BMC Cancer, 2006; 6: 162-162 (más artículos en esta revista)

Respuesta histológica de carcinomatosis peritoneal después de hipertermia chemoperfusion intraperitoneal (HIPEC) en las investigaciones experimentales

BioMed Central
Joerg OW Pelz (joerg.pelz @ chir.imed.uni-erlangen.de) [1], J Doerfer (joerg.doerfer @ chir.imed.uni-erlangen.de) [1], A Dimmler (arno.dimmler @ patho.imed.uni-erlangen.de) [1], W Hohenberger (werner.hohenberger @ chir.imed.uni-erlangen.de) [1], T Meyer (thomas.meyer @ chir.imed.uni-Erlangen. de) [1]
[1] Departamento de Cirugía, Universidad de Erlangen-Nuremberg, Alemania
[2] Instituto de Patología de la Universidad de Erlangen-Nuremberg, Alemania

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Resumen
Fondo

En pacientes seleccionados con carcinomatosis peritoneal por cáncer colorrectal pronóstico puede ser mejorada por la quimioterapia intraperitoneal hipertermia (HIPEC) después de cirugía citorreductora. El objetivo de este estudio fue evaluar la respuesta tumoral de carcinomatosis peritoneal por tumor-bearing ratas tratadas con HIPEC.

Métodos

CC531 carcinoma de colon (2,5 × 10 6 células), implantado por vía intraperitoneal a Wag / Rija ratas, se trató de hipertermia quimioterapia intraperitoneal. Después de 10 días de crecimiento tumoral los animales fueron asignados aleatoriamente en cinco grupos de seis animales cada uno: grupo I: control (n = 6), grupo II: simulacro de animales operados (n = 6), grupo III: hipertermia perfusión intraperitoneal (HIP), sin citostáticos, grupo IV: HIPEC con mitomicina C en una concentración de 15 mg / m 2 (n = 6), grupo V: Mitomicina C ip solo en una concentración de 10 mg / m 2 (n = 6). Después de 10 días, el grado de propagación del tumor e histológicos se analizaron los resultados de la autopsia.

Resultados

Todos los animales de control desarrollado gran intraperitoneal el crecimiento del tumor. Histológico del tumor de carga se redujo significativamente en el grupo III y grupo V, y fue más bajo en el grupo IV. En el grupo II la carga tumoral fue significativamente más alta que en el grupo I. Implantada metástasis se redujo significativamente en el grupo IV en comparación con el grupo Iy grupo II.

Conclusión

Estos resultados indican que HIPEC es un tratamiento efectivo para la carcinomatosis peritoneal en este modelo animal. HIPEC reducido macroscópicas y microscópicas del tumor intraperitoneal propagación.

Fondo

Cánceres gastrointestinales se repiten con frecuencia con enfermedad metastásica limitada a la cavidad abdominal. El peritoneal tasa de fracaso entre los pacientes que presentan recidiva tras resección de cáncer de colon es de aproximadamente 25-35% [1].

Peritoneal difusión de las células del cáncer de colon es una causa común de morbilidad y mortalidad en la enfermedad recurrente, que puede resultar en obstrucción intestinal, ascitis y fístula intestinal. La mediana de supervivencia tras la manifestación de carcinomatosis peritoneal es de unos 6-9 meses [2].

Siembra peritoneal por cáncer colorrectal es relativamente resistente a la quimioterapia sistémica. Una estrategia de tratamiento para estos pacientes sería hipertermia quimioterapia intraperitoneal (HIPEC). La primera clínica hipertermia quimioterapia en el tratamiento de la carcinomatosis peritoneal (PC) fue realizada por Spratt et al. en 1980 [3]. Este diseño terapéutico es considerado como uno de las mejores opciones para el tratamiento de la metástasis peritoneal de carcinoma gastrointestinal. La viabilidad de la terapia intraperitoneal ha sido demostrado por varios grupos que utiliza esta técnica en combinación con cirugía de citoreducción para tratar la carcinomatosis peritoneal [4, 5].

Macroscópico de la resección completa seguida de PC HIPEC es potencialmente capaz de curar pacientes seleccionados se presentan con enfermedad confinada al peritoneo. El objetivo de la cirugía citorreductora es conseguir una resección casi total de todas las muestras de tejido tumoral. En pacientes seleccionados, HIPEC puede dar lugar a un período de cinco años la supervivencia global del 27% en PC [6].

Aunque la técnica de hipertermia chemoperfusion intraperitoneal en los seres humanos se ha empleado en el tratamiento del cáncer. En los ensayos clínicos humanos de las poblaciones son muy heterogéneos y modelos animales posibles diferencias son menores. En este estudio, HIPEC fue evaluada en forma experimental tumor teniendo rata modelo.

Métodos
Animales

Para investigar HIPEC una rata se utilizó el modelo descrito por primera vez por Martin et al. y modificado en nuestro grupo de investigación [7].

Mantenimiento y cuidado de todos los animales de experimentación se llevó a cabo siguiendo las directrices de los responsables locales de protección de los animales y la Comisión llevará a cabo de conformidad con las directrices nacionales (Instituto Nacional de Salud para el uso de animales de laboratorio; Nr. 621-2531.31-5/03) . 30 endocriadas masculino libre de agentes patógenos WAG (Wistar Albino Glaxo) las ratas (Charles River, Sulzbach, Alemania) en edad reproductiva de peso de 200 a 240 g, (Sulzfeld, Alemania), se utilizaron en este estudio. Ellos fueron alimentados con una dieta estándar de laboratorio y el agua del grifo ad libidum. Los animales fueron mantenidos en jaulas individuales durante el experimento con 12 horas de luz y oscuridad ciclo y temperatura ambiente de 25 ° C, con una humedad relativa de 55 por ciento.

Tumor modelo

El tumor línea celular utilizada (alemán del Centro de Investigación del Cáncer, de Heidelberg, Alemania) y fue un adenocarcinoma de colon en la rata. Estos inmunocompetentes línea celular tumoral (CC531) se deriva de un G2 diferenciado carcinoma de colon inducido por 1,2-dimetilhidrazina [8].

Para el control de posibles mutaciones de líneas de células, sólo las culturas que han sufrido menos de 10 pasajes fueron utilizados en los experimentos. Intraperitoneal tumor aplicación se realizó con un tumor suspensión producidos in vitro. La línea celular tumoral se cultivó a 37 ° C y el 5% de CO 2 en una incubadora a 20 ml de medio completo (RPMI 1640 [Gibco, Life Technologies, Eggenstein, Alemania], el 10% de suero fetal bovino [Seromed, Biochrom, Berlín, Alemania ] Y el 1% penicilina / estreptomicina [Seromed]). Después de tres días, las células fueron separadas con 3 ml de tripsina (0,25%). Vitalidad se evaluó en un hematocitómetro Bürker después de la adición de trypan azul. Viabilidad siempre superó el 95 por ciento. Después de vital contar, la suspensión había una densidad de 2,5 × 10 6 vital cells/200 μ l de la suspensión antes de ser inyectados en los animales.

En todas las ratas, las células tumorales implantación se logró a través de una laparotomía 6 cm. Las ratas fueron anaesthetized isoflurano por inhalación (Baxter, Unterschleißheim, Alemania). El tumor de células suspensión se inyecta bajo la cápsula de la superficie peritoneal en la parte superior derecha del abdomen, tal como se describe antes de que [7].

Los animales fueron asignados al azar en cinco grupos de seis animales cada uno:

Grupo I: control

grupo II: simulacro de animales explotados

grupo III: hipertermia perfusión intraperitoneal (HIP), sin drogas citostáticas,

grupo IV: HIPEC con mitomicina C en una concentración de 15 mg / m 2

grupo V: Mitomicina C ip solo en una concentración de 10 mg / m 2

10 días después de la inoculación tumoral, los animales del grupo II-V se sometió a una nueva laparotomía, tal como se describe. En el grupo II y III se realizó la perfusión. En el grupo II el tumor remainded sin tratar. En el grupo V mitomicina C se aplivated intraperitonally en 5 ml de solución salina. Saline no es eliminado. Abdomen estaba abierto durante 90 minutos en los grupos III y V.

En comparación con la situación clínica, la ratio de MMC en nuestra prueba experimental fue 1,5:1 (HIPEC ip frente a la terapia). Esto se realizó según lo descrito antes [7].

Sistema de perfusión

El HIPEC es un sistema de circuito cerrado, lo que permite la circulación perfundido con una variable dinámica de flujo de 40-50 ml / minuto. El calentado perfundido (500 ml) fue impulsado por una bomba de rodillo con dos sincrónicamente en funcionamiento la bomba de jefes en un solo eje para la entrada y la salida de líneas (MASTERFLEX ®). La entrada del catéter se inserta en la parte superior del abdomen entre los hepáticos y diafragmática superficie, y una salida del catéter fue colocado dentro de la bolsa de Douglas.

Intraperitoneal La temperatura se mantuvo entre 40,5 y 41 ° C. Base de temperatura se registró durante 5 minutos antes del tratamiento. La temperatura se medirá durante la aplicación. En el grupo I (control), grupo II (simulado operado grupo) y grupo V (MMC) de medición de temperatura no se realizó.

Perfusión se realizó más de 90 minutos después de la perfusión de líquidos habían llegado a la temperatura requerida. La superficie corporal de los animales se calculó según la fórmula (A (m 2) m = k 0425 × 1 K 0725 / 139.315 (= m 2 de superficie corporal; m k = longitud del cuerpo K = 1 peso corporal). En el grupo IV, Mitomicina C se añadió al perfundido en tres dosis divididas en intervalos de 30 minutos en una concentración de 15 mg / m 2. La primera dosis que figuran 50% y las siguientes administraciones el 25% de la dosis total.

Después de la perfusión de la perfundido fue removido y el abdomen es de regadío con cloruro de sodio por 10 minutos. Afterthere, el abdomen se cerró en dos capas.

Evaluación

La corrección de todos los animales se mantuvieron en jaulas individuales. Los animales fueron mantenidos bajo condiciones estándar y se sacrificaron por una sobredosis de anestésicos y dislocación cervical en el 10 º día postoperatorio.

Todos los animales fueron autopsiados y carcinomatosis peritoneal fue evaluada cualitativa y cuantitativamente. El tumor macroscópico nódulos fueron contados. El tumor de peso se determinó usando una balanza digital.

Histología convencional usando H & E tinción de especímenes clasificados aparición de metástasis.

Clínica de respuesta tumoral

Intraperitoneal el crecimiento del tumor se puntuó con un índice semicuantitativo cáncer [9]. La puntuación variaba de 0 a 5 y fue realizada por 2 observadores independientes. Una puntuación de 0 significa que no hubo el crecimiento del tumor, con una puntuación de 1 indica la existencia de un tumor estimado diámetro inferior a 0,5 cm, con una puntuación de 2, un tumor de diámetro entre 0,5 y 1 cm, con una puntuación de 3, un tumor de diámetro comprendido entre el 1 de y 2 cm; un puntaje de 4, un tumor de diámetro entre 2 y 3 cm, y una puntuación de 5, un tumor de diámetro de más de 3 cm.

Histológico determinación de apoptosis índices de cáncer

Para determinar el alcance de la apoptosis en el tumor, las muestras fueron fijadas en 10% formol tamponado (pH 6,9-7.1). De cada embebido en parafina muestra, 5 μ m de espesor secciones fueron preparadas y teñidas con hematoxilina y eosina (H & E) para la luz examen microscópico. El 3'-end etiquetado de apoptosis de células de ADN se realizó con un ApopTag in situ apoptosis kit de acuerdo con los procedimientos recomendados del Kit (Roche Diagnostics, Mannheim, Alemania (in situ la muerte de la célula de detección de kit)).

El número medio de células apoptóticas y los órganos en toda la población de células de cáncer fue determinado por contar en su número 5 de alta potencia de los campos no áreas necróticas. El índice representa el número visible de apoptosis en las células del cáncer de estos campos.

El análisis estadístico

Los datos fueron analizados mediante el SPSS / PC + software estadístico. Las puntuaciones medias se calcularon. Todos los datos se presentan como el valor medio y desviación estándar de errores en la única grupos. Para la comparación de tumor microvessel volumen y densidad entre las diffent grupos no paramétricos se utilizó la prueba (Kruskal-Wallis). Las diferencias se consideraron significativas en un calculado el valor de p inferior a 0,05.

Resultados

La ubicación y el diámetro de metástasis peritoneal no difirió significativamente entre los cuatro grupos de tratamiento (II-V), en el momento del tratamiento. Antes de la intervención el diámetro de los tumores tratados fue de 5 mm. Hubo un solo tumor en todos los casos.

Ni la repentina muerte se produjo post-ni todos los animales tuvieron que ser sacrificados debido a efectos adversos. Todos los animales pueden ser evaluados 10 días después de la cirugía.

Tumor de carga

En el grupo I, todos los animales desarrollaron una amplia intraperitoneal el crecimiento del tumor. En el grupo IV, no tumor macroscópico se encontraron en 2 ratas, ratas en tres limitado sólo a nivel local se encontraron metástasis. Estos tumores fueron significativamente más pequeños que en todos los demás grupos (p <0,02). No propagación peritoneal difusa se encontró en el grupo IV.

Los valores medios del índice de cáncer peritoneal en el grupo I fue 3,5. En el grupo II la incidencia de metástasis propagación fue significativamente más alta que en el grupo I (p <0,05). Carcinomatosis peritoneal difusa se encontró en todos los animales del grupo Iy grupo II. Los índices de cáncer fueron significativamente inferiores en el grupo III y grupo V en comparación con el grupo I. El menor carga tumoral se observó en el grupo IV. No se observaron diferencias significativas en la carga total del tumor se encontró entre el grupo III y grupo V.

El tumor resultados del grupo IV se dan en la Fig 1.

Tumor de peso

La mediana del peso total del tumor (metástasis local y propagación del tumor) en el grupo I fueron 8,1 g ± 3,4 g. La mediana del peso total del tumor en el grupo II fue significativamente mayor (16,4 g ± 5,6 g). Total tumor peso en el grupo III y grupo V fue significativamente menor (5,9 g ± 2,8 g y 5,7 g ± 2,4 g, respectivamente). Menor peso total del tumor se encontró en el grupo IV (1,8 g ± 0,9 g mg) (P <0,05). No hubo diferencias en peso tumor en el grupo III y grupo V.

Tumor nódulos mediana 10 días después de la intervención fueron de 35 ± 12 en el grupo I y 68 ± 17 en el grupo II (p <0,05). Es significativo que el menor número de nódulos tumorales se encontraron en el grupo IV con 4 ± 7. En el grupo III y grupo V nódulos tumorales fueron de 21 ± 9 y 16 ± 10, respectivamente.

La mediana cantidad de ascitis en el grupo control (3 / 5 animales) fue 1,34 ml (0-3,2 ml), y 3,21 ml (1,2-4,9 ml) en el grupo II (5 / 5 animales). Ascitis no fue detectada en un animal en el grupo III, IV y V.

La respuesta clínica

En los grupos I, II y III en los seis animales el crecimiento del tumor se considera macroscolicaly. En el grupo V 1 / 6 animales mostraron una respuesta completa de la enfermedad. En el grupo IV 4 / 6 animales tenía un tumor clínicamente total remisión.

Hallazgos histológicos

En la histología convencional (H & E), los tumores de los grupos I y II no mostró diferencias morfológicas. Los tumores se encontraron con un adenocarcinoma moderada diferenciación, principalmente estructuras tubulares, vacuolar lumen y la formación de septos fibrosos. Necrosis espontánea tasa osciló entre aproximadamente 30 y 40%. La morfología del tumor no ha cambiado con el tamaño del tumor.

En el grupo IV los tumores mostraron signos de daño irreversible de células después del tratamiento. Células tumorales muestran claramente el encogimiento y la pérdida parcial de las células en contacto. Trombosis de los grandes buques adyacentes se encontraron en el tumor de músculo frontera. La infiltración con macrófagos estuvo presente en los grupos III y IV, pero fue más pronunciada en el grupo IV. En el grupo III hay menos signos de daño irreversible de células después del tratamiento que en el grupo IV (Tabla 1].

En el grupo I, II y III y V de todos los animales vital tumor fue encontrado. En el grupo IV en 4 / 6 animales vital tumor fue encontrado. Las zonas de tumor de células viables se encuentra en el centro del tumor. Las zonas de la apoptosis en el grupo IV fue de aproximadamente 3 mm de media en el margen del tumor. Dos animales de cada seis no mostraron vital tumor. En los grupos III y V no eran claras las zonas visto.

El cuadro 1 muestra la cinética de la apoptosis inducida por tumor de cada tratamiento. La evaluación semicuantitativo de immunhistological coloraciones reveló una apoptosis significativamente mayor nivel en el grupo IV (Fig. 2] que en el grupo I (Fig. 3] y II 10 días después de la intervención (p = 0,01). El máximo de la apoptosis inducida fue mayor en el grupo IV (p <0,036). La apoptosis generalizada situado en la margen del tumor.

Diferentes niveles de expresión en el grupo III y grupo V no eran detectables después de 10 días (p> 0,05)

Discusión

Carcinomatosis peritoneal representa un gran problema en el tratamiento de carcinomas colorrectales. Una nueva opción terapéutica es HIPEC. La ventaja de HIPEC es que thecytostatic de drogas, a diferencia de la quimioterapia sistémica, puede ser entregada directamente en la cavidad abdominal. La hipertermia aspecto de la terapia resulta en un efecto aditivo para la destrucción de las células tumorales.

Los recientes hallazgos clínicos sugieren que HIPEC es muy prometedora opción terapéutica. Muchos autores han podido demostrar la mejora de las posibilidades de supervivencia en determinados grupos de pacientes [10 - 14]. Los ensayos clínicos son, sin embargo, sobre la base de falta de homogeneidad y no normalizado. Además, la única posibilidad real para evaluar la respuesta tumoral son indirectas, a través de imágenes de los procedimientos y las tasas de supervivencia.

Debido a los prometedores resultados clínicos, es útil para estudiar HIPEC bajo condiciones experimentales. Los principales parámetros sería el estudio histológico y cambios morfológicos en carcinomatosis peritoneal después de HIPEC.

Un estudio publicado anteriormente limitadas a escala local de carcinomatosis peritoneal en un modelo de rata, en la que HIPEC podrían ser llevadas a cabo por la supervivencia a largo plazo [7], sirvió de base para estos experimentos. Este tumor modelo es muy similar en sus rasgos biológicos a la de los carcinomas colorrectal humano.

Un fenómeno que se ha descrito es el rápido aumento del crecimiento tumoral tras la manipulación quirúrgica.

Esto también se observó en nuestro simulacro de accionamiento grupo de animales en los tumores que crecieron más rápidamente que en el grupo control. Esto implica que la resección se asocia con un crecimiento acelerado en los tumores residuales. Se supone que la manipulación quirúrgica induce la liberación de factores de crecimiento que, además de su efecto sobre la curación también tienen un efecto estimulante sobre la proliferación tumoral.

Con el fin de examinar mejor los distintos aspectos de los efectos de HIPEC, dos grupos se han añadido, además de grupo IV; estos grupos investigados los dos noxa (citostáticos e hipertermia) individual (grupo III: hipertermia perfusión sin MMC; grupo V: MMC como mono-terapia). Dos grupos de control se utilizaron para la comparación con los grupos de tratamiento, a fin de que la progresión natural de la carcinomatosis peritoneal podría ser perseguido. Para venir lo más cerca posible de la situación clínica, los mismos parámetros fueron utilizados para la experimentación como la perfusión se utilizan en el tratamiento clínico de rutina. La única diferencia es la dosis más baja de MMC, al igual que otros grupos de investigación ya han demostrado que el tumor experimental puede ser completamente erradicada por medio de una dosis equivalente. La proporción de la dosis clínica HIPEC MMC / mono-terapia, sin embargo, mantiene [7].

La MMC dosis no era demasiado alto, como se desprende de nuestros resultados. Por lo tanto, un efecto terapéutico puede ser reconocido en el grupo 5, aunque todos los animales hicieron la experiencia clínica progresión tumoral. Histológico resultados mostraron que, además de áreas de necrosis tumoral y la apoptosis claramente las zonas, también hay muchas áreas con tumor de células viables. No fue posible destruir el tumor en cualquier animal completamente por la aplicación de MMC en solitario.

Resultados similares se observaron en el grupo III. Este grupo también mostró una importante desaceleración de crecimiento tumoral y el desarrollo de peritoneal. Sin embargo, la regresión del tumor se observó en todos los animales en este grupo. Resultados histológicos fueron similares a los del grupo V mostró parcial y daños al tejido tumoral. La destrucción completa del tumor y, por tanto, una terapia definitiva no se puede lograr.

Los resultados de los grupos III y V demuestran claramente que una combinación de los dos componentes que es necesario. Los resultados del grupo IV muestran que los beneficios de la terapia de combinación no se limitan a una nueva reducción significativa de la tasa de crecimiento en comparación con los grupos III y V. erradicación completa del tumor sin indicación histológico de tumor de células viables fue posible en dos de seis animales. El tamaño del tumor tratado disminuido considerablemente en estos dos. Aunque hubo también una clínica en la reducción de tamaño del tumor en los otros dos animales, las células tumorales viables aún podrían ser identificados después del HIPEC en dos de estos seis animales. Esto apoya las conclusiones de otros grupos de trabajo, que puso de manifiesto que HIPEC es el más adecuado para los tumores de menos de 5 mm debido a la limitada profundidad de penetración [15] Este tamaño (5 mm) fue elegido el tamaño del tumor en nuestros experimentos. Los resultados subrayan la importancia de realizar HIPEC en un entorno clínico sólo después de radicales cito.

El presente estudio demuestra también los límites de esta nueva terapia. Completar la erradicación de tumores experimentales después de HIPEC no fue posible en todos los animales. A pesar de la clara desaceleración del crecimiento tumoral y la inhibición de la siembra peritoneal difusa, más de un 10 días de plazo, nuevas mejoras para la optimización de HIPEC, como las nuevas drogas citostáticas, debe buscarse. Por otra parte, los resultados clínicos muestran que la reducción de la masa tumoral no es necesariamente asociados a una recaída de libre curso de la enfermedad en este modelo animal.

Conclusión

En este estudio el efecto de HIPEC en carcinomatosis peritoneal de los tumores colorrectales podrían ser investigados a largo plazo en un modelo animal normalizada. Los resultados mostraron que el crecimiento del tumor fue significativamente más lento y, en algunos casos, completamente detenido. Sin embargo, estos experimentos también mostraron que la terapia que parece haber sido clínicamente éxito residual de las zonas viables las células tumorales, tal vez la izquierda que conducen a la reaparición de la enfermedad.

Conflicto de intereses

Los autores declaran que no tienen intereses en conflicto.

Autores de las contribuciones

JP participado en el diseño llevado a cabo el tratamiento y redactó el manuscrito.

JD llevó a cabo el tratamiento.

AD llevaron a cabo los estudios histológicos

WH participiated en el diseño del estudio

TM participado en el diseño y coordinación del estudio.

Todos los autores leído y aprobado el manuscrito final.

Pre-publicación de la historia

La pre-publicación de la historia de este documento puede accederse en:

Agradecimientos

Este estudio fue apoyado por becas de ELAN (Erlanger Leistungsbezogene Anschubfinanzierung und Leistungsförderung)