Acta Veterinaria Scandinavica, 2006; 48(1): 4-4 (más artículos en esta revista)

Transporte intestinal de Campylobacter jejuni y Campylobacter coli entre el ganado de la cooperación Sur-oeste de Noruega y comparativas genotipo de las especies bovina y las cepas humanas mediante amplificación de la longitud de los fragmentos polimórficos

BioMed Central
G Johnsen (sarogde@online.no) [1], K Zimmerman (ka_zi@yahoo.com) [2], BA Lindstedt (Bjorn-arne.lindstedt @ fhi.no) [3], T Vardund (traute.vardund @ fhi.no) [3], H Herikstad (hallgeir.herikstad @ mattilsynet.no) [2], G Kapperud (georg.kapperud @ fhi.no) [3]
[1] Instituto Nacional de Veterinaria, Oslo, Noruega
[2] El noruego de Control de Alimentos, Sandnes, Noruega
[3] Instituto Noruego de Salud Pública, Oslo, Noruega
[4] La Escuela Noruega de Ciencias Veterinarias, Oslo, Noruega

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Resumen

En una encuesta realizada en 1999-2001, el transporte de thermotolerant campilácteros campilácteros en el ganado vacuno se investigó, y la diversidad genética de C. jejuni el plazo de un rebaño fue examinado y comparado con las cepas humanas. C. jejuni, C. coli y otros thermotolerant Campylobacter spp. Se aislaron de contenido intestinal del 26%, 3% y 2% de 804 bovinos, respectivamente. La frecuencia de portadores es mayor en los terneros (46%) que en adultos (29%). Veintinueve C. jejuni aislados de un rebaño y el 31 de las cepas humanas de la zona de estudio se amplificó con genotipo-de fragmentos polimórficos (AFLP). Ochenta y tres% de las especies bovina aislados se redujo en tres grupos con 95-100% de similitud, la persistencia en el hato durante 5-10 meses. Entre las cepas humanas, el 58% mostró> 90% de similitud con la especie bovina aislados. Los resultados muestran que el ganado bovino es un importante y estable reservorio de C. jejuni en el área de estudio. La transmisión entre las personas dentro del hato, puede ser suficiente para mantener una constante C. jejuni población independiente de afluencia del medio ambiente. Los resultados de este estudio han proporcionado nueva información sobre C. jejuni y C. coli transmisión, y también sobre el transporte de ganado, la estabilidad de los genotipos y similitud entre las especies bovina y las cepas humanas.

Introducción

Durante los últimos 30 años, campilobacteriosis se ha convertido en un alimento importante cargo de zoonosis bacterianas que causan diarrea aguda en los seres humanos a bajas dosis de infección [1 - 4]. En muchos países desarrollados, la enfermedad es actualmente la más frecuentes las infecciones entéricas bacterianas en los seres humanos [1, 3, 4]. Desde el comienzo de la década de 1990, un aumento sustancial se ha observado en varios países [3]. En Noruega, la incidencia de campilobacteriosis se duplicó de 1994 a 1999, de acuerdo con el noruego Sistema de Vigilancia de Enfermedades Transmisibles [5]. Control de casos de estudios de casos esporádicos, entre ellos un reciente de Noruega, han identificado una serie de factores de riesgo [1, 3, 6]. Los más frecuentes son los factores de consumo de carne de aves de corral, póngase en contacto con los animales, incluidos los animales de granja como vacas, ovejas y aves de corral, beber de un agua desinfectada, barbequing, y beber-leche pasteurizada [1, 3, 4]. Las fuentes más frecuentemente incriminados en los brotes de campilobacteriosis son agua potable, sin leche pasteurizada y aves de corral [1, 3, 4, 7].

Thermotolerant Campylobacter spp. están muy extendidas en la naturaleza donde los principales embalses son las extensiones de alimentarios silvestres y domesticadas de mamíferos y aves [1, 2, 7]. Healthy el ganado bovino es un reconocido reservorio de Campylobacter. Informó de la gama de frecuencias de 0,8 a 100% en materia fecal de los animales adultos [8, 9]. Aunque el consumo de carne bovina rara vez ha sido identificado como un factor de riesgo, la importancia del ganado como un reservorio de la infección humana se destaca por las siguientes observaciones: 1) la leche cruda como fuente de numerosos brotes, y 2) la identificación del ganado y los contactos el consumo de leche cruda como factores de riesgo en estudios epidemiológicos. Sin embargo, la contribución relativa de estos factores que más contribuyen a la carga de enfermedad no se conoce [2, 3, 10].

Gestión de ganado en Noruega es característicamente diferentes partes del centro de Europa, Canadá y los Estados Unidos. La mayoría de ganado noruego pertenecen a una población, el ganado rojo noruego (NFR). Las granjas son generalmente pequeñas, la vivienda en promedio alrededor de 30 animales, y el aumento de ambos productos lácteos y carne de ganado, que son alimentados con el mismo tipo de alimento. Tanto sacrificio y el parto son distribuidas de manera uniforme a lo largo del año, y no hay ninguna tradición especial para el engorde de terneros. Los animales pasan unos ocho meses en interiores, y cuando están fuera, el intercambio de campos de pastoreo con rebaños de otras granjas y cambiando frecuentemente de los campos son comunes.

Una serie de métodos se han desarrollado para investigar la diversidad genética entre los campilácteros campilácteros con el fin de rastrear las fuentes de infección [11, 12]. Los métodos difieren en su rango taxonómico, de poder discriminatorio, reproducibilidad y facilidad de interpretación y la normalización. Amplified-de fragmentos polimórficos (AFLP) genotipo es un método relativamente rápido basado en la PCR y la electroforesis capilar, que combina la aplicabilidad universal con un alto poder discriminatorio [13].

En la presente investigación, se evaluó la incidencia de C. jejuni y C. coli en ganado de la cooperación Sur-oeste de Noruega, una zona con una de las más altas tasas de incidencia de campilobacteriosis humana en el país [5]. Los objetivos del estudio fueron: 1) investigar la frecuencia de C. jejuni y C. coli en ganado de la zona de estudio, 2) estudiar la diversidad genética entre C. jejuni aislados de uno de los rebaños utilizando AFLP, y 3) comparar los perfiles AFLP de los aislamientos de bovinos y humanos de los pacientes del área de estudio.

Materiales y métodos
Estudio de la población y el plan de muestreo

Se examinó un total de 804 muestras de contenido intestinal de los bovinos que representan a 333 hatos de 16 municipios en el Condado de Rogaland (n = 764) y 8 municipios de Vest-Agder County (n = 40), Sur-oeste de Noruega. Aproximadamente una sexta parte de todos los bovinos producidos en Noruega son originarios de esta zona. Los animales fueron muestreados en dos mataderos, masacre que aproximadamente una tercera parte de todas las reses en los condados de estudio. Los muestreos fueron realizados por el personal en el control oficial de carne. Sin embargo, hay algunas desviaciones en el calendario de toma de muestras, porque los veterinarios responsables de la toma de muestras podría estar ausente debido a otras funciones. Un estudio piloto de 88 animales procedentes de 74 rebaños se llevó a cabo durante las 6 semanas período comprendido entre el 13 de abril y el 27 de mayo de 1999 en el mayor de los dos mataderos. Uno o dos días cada semana, las muestras de diez animales han sido recogidos a lo largo del día. Dado que los resultados del estudio piloto demostró que la frecuencia es suficiente para justificar una investigación más a fondo, se realizó una amplia encuesta, tanto en los mataderos durante los 13 meses-período comprendido entre enero de 2000 a enero de 2001. Cada matadero se ha visitado una vez por semana, y en cada visita, se tomaron muestras de manera uniforme a lo largo del día de cinco a siete animales. Un total de 716 animales que representan a 277 rebaños fueron investigados.

La recogida de muestras

De cada animal, aproximadamente 5 gramos de contenido intestinal se recogieron de forma aséptica el colon descendente, inmediatamente después de masacre. Las muestras se colocaron en 7,5 ml Cary Blair medio de transporte (CM0519, Oxoid Ltd, Basingstoke, Reino Unido), mixto, y transportado en una bolsa térmica para el laboratorio, donde las muestras fueron almacenadas en el refrigerador hasta que el cultivo de un plazo de 24 horas después de su recolección.

El cultivo de muestras

Un gramo de cada muestra fue trasladado a un tubo que contiene 9,0 ml Preston de enriquecimiento selectivo caldo consistente en caldo nutriente (Oxoid CM0067), complementado con un 5% zadas caballo de sangre (Oxoid SR0084) y polimixina B, rifampicina, trimetoprim y cycloheximide (Oxoide SR0117). Tubos se incubaron durante 24 horas a 42,0 ± 0,5 ° C en el micro-ambiente aeróbico (CampyGen, CN0025; Oxoid Ltd). Diez μ l de cada una de enriquecimiento de la cultura fueron modificados chapada en carbón cefoperazone desoxycholate agar (m-CCDA) con anfotericina B (CM0739 y SR0155; Oxoid Ltd) y se incubaron 48 h en 42,0 ± 0,5 ° C en el micro-ambiente aeróbico. De cada placa, una colonia con morfología característica fue examinado por contraste de fase microscopio. Más de confirmación se realizó con el 2810 AccuProbe Campylobacter cultura kit de prueba de identificación mediante el AccuLDR luminómetro (Gene-Probe Inc, San Diego, EE.UU.), una rápida prueba de sondas de ADN, que utiliza la técnica de hibridación de ácidos nucleicos para la identificación de thermotolerant Campylobacter spp. Los aislamientos identificados como thermotolerant Campylobacter spp. También se realizarán las pruebas de la hidrólisis del hipurato y indoxyl acetato de acuerdo a procedimientos estándar, que sirvió de base para la diferenciación de las especies [7].

Humanos aislados clínicos

Un total de 31 cepas de Campylobacter jejuni aisladas de pacientes humanos fueron incluidos en el estudio. Los aislamientos, incluidos en la muestra por el Departamento de Microbiología Médica, Hospital Universitario de Stavanger durante un control de casos de estudio (Kapperud et al. 2003), incluidos todos los adquiridos a nivel nacional campilobacteriosis casos en el Condado de Rogaland todo a partir de enero de junio de 2000. Los aislamientos fueron obtenidos a partir de la cepa recogida en el Instituto Noruego de Salud Pública.

Genotipo AFLP

Se extrajo el ADN de un robot biológico (EZ-1; Instruments AG Qiagen, Hilden, Alemania), de acuerdo a las instrucciones del fabricante. La AFLP se realizó un análisis detallado de como Lindstedt et al. (2000), utilizando los enzimas de restricción BglII BglII y MfeI MfeI (New England Biolabs, Beverly, MA, EE.UU.). Cálculo de similitudes entre los patrones de AFLP, análisis de cluster, y la generación de dendrogramas se realizó en el programa de ordenador GelCompar II (Matemáticas Aplicadas, Kortrijk, Bélgica), según lo establecido por Lindstedt et al. (2000). Sobre la base de conocimientos brote de las cepas y la reproducibilidad del método designado todas las cepas dentro de una ventana de similitud de entre el 95 y el 100% de homología de ser idénticos.

El análisis de los datos

Los datos fueron analizados mediante el paquete Intercooled Stata para Windows 9.0 (StataCorp LP, Collage Station, Texas, EE.UU.). Debido a la falta de un muestreo aleatorio, se muestran reacios a realizar cualquier análisis estadísticos avanzados. Las frecuencias con intervalos de confianza se calcularon utilizando la proporción de mando en Stata, los grupos de edad y se compararon mediante la prueba de ji al cuadrado.

Resultados
Ocurrencia

C. jejuni y C. coli fueron aisladas de 208 (26%, IC 95%: 23-29%) y 22 (3%, IC 95%: 2-4%) de 804 bovinos examinados, respectivamente. Además 13 (2%, IC 95%: 1-3%) de los aislamientos fueron otros thermotolerant Campylobacter spp. no hydrolyzing hipurato y indoxyl acetato, y estos no se habían clasificado a nivel de especie. En total, thermotolerant campilácteros campilácteros fueron aisladas de 30% (95% CI: 27-34%) de los bovinos.

La frecuencia de thermotolerant campilácteros campilácteros entre bovinos adultos (n = 715) y entre los terneros de edades comprendidas entre los 1,5 y 9 meses (n = 74) fueron 28,5% y 46,0%, respectivamente. Análisis de Chi cuadrado para el mes de adaptación de demostrar que no se encontraron diferencias significativas en la frecuencia entre los dos grupos de edad (p = 0,0002). La frecuencia de las tasas de porteador en distintos meses osciló entre el 0% en enero de 2000 y el 47% en julio de 2000 (mediana, 30%).

Genotipo AFLP

De las 333 ganaderías incluidas en el estudio, cinco fueron representados por más de 20 animales y sólo uno (HH rebaño; n = 119) con más de 40 animales. El ganado en rebaño HH se considera representativo de la zona basado en las rutinas de gestión, que incluía uniforme de cría y alimentación, campos de pastoreo común y frecuente entre los rebaños comerciales. Genotipo AFLP se utilizó para diferenciar 60 C. jejuni aislados, que comprende 29 de 32 C. jejuni aislados de los rebaños HH (tres se perdieron durante la congelación de almacenamiento) y 31 aislados clínicos obtenidos de pacientes humanos en el área de estudio durante el año 2000. Un total de 19 diferentes perfiles de AFLP se detectaron entre las especies bovina aislados, mientras que los humanos aislados mostró 30 perfiles. Todos los aislamientos agrupados dentro de una ventana de similitud del 80% (Figura 1]. La mayoría de las especies bovina aislamientos (83%, n = 24) cayó en tres grupos, cada uno con ocho aislamientos con 95-100% de similitud (grupos A, B y C en la Figura 1]. La distancia genética entre estos tres grupos fueron de aproximadamente el 85%. Todas las cepas aisladas en el grupo A de los animales fueron sacrificados en el período comprendido entre julio de 7 a 9 de noviembre, mientras que el grupo B fueron aislados a partir de marzo de 17 a 1 de diciembre, y el grupo C integrado por los aislamientos a partir de mayo 16 a diciembre 27. Por lo tanto, las fechas de la masacre de animales de las cepas que se aislaron se superponen considerablemente, y no hay una clara diferencia en la distribución estacional de los grupos. Los cinco restantes fueron aislados bovina dispersos en el dendrograma. Entre las cepas humanas, 18 (58%) mostraron que más del 90% de similitud con uno o más bovinos aislar. En el 95% de similitud, tres de las cepas humanas cayó en la categoría B, y dos cepas humanas agrupadas junto con los ocho bovinos aislados en el grupo C.

Discusión

En el presente estudio, hemos aislado C. jejuni y C. coli de aproximadamente un tercio del ganado sano de la cooperación Sur-oeste de Noruega. Este porcentaje es superior al de Dinamarca informó [14] y Suecia [15], pero inferior a lo que se encuentra en el Reino Unido e Irlanda [9].

La mayor frecuencia de portadores se encuentran en los terneros que en ganado adulto, son justificadas por los resultados de otros estudios [1, 9, 14, 16, 17]. Similar distribución por edades se observa también entre los demás animales y seres humanos [3, 4, 18, 19]. Si esto es debido a la inmunidad adquirida entre los adultos o de exposición más frecuente en individuos jóvenes no se conoce [9, 18].

No hemos encontrado ninguna diferencia significativa de temporada. Esto no hubiera sido inesperada, ya que puede alcanzar un pico de verano se observa entre los pollos de engorde, así como en los seres humanos en Noruega [5, 20]. Esto indica que los rebaños bovinos son capaces de mantener una población estable Campylobacter de transmisión dentro de la manada. AFLP genotipificación de cepas de uno de los rebaños indica que tres C. jejuni clones, cada uno con 95-100% similitud interna, estuvieron presentes a través de 5-10 meses del período de estudio. La transmisión entre las personas dentro de la manada es probablemente suficiente para mantener una población constante de C. jejuni sin influjo del medio ambiente. La duración de la colonización en los distintos animales no se haya determinado en nuestro estudio, pero investigaciones previas han demostrado que el ganado puede arrojar grandes cantidades de campilácteros campilácteros para un máximo de 112 días [8].

Nuestra conclusión de que algunos de los aislados clínicos humanos de la zona de estudio mostró una estrecha similitud genética con las cepas de bovino deben interpretarse con cautela. La transmisión directa de ganado a los seres humanos no puede excluirse por completo, aunque es más probable que ambas especies estaban infectadas de una fuente común, sobre todo a través del agua. El agua puede constituir el depósito común de vincular las infecciones en los seres humanos y los animales [3]. Los recientes resultados que indiquen una relación simbiótica entre Campylobacter y acuáticos amebas pueden apoyar esta hipótesis [21]. - Beber agua desinfectada fue la principal factor de riesgo para la campilobacteriosis noruego en un estudio caso-control [6], la exposición ocupacional al ganado y otros animales de granja también fue identificado como un riesgo independiente, pero el consumo de carne de vacuno no lo era. El consumo de-leche pasteurizada es poco común en Noruega, aunque algunos brotes relacionados con la leche cruda se ha comunicado [22, 23].

El estudio contribuyó con menos información de lo esperado debido a las desviaciones en el calendario de muestreo. Los métodos de cultivo utilizados en este estudio para seleccionar termo tolerantes Campylobacter especies [24]. Esto puede ser la razón por la cual principalmente C. jejuni fue aislado. Enriquecimiento selectivo se utilizó para todas las muestras y puede contribuir a datos asimétricos. También debe tenerse en cuenta que sólo un número finito de colonias aisladas y se han escrito, una limitación que permite la más predominante clones a estar aislados. El ganado cepas incluidas en la AFLP a escribir su origen en un solo rebaño, con inclusión de todos los Campylobacter aislados de este rebaño. Debido a esta limitación, es difícil implicar a las asociaciones entre humanos y bovinos aislados en general.

Conclusión

Los resultados muestran que el ganado bovino es un importante y estable reservorio de C. jejuni en el área de estudio. En uno de los rebaños, tres clones genéticos estuvieron presentes durante varios meses. La similitud genética entre humanos y bovinos aislados puede reflejar la infección de una fuente común. Las mayores tasas de transporte se encuentran entre los terneros frente a los adultos.

Sammendrag

Forekomst av og Campylobacter jejuni Campylobacter coli tarm fra i storfe fra sørvest Norge og sammenligning av genotypisk bovina og humano isolat cc metoden AFLP

Forekomst av termotolerante Campylobacter spp. hos storfe das undersøkt i en kartlegging utført i 1999-2001, den og genetiske diversiteten hos C. jejuni innen en besetning das undersøkt og med sammenlignet humano isolat. C. jejuni, C. coli og andre termotolerante Campylobacter spp. bles isolert fra tarminnhold hos henholdsvis 26%, 3% og 2% av 804 storfe. Frekvensen var større hos kalver (46%) ENN hos voksne dyr (29%). Tjueni C. jejuni isolat-fra es besetning og 31 fra humano isolat SAMME område das karakterisert cc den genetiske fingeravtrykksmetoden AFLP. Av storfeisolatene havnet 83% i tre distinkte grupper med 95-100% likhet, vedvarende i besetningen i 5-10 måneder. Av humano de isolatene var mer 58% ENN 90% Lik storfeisolatene. Resultatene viser a storfe er et betydelig og stabilt reservoar para C. jejuni i området. Overføring mellom individer innen en besetning ser ut til å være tilstrekkelig til å opprettholde estabilidad en C. jejuni-populasjon uavhengig av tilførsel fra omgivelsene. Resultatene har gitt informasjon om smitteveier para C. OG C. jejuni coli med økt kunnskap om nivå hos storfe, stabiliteten til genotypene og likhet mellom humanisolat og storfeisolat.

Agradecimientos

Gracias a Eystein Skjerve en la Escuela Noruega de Ciencias Veterinarias de ayuda para asistencia con el análisis estadístico.