Acta Veterinaria Scandinavica, 2006; 48(1): 13-13 (más artículos en esta revista)

Fisiológicas de las rutas intra-uterino seminal contenido para el adelanto de la ovulación

BioMed Central
Dagmar Waberski (dagmar.waberski @ tiho-hannover.de) [1], Anke Döhring (anke.doehring @ tiho-hannover.de) [1], Florencia Ardón (forencia.ardon @ tiho-hannover.de) [1] , Nadine Ritter (nadine.ritter @ tiho-hannover.de) [4], Holm Zerbe (holm.zerbe @ tiho-hannover.de) [3], Hans-Joachim Schuberth (Hans-joachim.schuberth @ tiho-Hannover. de) [4], Marion Hewicker-Trautwein (marion.hewicker-Trautwein @ tiho-hannover.de) [5], Karl Fritz Weitze (karl.fritz.weitze @ tiho-hannover.de) [2], Ronald HF Hunter (dagmar.waberski @ tiho-hannover.de) [1]
[1] Unidad de Medicina Reproductiva de Clínica / Clínica de la peste porcina y los Pequeños Rumiantes, Universidad de Medicina Veterinaria de Hannover, Alemania
[2] Instituto de Biología Reproductiva de la Universidad de Medicina Veterinaria de Hannover, Alemania
[3] Clínica de Rumiantes, Universidad de Munich, Alemania
[4] Instituto de Inmunología de la Universidad de Medicina Veterinaria de Hannover, Alemania
[5] Instituto de Patología de la Universidad de Medicina Veterinaria de Hannover, Alemania

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Resumen

Todo el jabalí o el semen plasma seminal se ha demostrado para hacer avanzar el momento de la ovulación en cerdas jóvenes. Como una forma de aclarar esta influencia, la contribución de linfáticos uterinos y sus poblaciones de células blancas han sido examinados. Después de la visualización del conducto con Evan's azul, linfáticos se tomaron muestras de un buque mesometrial en ocho pre-ovulatoria cerdas jóvenes cuyo lumen uterino fue infundido al mismo tiempo con todo el semen en un cuerno y ligated salina en el contralateral ligated bocina. La linfa se recogió cannulated de buques por períodos de hasta cuatro horas bajo anestesia general. Posteriormente, mesometrial los ganglios linfáticos, útero, trompas uterinas y la salida de pared tejidos fueron incluidos en la muestra. La proporción de células nucleadas en la muestra linfáticos aumento hacia el final del período de recogida, pero los eritrocitos, se encontraron en todos los casos la prevención de una diferenciación e identificación de los leucocitos. Prominentes uterino ganglios linfáticos estaban presentes en la mesometrium a ambos lados del tracto reproductivo en 7 de 10 cerdas jóvenes. Las diferencias en el contenido celular se demostró entre el lado del tracto infundido con esperma y que infundido con solución salina de control. Dos de 4 cerdas jóvenes tenían valores más bajos de CD4 (Cluster diferenciación) y 3 de 6 cerdas jóvenes valores más altos de MHC II (Complejo Mayor de Histocompatibilidad) marcadores en la parte impugnada con semen. En contraste, los valores se mantuvo constante para CD8, pero varió ampliamente para CD18. El análisis inmunohistoquímico de muestras de tejido uterino de MHC II + células reveló diferencias significativas (P <0,05) entre el control y tratamiento del semen-ligated porciones de las trompas, así como entre la muestra de tejido de la pared uterina y que, desde el útero-la salida de trompas , Pero no hubo diferencias significativas en cuanto a las células CD4 +. Por consiguiente, sigue siendo posible que el esperma inducida por citocinas en el útero linfáticos someterse contra el actual traslado al ovario ipsilateral y acelerar la maduración final de pre-ovulatoria folículos Graafian.

Fondo

El proceso de la ovulación ha seguido para atraer la atención desde el reconocimiento de que es activado por un aumento de las hormonas gonadotrophic detectables en la circulación sistémica [1 - 4]. Este aumento se sabe que es impulsado ya sea por la retroalimentación positiva influencia de estradiol a partir de la maduración folículo (s) en las llamadas espontáneas ovulators estimulación coital o en reflejo ovulators [4]. Niveles elevados de gonadotropinas hipofisarios en la circulación sistémica se unen a los tejidos de ovario durante el pre-ovulatoria intervalo [5], pero todo el espectro de cambios como consecuencia de tales sigue siendo vinculante para ser designados. Clásica características incluyen un aumento en bloodflow, un progresivo cambio en la hormona esteroide de síntesis de estradiol a la progesterona que representa el inicio de luteinisation, una reorganización morfológica de las capas de células de la granulosa y la disolución de la membrana basal que permita vascularización de la granulosa, y la reanudación de la meiosis en el ovocito (s) destinado a ser derramada en la trompa de Falopio (s) (revisado por Hunter [6]].

En los últimos años, y debido en gran parte a una serie de ensayos de estimular Espey [7 - 9], el proceso de la ovulación se ha asemeja a una reacción inflamatoria. Una característica importante de tal inflamación es la infiltración de diferentes poblaciones de glóbulos blancos en ya través de los tejidos maduros de folículos Graafian. Citocinas liberadas de los leucocitos son atraídos al pensamiento crítico que participan en los cambios estructurales de la pared folicular [10, 11]. No se sabe en qué medida la migración de los leucocitos pueden actuar como vectores entre los diferentes componentes del sistema reproductivo. En particular, se plantea la cuestión de si el tráfico de leucocitos podría ofrecer un posible vínculo entre la influencia de todo el semen o plasma seminal componentes en el útero y una aceleración de los acontecimientos que condujeron a la ovulación.

El cerdo doméstico es tradicionalmente considerado como una forma espontánea-ovulando especies con un intervalo bastante precisa entre el aumento de gonadotropina y la ovulación [1, 2, 12]. Waberski et al. seguimiento de la ovulación en cerdas jóvenes por no invasiva ecografía y señaló que plasma seminal o fracciones de los mismos podría avanzar en el plazo previsto de la ovulación por un número significativo de horas [13 - 15]. La ovulación se vigila de no invasiva, escaneo ultrasónico. Por otra parte, en un quirúrgicamente preparados modelo en el que el semen tenía acceso a sólo uno de los cuernos uterinos, que se acelere la ovulación puede ser demostrado por el lado infundido no detectables con influencia en el ovario contralateral [13, 14]. No hay una explicación satisfactoria para estos emocionantes resultados hasta el momento se ha propuesto, ni el hecho de que avanzada la ovulación ocurrió en sólo una parte de los animales tratados recibido suficiente consideración. Si todo el semen o plasma seminal fueron para inducir un grado variable de inflamación en las diferentes regiones a lo largo de la mucosa uterina, entonces parece posible que aguas abajo los acontecimientos, por ejemplo, la ovulación, podría ser influenciado a una variable medida.

En este informe preliminar, hemos procedido a partir de la hipótesis de que leukocytic respuestas a la presencia de todo el semen o plasma seminal componentes en el útero puede influir en madurar folículos Graafian de la secreción de citoquinas. Hay buena evidencia experimental para la participación de diversas moléculas de citoquinas en los acontecimientos de la ovulación en mamíferos [10, 11]. Una pregunta crítica es la forma de transmisión de leucocitos de citoquinas derivadas del tracto genital a las gónadas. El objetivo era estudiar la posibilidad de que participen de las vías linfáticas, apreciando que una contra-transferencia corriente de programación de la información »linfáticos uterinos de ovario en la tensión arterial con el tiempo deben participar.

Métodos
Animales

Diez híbrido cerdas jóvenes, con edades entre 8-9 meses y un peso entre 100-110 kg, se utilizan en estos experimentos. Ellos fueron alojados en cubiertas de paja en graneros, alimentados con una dieta estándar comercial "pellets" de concentrado dos veces al día, y dado libre acceso al agua potable. Ciclos de celo fueron controlados en la presencia de un verraco maduro y los animales preparados para la cirugía durante un período espontánea del ciclo estral.

La premedicación y la inducción de la anestesia

Una inyección intramuscular de azaperona (2 mg / kg; Stresnil ®, Janssen-Cilag GmbH, Neuss, Alemania) fue dada por medio de la premedicación. Aproximadamente 30 minutos más tarde, la anestesia fue inducida por la inyección intramuscular de ketamina (10-15 mg / kg; Ursotamin ®, WDT, Garbsen, Alemania). Posteriormente, una inhabitación catéter se coloca en un lugar destacado sentido del oído y profundizado la anestesia por inyección intravenosa de thiobarbiturate (Thiamylal sodio, 2.5-10 mg / kg; Surital ®, Pharmacia y Upjohn GmbH, Erlangen, Alemania). La cesación del reflejo de deglución se indica la profundidad deseada de la anestesia. Después de la intubación endotraqueal, se mantuvo la anestesia utilizando una mezcla de oxígeno, óxido nitroso y isofluran (Isoflo ®, Essex, Munich, Alemania). El animal ha sido colocado en una posición reclinada dorsal en la mesa de operaciones.

Abordaje quirúrgico

La piel abdominal se lava y se esteriliza y luego se cubre totalmente. A raíz de los procedimientos asépticos, el tracto reproductivo fue expuesto a través de un medio de incisión y ventral, con un mínimo de manipulación de los tejidos, el número de individuos maduros pre-ovulatoria folículos Graafian se registró para cada ovario. el lumen uterino. Por medio de una jeringa hipodérmica desechable y aguja, 20 ml de caliente, recién recolectados jabalí semen se introdujeron en la ligated parte de una bocina y 20 ml de solución salina estéril caliente (fosfato de búfer) en el cuerno contralateral. Este volumen de líquido no causa la distensión de los tejidos uterinos.

Con el fin de visualizar los vasos linfáticos que drenan el útero de una solución de 0,5% azul de Evans en el 0,9% de solución salina se introdujo bajo la capa de serosal de las regiones apropiadas de cada cuerno uterino mediante un 1 ml jeringa desechable y 26 de ancho aguja intradérmica. El tinte es visible en mesometrial linfáticos dentro de unos minutos (Figs 1A, B], permitiendo la preparación de un buque para la canulación y acumulación de líquido. Irridectomy tijeras se utilizaron para diseccionar la mesometrium superpuestos. Bellas ligaduras de seda (4-0, Mersilk; Ethicon Ltd, Edimburgo, Escocia) se coloca alrededor del buque expuestos estrecha relación con el sitio de canulación. La ligadura de abajo era entonces más estrictas que conduzcan a la distensión de los vasos linfáticos, y una cánula cónica de polietileno (int. diámetro de 0,2 mm, diámetro exterior 0,4 mm, longitud de 8 cm; Bellas Ciencia Herramientas, Foster City, EE.UU.) presentó río arriba a través de una pequeña incisión realizados en la pared de los vasos linfáticos con la punta de la irridectomy tijeras. La punta se encuentra entre las válvulas y la segunda ligadura apretados.

Algunos 45-60 minutos después de la introducción de semen o de solución salina en los respectivos cuernos uterinos, linfáticos que fluye a lo largo de la cánula se recogió en un frasco de polietileno con EDTA. Colección seguido por un período de 45 minutos y el vial se cambió cada 15 minutos. Reproductiva tejidos se mantienen en un estado húmedo durante la recogida por medio de la irrigación con solución salina caliente. Después de la toma de muestras y retirada de la cánula, los ganglios linfáticos uterinos en la mesometrium fueron retirados por una cuidadosa disección romo, y las muestras de tejido fueron también tomados del útero, trompas y la salida de la pared ligated porción del útero. Los tejidos limítrofes de estos sitios de muestreo fueron apposed con suturas de 4-0 Mersilk.

La mitad de la incisión ventral se cerró en tres capas diferentes, y los animales dado una inyección sistémica de antibióticos (amoxicilina de sodio, 10 mg / kg; Gramox ®, Vetoquinol, Oberursel, Alemania). Ellos fueron devueltos a los corrales de recuperación con camas de paja. No hubo detectable post-operatorio complicaciones.

Celular análisis

El número de células en muestras de linfa se había contado utilizando un haemocytometer diapositiva. Las células fueron clasificados como nucleadas (leucocitos) y los eritrocitos. En cuanto a los ganglios linfáticos, estos fueron cortados en trozos pequeños y las células fueron lavadas con PBS. Los ganglios linfáticos las células fueron analizadas por citometría de flujo (FACScan ®, Becton Dickinson), después de la tinción con anticuerpos monoclonales específicos para CD4, CD8, y MHC II (complejo mayor de histocompatibilidad clase II +) marcadores. Los anticuerpos fueron elegidos para controlar los cambios entre las células T subconjuntos (CD4, CD8) y de activación para evaluar los cambios inducidos (MHC II), de la expresión de antígenos de superficie.

Clásica inmunohistoquímica métodos se utilizaron en este estudio tras el protocolo de Boenisch [16], con ligeras modificaciones, tal como figura en Döhring [17]. Se tomaron muestras de tejido, ya sea instantánea congelada en nitrógeno líquido o fijo en formol y embebidos en parafina cera. Después de la sección apropiada, MHC clase II y la expresión del antígeno CD4 se visualizan después de incubación secuencial primaria con anticuerpos monoclonales (AcM H42, anti-MHCII, MAB 74-12-4, anti-CD4, tanto 1:150 en tampón fosfato salino (PBS) con 1% de albúmina de suero bovino (BSA), 22 h, 4 ° C) y una secundaria con biotina de anticuerpos específicos para mouse IgG (GAM-6, 1:200 en PBS, el 10% de suero de cerdo, 30 min). Encuadernación se detectó mediante la avidina-peroxidasa con biotina como sustrato.

Resultados

Diez animales sometidos a los procedimientos anteriores y linfáticos de muestras fueron recolectadas en ocho de ellos.

Como se preveía, el flujo de linfa es lento (aproximadamente 2,5 ml / hora, sino que varía de 0.9-5.0 ml / hora) y las muestras fueron invariablemente de color rosa pálido de color debido a sangre contaminada. El sitio específico de la contaminación es incierto pero se cree que la pequeña punción heridas realizados en la superficie uterina durante la introducción de Evans colorante azul.

La proporción de células nucleadas en la muestra aumentó linfáticos como el período de recogida alargado (Fig. 2], pero los eritrocitos, se encontraron en todos los casos la prevención de una diferenciación e identificación de los leucocitos. En consecuencia, no se consideró conveniente realizar una clasificación de los leucocitos.

El análisis inmunohistoquímico de muestras de tejido uterino por MHC clase II de células positivas reveló diferencias significativas entre el control y tratada con el semen (valores más altos), cuernos (Tabla 1], así como entre la muestra de tejido de la pared uterina y que, desde el útero-tubárica cruce (valores más altos). No se observaron diferencias significativas pueden ser observados de CD4 de células positivas (datos no presentados).

Prominentes uterino ganglios linfáticos estaban presentes en la mesometrium a ambos lados de las vías en 7 de 10 cerdas jóvenes. Par de sabios comparaciones puesto de manifiesto porcentajes significativamente más bajos de CD4 de células positivas en los ganglios linfáticos que drenan el lado inseminadas (Cuadro 2]. Por el contrario, pero no significativa, la fracción de MHC clase II-positivos los ganglios linfáticos las células fue mayor en estos ganglios linfáticos secundarios en comparación con el drenaje de la salina infundido cuerno uterino. En contraste, los valores de CD8, células positivas se mantuvo constante (datos no presentados).

Discusión

En términos de aclarar el fenómeno de la ovulación precoz en los cerdos como una respuesta a la infusión de toda la esperma en el útero, este estudio preliminar no ha aportado datos concretos en cuanto a los mecanismos fisiológicos subyacentes. Sin embargo, ha ofrecido una línea de orientación que pueden desarrollarse en el futuro los estudios técnicos cuando el problema de la obtención de muestras linfáticos de la sangre libre de contaminación aguda en los experimentos se ha resuelto. Las observaciones se refieren a las poblaciones de leucocitos y corto plazo respuestas a los tratamientos como un seguimiento en los tejidos uterino y mesometrial los ganglios linfáticos.

Teniendo en cuenta primero las observaciones en los ganglios linfáticos, los valores de CD4 - inferior en 2 de 4 cerdas jóvenes en el lateral del tracto expuestos al esperma - no permiten conclusiones definitivas, ni tampoco la ausencia de diferencias significativas en cuanto a las células CD4 + entre las dos partes en el marco de tiempo examinado. Por el contrario, el análisis inmunoquímico de MHC II + células que indican diferencias significativas en muestras de tejido uterino entre el esperma tratado con cuernos y control y también entre las regiones del útero, es decir. de endometrio (una parte) de cuerno uterino y el útero, las trompas cruce. Estas diferencias podrían demostrar un papel de los antígenos de células presentadoras en la respuesta inmune siguiente reto con antígenos de sexo masculino. Por otra parte, las diferencias en el grado de respuesta entre el tejido uterino y el de útero-el cruce de trompas podría sugerir un papel más sensibles de la región junctional. Características importantes en este último sentido sería (1) la rápida acumulación de componentes seminal en el útero-la salida de trompas, debido a la influencia poderosa de las contracciones miometriales [18 - 20] y (2) la muy destacada linfático subyacente "de los buques durante el ciclo estral [21]. La distensión de estos linfáticos y, por ende, de los tejidos superpuestos pueden funcionar principalmente para inhibir el libre paso de plasma seminal en la trompa de Falopio. Al mismo tiempo, sin embargo, la distensión durante linfático celo proporcionaría una vía potencial para la rápida molecular conversaciones entre seminal contenido que bañan el útero-la salida de trompas y la leukocytic respuesta de la cerda joven beneficiario, una vez más el apoyo de las diferencias regionales en el MHC II + respuesta celular.

A pesar de que la labor de un medicamento inmunológico orientación, nuestra hipótesis original permanece intacta: es decir. que citocinas secretadas por las poblaciones de leucocitos en respuesta a la presencia de todo el semen o plasma seminal componentes en el útero podrían estar actuando para acelerar el proceso de la ovulación en un ovario ipsilateral. Las propuestas no son completamente especulativo, por una reciente publicación del endometrio implica la expresión de citocinas como parte de la respuesta inflamatoria a plasma seminal con una participación en el reclutamiento de leucocitos [22]. En cuanto a la actividad de citoquinas en los tejidos de los folículos Graafian, esto es ahora aceptada como una característica clásica y ha sido revisado por Brännström [10], Bukulmez y Arici [11] y Hunter [6].

Citocinas llegaría a los tejidos de ovario folicular ovárica a través de la arteria, después de haber entrado en el útero-ováricos de la arteria uterina linfáticos por medio de contra-cambio actual [véase [23 - 27]]. La eficiencia de tales putativo contra el actual transferencia y su proyecto de influir en la ovulación que varían en función de la proximidad de drenaje linfático uterino para el útero-ováricos vasos sanguíneos, especialmente la arteria ovárica. Esto se ilustra en la hermosa plástico arroja de Gawronska et al., [26]. El grado de intimidad entre los respectivos linfáticos y vasos sanguíneos que influyen en la eficacia de las actuales transferencia. La etapa de celo, que es el momento antes de la ovulación y, por tanto, prevalece la proporción de estradiol a la progesterona, que también influyen en la contra-actual mecanismo de transferencia y el grado de edema en el útero-la salida de trompas.

En cuanto a posibles lugares de leukocytic la secreción de citocinas inducidas en respuesta a todo el semen o plasma seminal, estos se incluyen (1) la enorme población de células presentes en el lumen uterino se infiltraron en respuesta a seminal en contacto con el endometrio [28], (2) leucocitos situado en la mucosa uterina tejidos, y (3) de leucocitos en los vasos linfáticos que drenan el útero - o una combinación de los tres sitios. Es evidente que el escenario sería dinámico con un rápido movimiento y el volumen de negocios de diferentes poblaciones de células como parte de una respuesta inflamatoria. La variación en la actividad de las tres rutas anteriores podría ser responsable de diferentes citocinas actividad de llegar al ovario ipsilateral y una variable de influencia en la respuesta ovulatoria. De hecho, la secreción de citocinas en los tejidos genitales podrían influir en las poblaciones que migran de leucocitos en la pared de los folículos Graafian pronto para ovular y, por ende, sus propios locales de la secreción de citoquinas. En general, habría interacciones con finamente sintonizado programa folicular de las modificaciones de la ovulación.

En un pequeño estudio quirúrgico de los cerdos se aparearon (cerdas jóvenes), la presencia de semen en el útero llevado a un aumento en la concentración de PGF 2 α en sangre venosa uterina dentro de los 15 minutos de apareamiento (véase [29]; Fig. 3.2]. No cabe duda de que el contador-actual sistema de transferencia entre el útero-ováricos vena ovárica y la arteria permitiría mejorar los niveles de PGF 2 α para llegar a un ovario ipsilateral [30 - 32]. Debido a que la concentración de prostaglandinas en el líquido antral de folículos maduros Graafian aumenta dramáticamente en las horas antes de la ovulación en forma espontánea en bicicleta cerdos [33], la secreción de prostaglandinas de tejido uterino siguiente apareamiento también podría contribuir al proceso de la ovulación por synergising folicular con prostaglandinas.

Por último, teniendo en cuenta (a) la variación entre los animales, (b) la distribución desigual de los componentes seminal entre y dentro de los dos cuernos uterinos, (c) el grado de distensión de los cuernos uterinos y (d) la fase precisa de tratamiento en relación a la oleada de gonadotrofina endógena, entonces la variación en respuesta a una variable biológica, específicamente la ovulación, se prevé. En cuanto a la última de estas propuestas (d), cuanto menor sea el intervalo entre la aparición de celo y ovulación, menor será la probabilidad de demostrar una respuesta ovulatoria a seminal componentes. Este y los aspectos relacionados con el temporal se examinan en Waberski et al. [15].

Conclusión

Sigue siendo posible que el esperma inducida por citocinas en el útero linfáticos someterse contra el actual traslado al ovario ipsilateral y acelerar la maduración final de pre-ovulatoria folículos Graafian.

Conflicto de intereses

Los autores declaran que no tienen intereses en conflicto.

Agradecimientos

Este estudio se realizó durante la tenencia de un Mercator Profesorado otorgado por la Deutsche Forschungsgemeinschaft para que agradece el reconocimiento se haga (RHFH). También queremos dar las gracias al Dr Steve Ford para el asesoramiento sobre la técnica de canulación linfática, la explotación del personal en el Instituto para el cuidado de los animales de experimentación, y la señora Frances Anderson para la amabilidad de preparar la máquina.