de cristal. La placa de vidrio fue colocado entonces en el bloque molido, silanized superficie hacia abajo, para cubrir la superficie molida, dejando una ranura en ambos lados entre los bordes de la placa de cristal y el bloque de Plexiglas frontera marco (Figura 1]. Un peso de unos 100 g, se incluyó en la placa para obtener una firme adhesión entre la placa de cristal y los dientes protuberantes y la frontera marco de la Plexiglas bloque.

Una solución de poliacrilamida, preparado por la adición de 15 μ l de TEMED y 45 μ l de 20% de amonio persulfate a 10 ml de solución de gel de acrilamida (Acrilamida / Bis 19:1, 10% w / v solución, TBE 1 ×, pH 8,3, el 0,1% SDS) fue cargado a través de una de las ranuras para llenar, por capilaridad, el volumen entre la superficie molido Plexiglas silanized y la placa de cristal. En estas condiciones, la solución de poliacrilamida polimeriza en unos minutos. Después de la polimerización, la placa de cristal con el gel firmemente adherido a ella, se elimina del dispositivo simplemente mediante la inserción y la rotación de un bisturí entre la placa de cristal y el marco Plexiglas frontera. El gel se presenta una fila de los pozos de poliacrilamida con paredes y fondo de cristal, y se pueden usar directamente en un aparato de electroforesis horizontal. Las muestras se cargan como lo son en común horizontal geles de agarosa. H-SDS-PAGE se realizó en TBE 1X, 0,1% SDS a las 7 V / cm. Se obtuvieron geles de diferentes dimensiones y de diferentes números de los pozos, ya sea mediante la colocación de la placa de cristal diferente a la molido superficie del bloque de Plexiglas o utilizando placas de vidrio de diferentes dimensiones (véase el gráfico 5].

Si fraccionados por electroforesis de proteínas y ADN iban a ser transferidos a una membrana, el gel fue eliminado de la copa de apoyo con la superación de una 0,4 mm de hilo de nylon, presionado fuertemente con ambas manos sobre la superficie de cristal, entre la superficie del cristal y el gel. Debido a su consistencia, el gel es fácil "cortar" desde el vidrio, la preservación de su integridad.

Electroforéticamente fraccionado ADN fue manchado por verter vidrio-se adhirieron geles en un 0,5 μ g / ml bromuro de etidio solución en TBE 1X y proteínas fueron teñidas en un brillante azul coomassie solución [1, 3].

16HBE monocapas de células [4] se zadas en el hielo frío buffer (10 mM Tris, pH 7,4, 50 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1% Nonidet P-40 y cóctel inhibidor de la proteasa (Boehringer Manheim) y centrifugar a 10000 g durante 10 minutos . Sobrenadante concentración de proteínas fue determinada por Bio-Rad ensayo proteínas (BioRad, EE.UU.). Proteína muestras fueron desnaturalizados en virtud de la reducción de condiciones, de ellos ebullición durante 5 minutos en la muestra buffer (50 mM Tris, pH6.8; SDS 1%, 2% B-mercaptoetanol; 0,01% Azul de bromofenol), antes de H-SDS-PAGE fraccionamiento. Electroforéticamente fraccionado proteínas fueron electroblotted en Immobilon-P membranas (Millipore, EE.UU.) que luego fueron incubadas durante la noche en el amortiguador de bloqueo (PBS 1X, 3% BSA; 0,5% de Tween-20 y 0,02% NaN3). Después de tres lavados en PBS 1X; 0,5% de Tween-20, las membranas fueron incubadas durante 1 hora a temperatura ambiente en presencia de ratón anti-HSP27 anticuerpo monoclonal (Stressgen, clon G3. 1) usados en la dilución 1:1000. Detección de anticuerpos obligado se llevó a cabo con la peroxidasa de rábano-anticuerpo secundario conjugado, seguido por la detección de quimioluminiscencia utilizando un kit de detección ECL (Amersham, EE.UU.). Intensidad de la señal se determinó por densitometría (BioRad Gel Doc 1000).

Western blot Parj2 de la proteína recombinante, se realizó tal como se describe en otro lugar [5]

Resultados

Se realizó el fraccionamiento electroforético de las proteínas o ADN utilizando geles preparados con nuestro aparato de electroforesis en un tanque de uso común para electroforesis en gel de agarosa.

Electroforesis de proteínas

Con el fin de verificar la relación lineal entre el logaritmo de la masa molecular y la movilidad relativa de las proteínas, hemos fraccionado diferentes marcadores de proteínas (de bajo y alto peso molecular gama de normas, BioRad EE.UU.) horizontal en geles de poliacrilamida de diferentes concentraciones (Figura 2]. Electroforético migraciones se llevaron a cabo tal y como se describe en Materiales y Métodos, hasta que el azul de bromofenol seguimiento de tinte corrió el gel. Usando estos parámetros, 6 cm de largo geles y 45 minutos se ejecuta, las curvas de calibración fueron generados por tramar el registro de la masa molecular frente a la migración distancias. Estas curvas son lineales entre 14.4-116 Kd (coeficiente de correlación r 2 = 0,985) en un 7% de gel de acrilamida, y entre 14.4-66.2 Kd en un 10% de gel de acrilamida (r 2 = 0,990). Alta calidad de los patrones de fraccionamiento electroforético de las proteínas se obtuvieron tanto en las concentraciones de acrilamida utilizada (Figura 2].

Western-Blots se realizaron en el estudio de alergénicos respuesta a PARIETARIA Judaica polen en la senescencia, para demostrar la eficacia y la fiabilidad de las transferencias utilizando geles obtenidos con nuestro dispositivo y recuperados, según el procedimiento descrito en los Materiales y Métodos sección. Figura 3A muestra un Western-blot análisis de 1, 2 y 4 μ g (pistas 1, 2 y 3, respectivamente), de 16 extractos de células HBe (véase Materiales y Métodos), probaron con el ratón anti HSP27 anticuerpo monoclonal. Figura 3B muestra un western blot-de 0,5, 2,5 y 12,5 μ g de E. coli Parj2 lisado probaron con sueros agrupados alérgicas. Intensidades relativas de las señales de unión de los anticuerpos indica la fiabilidad del oeste de la transferencia.

Electroforesis de ADN

Para electroforesis fraccionar las pequeñas moléculas de ADN, como los obtenidos por reacción de polimerasa en cadena (PCR), geles de poliacrilamida ofrecer el más alto poder de resolución. Como tamaño de poro de poliacrilamida es independiente en el buffer utilizado [6], fractionations electroforético se realizaron indistintamente en el TAE o TBE buffer. Como el uso de SDS-PAGE en el fraccionamiento electroforético de ADN se sugirió para mejorar la resolución de electroforesis poder [7], hemos preparado horizontal geles de poliacrilamida, tanto en la presencia o ausencia de SDS. Como se muestra en la Figura 4, fraccionamiento electroforético de ADN utilizando 6 cm de largo geles en nuestros aparatos, separa las moléculas que difieren sólo por unos cuantos nucleótidos.

H-SDS-PAGE fraccionamiento patrones presentan un mayor poder de resolución superior al correspondiente H-PAGE perfiles de electroforesis (Figura 4].

Discusión

Hemos desarrollado un sencillo, barato y versátil dispositivo para preparar geles de poliacrilamida horizontal para el fraccionamiento electroforético de las proteínas o ADN. Las principales ventajas de nuestro sistema se resumen como sigue:

Preparación de H-SDS-PA geles es más simple y más rápido que los convencionales vertical geles.

Geles de longitud variable y la amplitud (número de pozos) (Figura 5A y 5B respectivamente) pueden obtenerse simplemente mediante el uso de placas de vidrio de diferentes dimensiones, o colocar la placa de cristal diferente, a fin de cubrir la zona deseada gel en la superficie molido Plexiglas. Por otra parte, esto evita la necesidad de separar aparatos de electroforesis de acuerdo a la dimensión deseada gel, como la electroforesis se realiza en un tanque de electroforesis horizontal.

El apretado adherencia entre el gel y la placa de cristal ofrece una protección física para el gel en sí, por lo que pueden ser fácilmente manipulados. De hecho, el sello en la parte inferior de los pozos, entre el gel y la placa de vidrio, ha demostrado ser absolutamente fiable a cientos de geles elaborados con nuestro dispositivo.

En la electroforesis de ADN, una ventaja adicional de geles preparados utilizando nuestro sistema es la posibilidad de ADN, para comprobar la progresión de la banda durante el fraccionamiento, lo cual es imposible cuando geles verticales convencionales se utilizan, de hecho si es necesario, después de la tinción de ADN y de visualización como se describe en Materiales y Métodos , Fraccionamiento electroforético se puedan reanudar.

Un aparato similar fue construido para obtener Microtiter Array Diagonal Geles (Madge) para el análisis del genotipo de ADN en geles de poliacrilamida [7, 8]. Aunque este método alcance plenamente su objetivo de resolver a corto productos PCR, se aplicó únicamente a fraccionar el ADN y para un propósito específico, en tanto que muy poco se ejecuta se realizaron y no particular gel poder de resolución era necesaria.

Agradecimientos

Estamos agradecidos al Sr Angelo Mangano para la asistencia técnica en la construcción de los aparatos. Expresamos nuestro más sincero agradecimiento al Dr Anna Merendino por darnos 16HBE células. Esta labor fue apoyada por los fondos de MIUR 60%.