Diagnostic Pathology, 2006; 1: 14-14 (más artículos en esta revista)

TMA para todos: un nuevo método para la construcción de microarrays de tejidos sin destinatario bloque de parafina utilizando la costumbre-construido agujas

BioMed Central
Andréa Rodrigues Cordovil Pires (andreapires@fontemd.com.br) [1], Felipe Andreiuolo da Matta (andreiuolo@gmail.com) [2], Simone Rabello de Souza (admin@fontemd.com.br) [2]
[1] Fonte Medicina Diagnóstica Ltda. y la Universidad Federal Fluminense, Río de Janeiro, Niterói, Brasil
[2] Fonte Medicina Diagnóstica Ltda., Río de Janeiro, Niterói, Brasil

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Resumen
Fondo

TMA se están convirtiendo en una herramienta útil para la investigación y los métodos de control de calidad, en su mayoría por inmunohistoquímica y la hibridación in situ.

Métodos

Una nueva técnica que permite la construcción de bloques de TMA, con más de 300 núcleos de tejido sin necesidad de utilizar un receptor de parafina para el bloque de cilindros de tejido y sin usar un constructor comercial TMA instrumento se describe. Esta técnica se basa en la construcción de modificar TMA agujas convencionales agujas hipodérmicas a núcleos de perforación de tejidos de donantes bloques, que se adjuntan de doble cara cinta adhesiva en un ordenador de la red generado papel utilizado para ajustar las muestras en el bloque de molde, que es llena de parafina líquida.

Resultados

Más de doscientos TMA bloques fueron construidos utilizando este método, utilizado en inmunohistoquímica y histoquímica como controles positivos y negativos y también en la investigación.

Conclusión

Esta técnica tiene las siguientes ventajas: es fácil de reproducir, asequible, rápido y uniforme crea bloques con más de 300 núcleos alineados, adherente y fácil de cortar, con pérdidas insignificantes durante el proceso de corte y la inmunohistoquímica y la hibridación in situ los procedimientos.

Fondo

Microarrays de tejidos (TMA) se están convirtiendo en una herramienta útil para la investigación y el control de calidad en inmunohistoquímica (IHC) y la hibridación in situ los métodos [1 - 3]. El sistema convencional de construcción de un bloque TMA implica la utilización comercial de un constructor TMA instrumento a los núcleos de perforación de bloques de donantes, y la transferencia de estos núcleos de tejido a un receptor bloque, la producción de bloques, incluso con núcleos de tejido 1000. Esta técnica tiene algunas desventajas:

1. como tejidos de diferentes núcleos de donantes bloques se colocan dentro de los agujeros en el bloque receptor, para crear y mejorar la adherencia entre el tejido y los núcleos receptores bloque, el bloque TMA tiene que ser ligeramente calentado para fundir ambos. Durante esta fase misalign núcleos de Mayo o la fusión no podrá ser completa, lo que resulta en pérdidas básico;

2. la necesidad de cinta adhesiva durante micrótomo de corte comercial por parte de algunos dispositivos disponibles TMA;

3. los núcleos pueden insertarse también en el bloque receptor, por lo que en ausencia de los núcleos más profundos en los primeros cortes y,

4. el constructor comercial TMA instrumento y sus agujas desechables no son asequibles para muchos laboratorios de Patología en todo el mundo.

Este estudio se llevó a cabo con el fin de producir TMA bloques sin los inconvenientes antes mencionados.

Métodos
Agujas (figura 1]

Convencionales hipodérmica Becton-Dickinson ® PrecisionGlide agujas, 16 y calibre 18 (cuadro 1], se prepararon para la perforación de los bloques de donantes, de la siguiente manera: se utilizó una Dremel Multi-Pro ® Rotary Tool Modelo 395, a baja velocidad (<10000 rpm ), Con una rueda de corte adjunto, para cortar el bisel y enderezar la punta. Utilizando la misma herramienta, las aberturas laterales (ventanas) fueron hechas, 1 mm de distancia de la nueva punta, con 8-10 mm de longitud y un poco más ancho que la mitad de las agujas de anchura, de modo que el núcleo perforado podría eliminarse de manera segura a través de él. Luego la superficie exterior de la aguja se agudizó con el lijado de superficie de la rueda de corte. La superficie interna se agudizó también utilizando un eje de cono de piedra o un metal afilador. Cores fueron perforados manualmente a partir de los bloques de donantes, de las regiones seleccionadas en corresponsal de hematoxilina-eosina (H & E) diapositivas superpuestos. En esta etapa es importante que la aguja entra en el bloque en forma perpendicular, de modo que las muestras extraídas tendrá una forma cilíndrica perfecta. Hemos adaptado, alternativamente, una mano de prensa la inserción de drenaje timpánico máquina, por medio de la eliminación de los troqueles, y adjuntando una de las agujas personalizada en su lugar, lo que garantiza aún más fácil semi-automatizado de circulación, así como un ángulo perpendicular entre la aguja y la bloque de donantes. El total de costo inicial fue cerca de USD $ 100.00 (cuadro 2].

Documento de la red (figura 1]

Hemos diseñado una grilla de dibujo utilizando el software Corel Draw ® la siguiente manera: 1 mm círculos blancos fueron alineados y dejando 0,5 a 1 mm de espacio entre ellos, en un colorido fondo, la red fue impreso en papel normal.

Moldes (figura 2]

Documento de rejillas se adjunta a moldes de acero inoxidable por medio de una doble cara, cinta adhesiva, Scotch ® 3 M, 12 mm de ancho. La cinta debe ser más amplio que la red, a fin de que la frontera libre de la cinta adhesiva de superficie inferior puede adjuntar el documento de la red en el molde y toda la superficie superior debe estar disponible para conectar los núcleos de tejido. Después, extrajeron los núcleos se unirá a la cinta, superpuestos a los círculos blancos seleccionados en el documento de la red, de manera ordenada. Se utilizó 7,0 × 7,0 mm, 15,0 × 15,0 mm y 25,0 × 15,0 mm moldes, en función del número de cilindros deseado.

Bloques (figura 2]

Una vez que todos los núcleos se adjunta al molde, parafina derretida se vierte suavemente en el molde. Es importante asegurarse de que todos los núcleos son perfectamente vertical en este paso. Desde este punto, los bloques se resolverán de conformidad con los procedimientos de rutina histopatológico. Las secciones se redujeron en un americano de fibra óptica estándar rotatory micrótomo, 4 μ m de espesor; cada bloque 90-100 diapositivas previstas, en función de los núcleos de tejido 'de longitud. No hubo necesidad de utilizar adhesivos recubiertos de cinta de la sección. El diseño de cada bloque se detalla en un mapa TMA, indicando la posición y la identificación de cada muestra. Hemos utilizado tejidos normales, los distintos núcleos de tamaño o de posición-blanco núcleos específicos para la orientación durante la microscopia.

Diapositivas (figura 2]

Hematoxilina-eosina (H & E) manchadas diapositivas fueron obtenidos y procesados en la forma convencional. IHC se realizó mediante norma avidina-biotina-peroxidasa manual de procedimientos usando diapositivas pre-tratadas con silano (3-amino-propil trietoxysilane) 3% en acetona, el calor antígeno mediada por la recuperación de diapositivas incubando en un baño de agua caliente a 96 ° C / 204,8 ° F durante 40 minutos y como cromógeno DAB.

Resultados
Agujas

Elaboración de las agujas fue fácil y rápida, que requieren poca habilidad para producir el bisel y la ventana lateral - tras un breve período de aprendizaje y la formación (unas horas), todo el mundo estaba en condiciones de producir buena calidad agujas en menos de 15 minutos. Es aconsejable utilizar gafas de protección y guantes para evitar el daño de polvo metálico.

TMA bloques

La construcción de bloques TMA utilizando esta técnica también fue rápido (30 minutos para hacer una de 25 núcleos de bloque) y fácil (una vez que la exacta zonas están marcadas por H & E diapositivas, el técnico puede ponche de los donantes y la construcción de bloques de la TMA bloque diseñado la siguiente mapa). Este planteamiento es interesante porque con sólo unos pocos convencionales histopatología donantes bloques de parafina, casi idénticos varios bloques TMA se puede hacer, y cientos o miles de diapositivas obtenidas.

Inmunohistoquímica

Inicialmente, 79 diferentes anticuerpos primarios, monoclonales y policlonales, han sido probadas con éxito para tittering / protocolo de creación (75 de BioGenex ® y 4 de Novocastra ®) a través de 320 diapositivas de TMA bloques que contienen 25 diferentes muestras de lo normal o tejidos neoplásicos. Después de este anticuerpo tittering / protocolo fase de establecimiento, varios pequeños bloques de TMA (9 muestras de tejidos, 3 × 3 cuadrícula) fueron diseñados para ser utilizados como rutina IHC controles positivos y negativos, cada uno por un grupo de anticuerpos primarios. Una TMA bloque con 9 núcleos de tejido (3 × 3 red) fue diseñado para ser utilizado como histoquímica / especiales manchas controles positivos y negativos. Cada bloque se redujo hasta un tejido básico terminado, por lo que el control de diapositivas 90-100. Estas control diapositivas fueron almacenadas en cajas de plástico de diapositivas a 4 ° C/39.2 ° F por no más de 4 semanas. Habitualmente, cada diapositiva IHC caso había dos ámbitos: el control de la TMA justo por debajo de diapositivas de identificación y el caso justo debajo de la sección de control de la TMA (figura 2]. Más de 200 IHC control TMA bloques con 9 núcleos (3 × 3 red) se han confectioned hasta el presente. TMA bloques más grandes se han producido utilizando esta técnica para la investigación o los propósitos de la demostración, que van desde 81 (9 × 9 grid) a 325 núcleos (25 × 13 cuadrícula, la figura 2]. Hubo poco básico pérdidas (<1%), la mayoría de ellos debido al consumo de uno o más núcleos de tejido durante microtomy, rara vez a la sección de la caída de diapositivas durante los procedimientos técnicos. Para evitar este consumo irregular, es importante ponche cerca de núcleos con el mismo tejido de longitud, por lo que uno debe evitar los donantes bloques de diapositivas que muchos se han recortado o que soportan demasiado delgada de tejido (al menos 2 mm de espesor). Tanto los días 16 y calibre 18 agujas obtuvieron los mismos resultados satisfactorios.

Discusión

Recientemente ha habido informes de los métodos alternativos para la construcción manual de microarrays de tejidos [4 - 7]. Este artículo describe otra alternativa que se han probado durante más de un año, que es barato, fácil de reproducir y rápida de realizar, y produce alta densidad alineados TMA bloques que puede ser manipulado del mismo modo cualquier otro bloque de parafina de tejido. Tras el método actual, los bloques no se rompen y además hay un núcleo mínimo la pérdida, lo que impide el uso de una cinta adhesiva para seccionar dispositivo. El costo inicial es cerca de USD $ 100,00; costes adicionales son insignificantes e incluir únicamente la eventual adquisición de agujas hipodérmicas adicionales para la personalización y la doble cara de cinta adhesiva. También es posible utilizar la médula ósea trephine biopsia de agujas u otros tipos de agujas, sin embargo agujas hipodérmicas personalizadas han demostrado ser mucho más rentable, y la apertura lateral es útil. El uso de la doble cara de cinta adhesiva para fijar los núcleos fue descrito recientemente [8], y hemos desarrollado una red que permite una adaptación satisfactoria de fragmentos de tejidos, y los bloques así obtenidos necesariamente mostrar los tejidos núcleos alineados y en el mismo plano de corte . Aunque las agujas se puede utilizar manualmente, utilizando la mano de prensa la inserción de drenaje timpánico máquina hace más fácil la perforación de núcleo, una vez que es absolutamente perpendicular, evita daños al donante bloques y es más rápido.

Conclusión

Se presenta un método alternativo para la construcción de alta densidad de bloques de microarrays de tejidos que pueden ser realizadas por cualquier laboratorio de Anatomía Patológica, a bajo costo y que exige una mínima habilidad y el tiempo.

Conflicto de intereses

Los autores declaran que no tienen intereses en conflicto.

Autores de las contribuciones

Todos los autores contribuyeron igualmente a este trabajo, en todos sus pasos. Todos los autores leído y aprobado el manuscrito final.

Agradecimientos

Los autores se agradecen a Maurício Vincenzi para las fotografías y Max Thiago Ferreira Xavier, Antonio Carlos Rodrigues do Nascimento, Ana Maria Rodrigues, Celeste Rodrigues de Carvalho, Kátia Valéria Ferreira da Costa, Gisele Rabello de Souza y Alexander da Conceição Galvão por su apoyo técnico y la dedicación . El apoyo financiero proporcionado por Fonte Medicina Diagnóstica Ltda.