Expresión de AFP y Rev-Erb A / Rev-Erb B y N-CDR en el hígado fetal de ratas, daño hepático y la regeneración del hígado

Durante graves y daño hepático crónico, una subpoblación de células hepáticas denominado óvalo fue inducida por las células a proliferar. El óvalo células no son típicos de hepatocitos, que son en realidad menos maduras que las células puedan funcionar como progenitores, ya sea para hepatocytic ductal o linajes de células. Este tipo de células que expresan alfa-fetoproteína (AFP) transcripciones [1 - 3]. AFP es un oncofetal genes, que se produce a alta tasa en el saco de yema de huevo, hígado fetal y el intestino, pero otra cosa es apagar en las primeras semanas después del nacimiento [4, 5]. En el hígado de adultos, AFP se expresa sólo en muy pequeñas cantidades, no obstante, AFP expresión puede reanudar en determinadas situaciones fisiopatológicas, como la regeneración hepática (por ej., Después de la resección quirúrgica) y la carcinogénesis de hígado (p. ej., Carcinoma hepatocelular). AFP El aumento de la expresión génica ocurre, por ejemplo, en los seres humanos que sufren de enfermedades crónicas del hígado [6 - 9] y se estimó que un marcador para el carcinoma hepatocelular [8, 10]. Para el estudio de la expresión de AFP, en vivo, diferentes modelos animales de daño hepático, regeneración y carcinogénesis están disponibles. En el hígado de rata múltiples AFP-ARN transcripciones se pueden generar. Las diferentes AFP-ARN transcripciones son regulados diferencialmente durante el desarrollo, los de larga duración AFP-ARN [forma importante; 2,1 kilobases (kb)] es altamente expresado en el hígado fetal y las tres variantes más pequeños (1,7, 1,4 y 1,0 kb) expresado en el hígado de la rata adulta [11]. La larga duración AFP-ARN, sin embargo, está muy aumentado en los hígados de rata con una proliferación de células progenitoras putativo compartimento [11, 12]. Los tamaños más pequeños transcripción de la AFP-ARN se expresan en el hígado de la rata adulta y su estado de equilibrio nivel no cambia significativamente en la regeneración de hígado después de la hepatectomía parcial (PH) o tóxicas después de daño hepático.

Para comprender el mecanismo de regeneración hepática y hepatocarcinogenesis, podría ser más importante algunos conocimientos sobre la regulación de los genes AFP. La transcripción de la AFP gen se encuentra bajo el control de, al menos, tres potenciadores y silenciar a un elemento en rata y ratón [13 - 15]. Estos factores trabajan en un tejido de manera específica en los tres órganos derivados de la capa endodermal - a saber, el saco de yema de huevo, el hígado y el intestino. En un estudio realizado cuidadosamente, in vitro, y publicado recientemente, Bois-Joyeux et al. sugirió que las cantidades y / o actividades de los huérfanos receptores nucleares AFP podría modular la expresión de genes en diferentes condiciones fisiopatológicas, como la regeneración hepática y cáncer de hígado [16]. Dos estrechamente relacionados con grupos de factores de transcripción parecen estar implicadas en la regulación de la expresión génica AFP, de manera explícita el receptor del ácido retinoico relacionados con los receptores huérfanos (ROR) y Rev-Erb grupo. El primer grupo contiene tres genes: ROR-α, β-ROR y ROR-γ, el segundo grupo incluye Rev-Erb A y Rev-Erb B. El ROR-α, Rev-Erb Rev A y B-Erb productos genéticos son co-expresados en varios tejidos, incluyendo el corazón, el cerebro, el hígado y el músculo esquelético [17 - 20]. El RORs actuar como activadores de la mayoría, mientras que el Rev-Erb productos genéticos con mayor frecuencia actuar como represores de transcripción [18, 21]. Las dos familias de factores de transcripción acto junto con cofactores, como GRIP-1 para RORs [22] y N-CDR para Rev-Erbs [23]. Como ambos factores nucleares se unen a sitios de reglamentación muy similar con las secuencias de ADN, existe la posibilidad de una cruz de hablar entre las diferentes vías de señalización. Por otra parte, tanto ROR-α y Rev-Erb A modular el efecto de otros factores nucleares, como los receptores de T3 a nivel de transcripción [24]. Experimentos in vitro sugirió que la AFP gen es un objetivo de ROR-α, Rev-A y Erb Rev-Erb B. La sobreexpresión de la ROR-α estimula la actividad de la AFP potenciadores en un dependiente de la dosis de forma que la sobreproducción de Rev-Erb Rev A y B-Erb hacia abajo tenía un efecto regulador [16].

El objetivo de este estudio fue analizar la expresión de larga duración AFP-ARN, como un posible marcador de células ovales, y la expresión del receptor nuclear huérfano (Rev-Erb A, Rev-Erb B y N-CDR), durante el hígado regeneración [PH con o sin 2-acetil-aminofluren (2-AAF) de tratamiento], daño hepático agudo _[4 CCL tratamiento] y en el hígado fetal de ratas. Por lo tanto, hemos estudiado la distribución de la AFP-RNA (de larga duración, así como tamaños más pequeños de AFP-ARN) por PCR en tiempo real, por Northern blot y Western blot análisis, en el hígado de ratas después de la CCL ₄ tratos, después de PH con y sin 2-AAF tratamiento y en el hígado fetal. Además, se estudió la expresión génica AFP en el hígado de ratas después de la inyección intramuscular de aceite de trementina (modelo de respuesta de fase aguda), como control. Al mismo tiempo la expresión de puntos de Rev-Erb A, Rev-Erb B y N-CDR se estudiaron a nivel de mRNA de PCR en tiempo real.

Se encontró que el receptor nuclear huérfano genes no sólo eran regulados por la "fetal" AFP gen fue hasta reguladas, sino también en los casos en que no ha cambiado, cuestionando el papel regulador de los genes sobre la manifestación del feto AFP, in vivo.

Hígado secciones de criostato se realizaron de todos los modelos animales utilizados (hígado normal de regeneración, la regeneración del hígado a través de células de forma ovalada, daño hepático agudo por la CCL _{4-tratamiento} y la respuesta de fase aguda de aceite de trementina tratamiento). Inmunoticción con un anticuerpo contra las AFP muestran que AFP-células positivas puede verse sólo en el hígado de 2-AAF ratas tratadas después de PH. AFP-células positivas se localizaron en las agrupaciones de células ovales, en la región periportal, el día 7 después de PH con 2-AAF tratamiento (Figura 1]. No AFP-células positivas podría ser visto durante la regeneración hepática normal, después de lesión hepática aguda o después de la inyección de aceite de trementina.

En el pasado, que fue publicada por los distintos grupos que durante la regeneración del hígado por la proliferación de células progenitoras putativo (el llamado óvalo células) a la escuela para pedir AFP-ARN es altamente expresado. En las ratas tratadas con 2-AAF después de PH, la proliferación de los hepatocitos se bloquea y la regeneración del hígado se lleva a cabo por la diferenciación de las células ovales en hepatocitos. En el norte de blot (Figura 2], podríamos estar demostrado que la larga duración APF-ARN se expresa en esta situación. Por PCR en tiempo real el análisis de dos pares de primers (AFP1 y AFP2) (Tabla 1] fueron diseñados. Real-time PCR se realizaron al mismo tiempo los puntos con los primers, curiosamente en el caso de imprimación AFP1 un fuerte incremento de las transcripciones específicas se puede observar en comparación con el control y en caso de imprimación AFP2 sólo un débil aumento se observó. Para asegurarse de que primer AFP1 puede detectar posiblemente el óvalo de células específicas de larga duración AFP-ARN durante la regeneración hepática en 2-AAF ratas tratadas después de PH, el producto de amplificación de imprimación AFP1 fue utilizado como una sonda del Norte para blot. Esta última se realizó con muestras de hígado de ARN 2-AAF ratas tratadas después de PH y después del simulacro de operación. Una señal positiva de hibridación, de alrededor de 2,1 kb, sólo se observó en las muestras de hígado 2-AAF ratas tratadas después de PH, pero no después de la operación simulada (Figura 2]. Con el fin de apoyar nuestra hipótesis, los dos pares de primers fueron probados también en hígado fetal de ratas - en este caso, el de larga duración AFP-ARN es altamente expresado. PCR en tiempo real análisis mostró un fuerte incremento en la expresión de larga duración AFP-RNA (AFP1) con un máximo en el día 14 (21500 veces) post coitum y sólo una débil expresión (582 veces) de los más pequeños AFP-ARN variantes (AFP2 ), Al mismo tiempo, los puntos (Figura 6] se pudo demostrar. Por lo tanto, llegamos a la conclusión de que AFP1 primer detecta la escuela para pedir una AFP-ARN y el primer AFP2 detecta el truncado AFP.

PCR en tiempo real el análisis se realizó con el primer AFP1, que detecta la escuela para pedir una AFP-ARN, y el primer AFP2, que detecta las más pequeñas de empalme productos. La expresión del gen AFP fue examinado en el hígado de rata modelos diferentes: a) modelo de regeneración hepática con la proliferación de células ovales (PH en 2-AAF ratas tratadas - simulacro de operación en 2-AAF ratas tratadas se utilizaron como controles adecuados) B) modelo de regeneración hepática normal (sin PH 2-AAF tratamiento - simulacro de operación se utilizaron como controles adecuados), c) el modelo de daño hepático agudo (CCL ₄ tratamiento de las ratas), d) en un modelo de reacción de fase aguda ( aceite de trementina tratamiento de las ratas), y e) del hígado fetal (Figuras 3 a 7]. Aunque el modelo de reacción de fase aguda no es un modelo para la regeneración del hígado, pero debido a cambios dramáticos de la expresión génica del hígado se observa, se utilizó como control. Hemos realizado dos series diferentes para cada modelo, y los valores medios y la desviación estándar para la AFP la expresión génica se muestra en las cifras.

En 2-AAF ratas tratadas, la expresión de la escuela para pedir una AFP-RNA (AFP1) aumentó desde el día 1 (-0,2 veces) después de PH al máximo en el día 7 (399 veces) después de PH. Del día 7 al día 13, una disminución de 56,9 veces puede ser observado (Figura 3]. El más pequeño de empalme productos de AFP (AFP2), que no son específicos para las células de forma ovalada, son sólo ligeramente elevada entre el día 3 y el día 13 después de PH (Figura 3]. No se observó aumento en AAF-ratas tratadas después de la operación simulada (datos no presentados).

En ratas sometidas a PH (Figura 4] o en simulacro de operación sin AAF-tratamiento (datos no presentados), sin incremento del de larga duración AFP-RNA (AFP1) se observó, los de larga duración AFP-ARN es ligeramente inferior regulado en cada punto de tiempo en comparación con el control. El empalme de los productos más pequeños (AFP2) mostraron una regulación continua por hasta 16 horas con un máximo de -25,7 veces. Relativo a 16 horas, un aumento de los productos más pequeños de empalme hasta -5,1 veces se puede observar después de 24 horas. Posteriormente, el nivel no ha cambiado hasta 72 horas.

En ratas tratadas con CCl ₄ una disminución de los de larga duración AFP-RNA (AFP1; - 4,5 veces) y el empalme de los productos más pequeños (AFP2; -4,5 veces) puede verse después de 12 horas. A continuación, un aumento continuo de ambos productos, con un máximo a las 72 horas (AFP1 hasta 7,0 veces y AFP2 hasta 4,8 veces) (Figura 5] puede ser observado.

En el hígado fetal de ratas, en comparación con uno normal de hígado de rata control, un fuerte incremento de los de larga duración AFP-RNA (AFP1) podría ser detectada con un máximo en el día 14 (21500 veces); posteriormente, una disminución hasta 1000 veces puede verse en el día 18 (Figura 6]. En el caso de las pequeñas variantes de AFP-RNA (AFP2), un claro aumento menor se observó también con un máximo en el día 14 (582 veces) (Figura 6].

En el modelo de control de reacción de fase aguda, sólo un poco de los cambios de larga duración AFP-RNA (AFP1) y de los tamaños más pequeños de AFP-RNA (AFP2) se puede observar (Figura 7].

La expresión de los receptores nucleares huérfanos genes se analizó por PCR en tiempo real en los modelos de rata de la regeneración hepática, daño hepático agudo, en el hígado fetal y el control como en respuesta de fase aguda. Para cada modelo, hemos realizado dos series diferentes y los valores medios y las desviaciones estándar se muestra en la Figura 3 al 7

Después de PH en 2-AAF ratas tratadas, el de larga duración AFP-RNA (AFP1) se aumentó considerablemente el día 7 (399 veces) y el día 11 (129,8 veces). Los tamaños más pequeños de AFP-RNA (AFP2) fueron sólo aumentó en estos momentos a una pequeña medida. Después de un PH en la regulación de Rev-Erb A se produce en el día 1 (-3,9 veces), el día 3 (-5,5 veces), el día 7 (-3,0 veces) y día 13 (-12,7). La más fuerte hasta la regulación de los de larga duración AFP-ARN se puede observar en el día 7, cuatro días más tarde, Rev-Erb A mostró la más fuerte en la regulación (-32,3 veces). Rev-Erb B fue ligeramente inferior regulado en cada momento, el más fuerte en la reglamentación se puede observar en el día 13 (- 4,3 veces). N-CDR sólo mostró ligeros cambios en este modelo (Figura 3].

Después de PH sin 2-AAF tratamiento, una en la regulación de Rev-Erb A, Rev-Erb B y N-CDR podría ser detectado en cada momento. El más fuerte en la regulación de Rev-Erb Rev A y B-Erb se puede observar después de 16 horas (Rev-Erb A veces -21,5 y Rev-Erb B -25,7 veces). Al mismo tiempo, también el más fuerte en la regulación de ambas AFP-ARN productos (AFP1 y AFP2) podrían ser detectadas (Figura 4].

En el caso de daño hepático agudo tras el tratamiento CCL _4, una continua disminución de Rev-Erb A partir de 6 horas (-9,4 veces) hasta el máximo a las 48 horas (-102,3 veces) se puede observar, pero después de 24 horas en relación con el control de cambios no pudieron ser detectados. A partir de 48 horas (-102,3 veces) a 96 horas (+2,1 veces) hasta una regulación de Rev-Erb A podría ser visto. Rev-Erb B muestra abajo la regulación continua de 6 horas (-4,8 veces) a 72 horas (-22,1 veces), pero después de 24 horas en relación con el control de cambios no pudieron ser detectados. A partir de 72 horas (-22,1 veces) a 96 horas (+2,0 veces) hasta una regulación de Rev-Erb B podría ser visto. N-CDR muestra sólo ligeros cambios en este modelo (Figura 5].

En el hígado fetal Rev-Erb A y Rev-Erb B son las reguladas en cada momento, la máxima en la regulación se llegó al día 12 (Rev-Erb A: 270 veces / Rev-Erb B: 186 veces), dos días antes de que el máximo de regulación de larga duración AFP RNA. N-CDR fue ligeramente inferior regulado en cada momento (alrededor de 1,5 veces) (Figura 6].

En el modelo de rata de reacción de fase aguda, los más fuertes en la regulación de Rev-Erb A se produce a las 2 horas (-14,1 veces), las 24 horas (-22,8 veces) y 36 horas (-23,4 veces) después de aceite de trementina tratamiento. Un aumento continuo de Rev-Erb B puede verse desde 30 minutos (+1,7 veces) a 4 horas (+4,7 veces) después del tratamiento con aceite de trementina, con excepción de 2 horas, en este momento, Rev-Erb B se redujo regulado. A partir de 4 horas (+ 4,7 veces) a 24 horas (- 4,6 veces) en una continua regulación de la Rev-Erb B podría ser detectado; después de que, Rev-Erb B fue de nuevo hasta reguladas (48 horas: + 2,0 veces) (Figura 7].

Los resultados de Rev-Erb Rev A y B-Erb expresión debe ser verificada en el nivel de proteínas. Por lo tanto, Western blot análisis se realizaron con muestras de PH ratas con y sin 2-AAF tratamiento. En realidad, sólo humanos anticuerpos específicos contra el Rev-Erb A y Rev-Erb B están disponibles, mientras que el Rev-Erb B debe una reacción cruzada con la rata. Los anticuerpos disponibles no han sido probados de la fabrica en "muestras naturales", sólo han sido probados en células CHO-transfectadas con el de larga duración Rev-Erb Rev A y B-Erb transcripción. La proteína tamaño de la Rev-Erb A y Rev-Erb B es de 70 kDa. En el Western blot, no específico de banda puede ser detectado a 70 kDa (datos no presentados). Hay dos posibles razones para la búsqueda de nuestro siguiente: (1) los anticuerpos no son específicos para rata o muestras (2) el nivel de proteína es demasiado bajo, porque Rev-Erb A y Rev-Erb B son las reguladas en nuestros modelos. Las muestras para el análisis de Western blot También se extrajeron hepatoblasts de rata y células de hepatoma humano (Hep G2, Hep 3B), pero también en estas líneas de células específicas banda no pudieron ser detectados a 70 kDa.

La misma anticuerpos también se utilizaron técnicas para inmunohistoquímico. Diferentes técnicas inmunohistoquímico (estándar indirecta peroxidasa y el aumento de la tinción de peroxidasa basado en la detección (Envision; Dako, Glostrup, Dinamarca)) se aplicaron de manera diferente obsesionada hígado secciones (metanol-acetona y obsesionada obsesionado paraformaldehído) resultaron infructuosos en la rata (datos no presentados) .

La expresión de la proteína AFP fue analizado por la técnica de Western blot. La larga duración AFP-ARN, lo cual es altamente expresado en el hígado fetal, se traduce en 68 kDa y 70 kDa de proteínas, mientras que los más pequeños AFP-ARN variantes, que se expresan en el hígado de adultos, se traducen en proteínas más pequeñas de 58 kDa, 54 kDa y 44 kDa [11]. En primer lugar, hemos realizado el análisis de Western blot con el hígado fetal (días 12, 14, 16 y 18) para verificar si utilizan la AFP detectado anticuerpos a la escuela para pedir AFP-ARN proteína de 68 kDa y 70 kDa. En el Western blot a los 14 días, una fuerte banda podría ser detectado a 68 kDa y 70 kDa (Figura 8].

A continuación, se realizó el análisis de Western blot con muestras de hígados de ratas después de PH con y sin 2-AAF tratamiento. En las muestras de ratas tratadas con 2-AAF, sólo una débil banda podría detectarse en una proteína de tamaño de 68 kDa y 70 kDa, en comparación con el hígado fetal, sin cambios en los diferentes puntos temporales.

AFP fetal es una glicoproteína producida por el saco de yema de huevo, hígado fetal y el intestino, pero su síntesis se apagará después del nacimiento [25]. AFP se utiliza como marcador de suero para el diagnóstico de carcinoma hepatocelular [8, 26]. Séricos elevados de AFP nivel también se ha observado en diversas enfermedades crónicas del hígado, donde continua hepatocelular se produce un daño hepatocelular y la regeneración se supone que tendrá lugar [27]. En este caso, maduro hepatocitos se supone que vuelve a diferenciar hepatoblasts y ser responsables del aumento de los niveles séricos de AFP fetal. No obstante, y en un estudio, AFP expresión no se ha encontrado en la regeneración de hígado humano después de PH [28]. A pesar de que muchas investigaciones sobre la función de AFP se ha llevado a cabo, la regulación y función biológica de AFP no está aún clara.

El adulto puede regenerar el hígado de hepatocitos maduros reingresar en ciclo celular después de la resección quirúrgica o lesión. Sin embargo, esta respuesta proliferativa es a menudo afectada por la enfermedad hepática crónica. La activación de un facultativo del compartimiento de células madre (células ovales) es considerado como un mecanismo alternativo para la regeneración de enfermedad hepática crónica [29 - 31]. En modelos de roedores hepatocarcinogenesis y no cancerígenos lesión modelos, se ha sugerido que las células ovales podría representar un facultativo progenitoras hepáticas / compartimiento de células madre proliferan y diferenciar tanto en hepatocitos y las células epiteliales biliares, bajo ciertas condiciones [32 - 34]. PH combinados con 2-AAF alimentación es un modelo tradicional para activar las células ovales, en el hígado de la rata [35, 36]. Varios marcadores de células ovales se han sugerido. Sin embargo, muchos de los marcadores no son específicos para las células de forma ovalada, pero son expresadas por las células epiteliales biliares (CK-7, CK-19) y de células hematopoyéticas (c-kit, Thy-1) [37, 38]. AFP expresión génica parece representar el marcador más fiable para las células de forma ovalada, porque es ampliamente estudiado en humanos y modelos animales y no es expresada por otros tipos de células, con la excepción de algunas células carcimoma hepatocelular [11]. Se estudió la expresión de la larga duración AFP-RNA (gran forma, el 2,1 kb mRNA) y de los más pequeños de empalme variantes durante la regeneración hepática, daño hepático agudo, en el hígado fetal y en condiciones de respuesta de fase aguda en la rata. Del Norte mancha análisis mostró que la larga duración AFP-ARN se produce sólo después de PH en 2-AAF ratas tratadas, pero no después del simulacro de operación de 2-AAF ratas tratadas o en los controles normales.

La inmunohistoquímica reveló grupos de AFP-células positivas en la región periportal de 2-AAF ratas tratadas después de PH en el día 7, la típica zona en la que principios de la proliferación de células ovales se lleva a cabo [39]. Al mismo tiempo puntos, PCR en tiempo real análisis se realizaron con los dos primers AFP (AFP1 y AFP2). Curiosamente, y en el caso de imprimación AFP1, un fuerte incremento se observó en comparación con el mando normal y en caso de imprimación AFP2 sólo un débil aumento se observó. Para verificar si AFP1 primer podría detectar el de larga duración AFP-ARN durante la regeneración hepática en 2-AAF ratas tratadas después de PH, el producto de amplificación de imprimación AFP1 fue utilizado como una sonda del Norte para blot. Esto se realizó con muestras de hígado de ARN 2-AAF ratas tratadas, después de PH o después del simulacro de operación. Una señal positiva de hibridación de aproximadamente 2,1 kb sólo se observó en las muestras de hígado 2-AAF ratas tratadas después de PH, pero no después de la operación simulada (Figura 2]. Con el fin de apoyar nuestra hipótesis, los dos pares de primers fueron probados también en hígado fetal de ratas. En el hígado fetal a la escuela para pedir AFP-ARN es altamente expresado. En PCR en tiempo real de análisis, un fuerte incremento en la expresión de larga duración AFP-RNA (AFP1) con un máximo en el día 14 (21500 veces) puede ser mostrada. Sólo una débil expresión (582 veces) de los más pequeños AFP-ARN variantes (AFP2), al mismo tiempo, los puntos se observó (Figura 6]. AFP fetal no se detectó en el hígado de los animales después de PH normal. En este sentido, concluyó que detecta primer AFP1 el de larga duración AFP-ARN y el primer AFP2 detecta el truncado AFP. La larga duración AFP-ARN se traduce en un 68 kDa y 70 kDa proteína. AFP El anticuerpo se utilizó para el Western blot detectó el 68 kDa y 70 kDa de proteínas en el hígado fetal; una fuerte señal puede verse en los tamaños. Pero en caso de las ratas tratadas con 2-AAF y PH, sólo las señales débiles podían ser detectados en un 68 kDa y 70 kDa en los diferentes puntos temporales, por otro lado, los productos más pequeños de proteínas puede no ser visto, sin embargo, no firme los cambios se pueden observar en nivel de proteínas. La posible explicación de estos hallazgos es que el importe de la larga duración AFP-ARN en proteínas es muy bajo en comparación con la que figura en el hígado fetal, por lo tanto, los cambios no pueden ser detectados en las muestras. La diferencia entre fetal AFP la expresión génica en el hígado fetal (máximo a los 14 días: 21500 veces) y en el hígado de 2-AAF los animales tratados después de PH (máximo en 7 días: 400 veces) fue de aproximadamente 54 veces.

En el CCL ₄ rata modelo de daño hepático agudo un aumento de larga duración AFP-RNA (AFP1) hasta 7 veces, y de los más pequeños de empalme variantes (AFP2) hasta 5 veces se puede observar a las 72 h horas. Nuestros resultados son similares a los de Lemire et al. [11]; de hecho, se describe también el incremento máximo de la escuela para pedir una AFP-RNA a las 72 horas y de las transcripciones más pequeños hasta 4 veces al mismo tiempo.

En el modelo de regeneración hepática normal (sin PH 2-AAF tratamiento), el pleno-lenght AFP-transcripción de ARN (AFP1) es ligeramente inferior regulado en cada momento, no realmente fuertes cambios pueden ser detectados. Pero en caso de los más pequeños AFP-ARN transcripciones (AFP2), una regulación hacia abajo de 2 horas (- 4,7 veces) hasta 16 horas (-25,7 veces) podría ser visto. En comparación a 16 horas, un aumento de los productos más pequeños de empalme hasta -5,1 veces se puede observar después de 24 horas y, a continuación, el nivel de no cambiar hasta 72 horas. Los ligeros cambios en el caso de larga duración AFP-ARN y las posibilidades más fuertes en caso de las pequeñas variantes de AFP-ARN, como se ha descrito anteriormente, apoyo la teoría de que, en el hígado adulto, normalmente sólo los más pequeños variantes y se expresaron no la regeneración se lleva a cabo a través de células de forma ovalada. No inducción de la escuela para pedir una AFP-ARN o la menor AFP-transcripción de ARN se puede observar después de la inducción de una reacción de fase aguda de aceite de trementina en nuestro modelo de control.

Hasta el momento, la regulación exacta de AFP aún se desconoce, por lo que otro objetivo de nuestro estudio fue analizar la expresión de los receptores nucleares huérfanos genes (Rev-Erb A, Rev-Erb B y N-CDR) propone para controlar la expresión de AFP negativamente. Transfección experimentos realizados en humanos hepatoma Hep G2 células demostró que la sobreproducción de ROR-α estimula la actividad de AFP potenciadores en un dependiente de la dosis de forma, mientras que la de Rev-Erb Rev A y B-Erb tenido el efecto opuesto. Se sugirió que las actividades de los huérfanos receptores en las células hepáticas de origen endodermal o podría modular la expresión génica AFP, en respuesta a una variedad de desarrollo o estímulos cancerígenos [16]. En nuestro estudio, la expresión de los receptores huérfanos Rev-Erb A, Rev-Erb B y N-CDR se investigó, en vivo, y en distintos modelos animales de regeneración del hígado, daño hepático, la reacción de fase aguda y en el hígado fetal. En estos modelos, una por la regulación de los receptores huérfanos (Rev-Erb A, Rev-Erb B y N-CDR) puede verse, en casi todos los puntos temporales. La expresión de la escuela para pedir una AFP-ARN fue regulada hasta después de PH en 2-AAF ratas tratadas (máximo en 7 días: 400 veces) (Figura 3] y después de daño hepático agudo (CCL ₄ tratamiento; máximo a las 72 horas: 7 veces) (Figura 5], al mismo tiempo, los puntos Rev-Erb Rev A y B-Erb fueron siempre abajo está regulado. Esto significa que en esos momentos no el efecto inhibitorio de Rev-Erb A y Rev-Erb B de la AFP la expresión génica se lleva a cabo. Sin embargo, ninguna AFP hasta la regulación se observó en los otros modelos cuando los genes de los receptores nucleares huérfanos También se establecen regulado. Pero la razón por la cual el huérfano receptores nucleares se redujeron regulado en casi todos los puntos temporales sigue siendo poco clara. Las posibles explicaciones para los hallazgos son, por un lado, que la regulación de la AFP y los genes receptores nucleares huérfanos difiere en los distintos organismos y, por otro lado, que vivo en algunos otros factores adicionales podrán participar en la regulación de la AFP la expresión génica y de los receptores nucleares huérfanos. Porque no rata anticuerpos específicos contra el Rev-Erb A y Rev-Erb B disponible comercialmente, un intento de comprobar los resultados de la PCR en tiempo real a nivel de proteínas puede no ser realizado. Por lo tanto, y como una alternativa, hemos intentado Western blot y análisis inmunohistoquímico de tinción con anticuerpos humanos, pero no específico señal puede ser detectada. Las posibles explicaciones para estos resultados son los siguientes: (1) los anticuerpos no reaccionan con la rata o muestras (2) el nivel de proteína es demasiado bajo. Para hacer frente al segundo punto, se estudió la relación entre el pleno de longitud (fetal AFP) y adultos (más pequeñas variantes) AFP en el ARN y, entonces, a nivel de proteínas. La diferencia entre la expresión de larga duración AFP-ARN en el hígado fetal de ratas (máximo a los 14 días: 21500 veces) y después de PH en 2-AAF ratas tratadas (máximo en 7 días: 400 veces) fue de aproximadamente 54 veces. El nivel de proteínas, estudiado por Western blot, podemos reproducir estos resultados. En comparación con el hígado fetal, con una fuerte señal específica, la de larga duración AFP proteína fue apenas detectables en el total de proteínas de hígado de la rata después de hígados con PH después del 2-AAF tratamiento. Por lo tanto, es comprensible que la detección de factores de transcripción, como los receptores nucleares huérfanos se hizo aún más difícil, porque son normalmente bajos y expresado en este estudio aún más abajo está regulado.

La proliferación de las células ovales se pudo demostrar en 2-AAF ratas tratadas después de PH, a nivel de ARN de PCR en tiempo real con un par de primers (AFP1) y por nivel de proteína inmunoticción. Sólo las huellas de forma ovalada de células específicas AFP transcripciones se puede observar en la regeneración de hígados sin 2-AAF tratamiento. Los genes del receptor huérfano, lo que podría influir en la AFP la expresión génica in vitro, mostró en el óvalo de células modelo (PH con 2-AAF tratamiento) y, en el modelo de daño hepático agudo, una regulación hacia abajo de Erb Rev A y B, Rev Erb al mismo tiempo de puntos hasta la regulación de la expresión génica AFP. Sin embargo, por la regulación de los receptores nucleares huérfanos genes podrían también ser observado en casi todos los puntos temporales en los diferentes modelos, por lo que la correlación de AFP y huérfano de genes receptores nucleares no es realmente clara. Más investigaciones serán necesarias para la comprensión de la regulación de AFP gen en modelos de roedores del óvalo y la proliferación de las células humanas en carcinomas hepatocelulares. Finalmente, los nuevos factores de regulación de la expresión génica AFP podrían ser utilizados como marcadores de principios de hepatocarcinogenesis.

Hombre ratas Wistar (180-200 g) fueron proporcionados por Winkelmann (Borchen, Alemania) y utilizados para modelos animales de lesión hepática aguda o respuesta de fase aguda y más utilizado para el estudio de la regeneración hepática después de PH. Dos series se realizaron para cada modelo. Los animales se mantuvieron con los alimentos y el agua, ad libitum. Para cada modelo de regeneración hepática y daño hepático, dos series diferentes se realizaron. Los animales se mantuvieron de acuerdo con nuestra institución y de los Institutos Nacionales de Salud.

Proliferación de células progenitoras hepáticas (oval células) fue estudiada en ratas tratadas con 2-AAF, después de PH. Las ratas recibieron 1,5 mg 2-AAF diariamente por sonda intragástrica y PH o simulada operación se realizó en el sexto día. En el día de la cirugía y el primer día postoperatorio, 2-AAF no se dio. PH se realizó bajo anestesia con éter de midventral laparotomía con 70% de la resección hepática. Un control animal fue sometido a operación simulada por el mismo operador. En condiciones similares, las operaciones de simulacro consistió en un midventral laparotomía, la manipulación suave del hígado y cierre quirúrgico del abdomen. El tratamiento con 2-AAF se reinició en el segundo día postoperatorio y continuó durante otros 5 días para un total de dosis de 15 mg por rata. Las ratas se sacrificaron el día de la cirugía (control), el día 1 después de PH o simulado, y los días 3, 7, 11 y 13 (cada PH y la falsa operación). La regeneración hepática normal sin 2-AAF se estudió el tratamiento estándar después de PH o falsa operación. Las ratas se sacrificaron el día de la cirugía (control), y 2, 4, 8, 16, 24, 48 y 72 horas, después de PH o falsa operación. Los hígados fueron snap-congelado en nitrógeno líquido y se almacenan a -80 ° C.

Acute liver damage was induced in 8 weeks old Wistar rats by oral administration of a CCl ₄ /maize oil solution (50% v/v) according to Yokoi [ 40 ], as previously described [ 41 ]. For studying the time kinetics, rats were sacrificed 6, 12, 24, 48, 72 and 96 hours, after a single CCl ₄ administration. Livers were snap-frozen in liquid nitrogen and stored at -80°C.

Acute phase reaction was induced in male Wistar rats by injection of 2.5 ml/kg turpentine oil into the right and left hind limp, intramusculary, as reported [ 42 ]; control animals received no injections. Liver tissue was removed after 30 minutes, and 1, 2, 4, 6, 12, 24, 36 and 48 hours, after injection. Livers were snap-frozen in liquid nitrogen and stored at -80°C.

Rat liver cryostat sections were fixed in methanol/acetone, at -20°C. After inactivation of endogeneous peroxidases with 0.01 M glucose, 250 U glucose oxidase and 1 mM sodium azide in phosphate-buffered saline (PBS), sections were incubated with fetal calf serum, for 30 minutes at room temperature. The sections were incubated with a rabbit antiserum against human AFP (DAKO, Glostrup, Denmark) diluted 1:50 in PBS, at 4°C overnight. After washing in PBS, sections were incubated with a peroxidase-conjugated secondary antibody (Swine anti-Rabbit, DAKO, Glostrup, Denmark), for 60 minutes at room temperature. As a substrate for immunostaining, 3,3'-diaminobenzidine tetrahydrochloride was used.

Lysates were prepared by homogenization of tissue at 4°C in 20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 5 mM EDTA, 3 mM EGTA, 1 mM DTT, 1% SDS, 1 mM PMSF, and protease inhibitor cocktail (Sigma-Aldrich Inc.). Samples were cleared by centrifugation at 15000 g for 15 min at 4°C, and the protein concentration was measured by BCA assay (Pierce, Rockford, IL, USA), using bovine serum albumin, as standard. Protein lysates were separated on SDS-polyacrylamide gels, electrotransferred to polyvinylidene difluoride membranes (Invitrogen, USA), probed with primary antibodies overnight. The appropriate peroxidase-conjugated secondary antibodies (DAKO, Glostrup, Denmark) in a dilution of 1:5000 were then added and incubation continued for 1 hour, at room temperature. Bound antibodies were visualized using chemiluminescent substrate (ECL; Amersham-Pharmacia, UK). Equal loading was previously controlled by transient Ponceau S staining. The primary antibodies included: human anti-AFP (DAKO, Glostrup, Denmark), human anti-RevErbα/NR1D1 (R&D Systems, Wiesbaden, Germany) and human anti-RevErbβ/NR1D2 (R&D Systems, Wiesbaden, Germany). Probes were also extracted from rat hepatoblasts and hepatoma cells (Hep G2, Hep 3B).

Frozen liver samples were lysed in 3 ml guanidinium isothiocyanate buffer [ 43 ], as described elsewhere [ 44 ]. Subsequently, total cellular RNA was isolated by cesium chloride density gradient centrifugation [ 45 ] and the RNA concentration was determined photometrically.

Total RNA was resolved by agarose gel electrophoresis, transferred on nylon membranes and hybridized with cDNA probe specific for the full-length AFP mRNA (AFP1 fragment). The cDNA probe was 32P-labed by nick translation or by random priming. Hybridiziation was performed under high-stringency conditions for 2 hours, at 68°C, using the QuickHyB ^® (Stratagene, La Jolla, California). Posthybridization washes were performed 2 times for 15 minutes each at room temperature, and 1 time for 5 to 15 minutes at 60°C in two fold standard sodium citrate containing 0.1% sodium dodecyl sulfate (SDS). Nylon filters exposed to Kodak X-omat x-ray films, at -80°C.

The reverse transcriptase reaction was carried out in 0.1 M Tris chloride (pH 8.3), 10 mM magnesium chloride, 10 mM dithiothreitol using 1 mM of each deoxynucleotide (dATP, dCTP, dGTP, dTTP, Boehringer Mannheim, Germany), 200 units of Moloney murine leukaemia virus reverse transcriptase (M-MLV-RT, Invitrogene, Karlsruhe, Germany), and 16 units of RNasin in a total volume of 20 μl for 1 hour at 40°C using 1 μg denatured total RNA and Oligo (dT) ₁₅ primer.

The expression of mRNAs was measured by real-time PCR, a method to precisely quantify mRNA. The cDNA was amplified with a set of gene-specific primers and SYBR Green Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, California), according to the manufacturer's protocol, in a PRISM 7000 Sequence Detection system (Applied Biosystems, Foster City, California). Primers used in the real-time PCR experiments are summarized in Table 1 . Amplified PCR products were monitored by measuring the increase in fluorescence caused by the binding of SYBR Green dye to double-stranded DNA. Real-time PCR was performed twice for each sample. The amount of comparative expression level of the target, normalized to an endogenous reference (β-actin) and relative to a calibrator (control animal at time point 0 h), is given by 2 ^-ΔΔC _T .

Los autores declaran que no tienen intereses en conflicto.

VM was responsible for the primer design, carried out the Northern blot analysis and real-time PCR analysis, and drafted the manuscript. KT carried out experiments with the rat models for acute liver damage (treatment with CCl ₄ ) and for acute phase reaction (treatment with turpentine oil). DB carried out the experiments with rat models for liver regeneration (PH with and without 2-AAF treatment) and the immunostaining with an antibody against AFP. AE performed the experiments with the fetal rat liver. GR conceived this study, and participated in the design and coordination of the different experiments and helped to draft the manuscript.