Cryo-Electron tomográfica estructura de un virus de la inmunodeficiencia dotación complejo in situ

La dotación glicoproteína (ENV) complejos de virus de la inmunodeficiencia humana tipo 1 (VIH-1) y los relacionados con lentivirus virus de la inmunodeficiencia símico (SIV) mediar viral entrada en sus respectivas células de acogida. El complejo está montado inicialmente de tres copias del polipéptido precursor gp160, que son exfoliados a dar una última madura trimer de heterodimers de la gp120 y gp41 subunidades (revisado en [1]]. La glicoproteína de superficie gp120 tropismo celular confiere al virus de CD4 obligatorio y un co-receptor (CCR5 en primer lugar o CXCR4), y actúa como un disparador para la fusogenic actividad de la glicoproteína transmembrana gp41. Gp41 se asocia con gp120 a través de interacciones noncovalent, se basa en la envoltura viral de lípidos por un dominio transmembrana (revisado en [1]], y contiene un C-terminal de la cola que puede ser truncada por supuesto [2].

El actual modelo de entrada del virus de inmunodeficiencia postula que CD4-gp120 interacción induce y / o se estabiliza una conformación en gp120 que permite la exposición y / o creación de oclusión anteriormente co-receptor vinculante superficies (revisado en [1]]. Co-receptores de factores desencadenantes más vinculante reordenación de Env. Basándose, en parte, a conservarse las características estructurales de gripe entre la proteína hemaglutinina (HA) y el VIH-1 Env, se ha propuesto que los receptores de co-participación que conduzcan a la desestabilización trimer actúa como un conmutador para gp41 para asumir una amplia conformación helicoidal e insertar su N - terminal en el objetivo membrana celular (revisado en [3]]. Tras refolding de gp41 en un plazo de seis hélice paquete trae el virus y las membranas celulares en aposición, lo que la mezcla de lípidos y formación de poro.

Env es el blanco de anticuerpos neutralizantes en infectados o inmunizados anfitriones debido a su ubicación en la superficie virion. Varias estructuras cristalinas de núcleos monomérico gp120, que carecen de la hipervariables bucles y N-y C-terminales y complejos con ligandos específicos, han informado a nuestra comprensión de los mecanismos de reconocimiento del receptor viral y la evasión inmune (por ejemplo, [4, 5]]. Más recientemente, las estructuras de un unliganded SIV gp120 [6] y una soluble (s) ligated-CD4, el VIH-1 gp120 núcleo que contiene el bucle V3 [7] se han determinado.

Gran parte de Env función está dirigida por la proteína-proteína interacciones dentro de la membrana de la espiga anclado trimeric complejo. La estructura de este complejo se ha mantenido sin solución debido a su complejidad y la inestabilidad en su solución. Estudios estructurales de los virus intactos están limitadas por la morfología irregular [8] y el bajo número de espigas por superficie lentiviruses [9]. En consecuencia, muchas inferencias se han hecho con respecto a Env mediada por la fusión y la evasión de anticuerpos neutralizantes en ausencia de una estructura basada en el modelo molecular. Los acontecimientos recientes en crio-tomografía de electrones y el procesamiento de imágenes que sea posible estudiar las estructuras de membrana irregular virus en el estado nativo [10 - 12]. Hemos aplicado estos avances para el estudio de la membrana de la espiga anclado complejo. Hemos superado las dificultades relacionadas con el bajo número de espigas por: (1) el uso de SIV frente al VIH-1, SIV Env porque es más estable que su VIH-1 contraparte [13], y por lo tanto es más apropiado para análisis de viriones intactos, y (2) utilizando un intra-viral-cola truncada forma de SIV que contiene niveles más altos de Env hacer que los virus con una cola intacta. En estas condiciones, hemos recogido la crio-tomográfica de datos, y obtuvieron un promedio y las espigas para obtener una estructura de la AMB en su conformación nativa no encuadernado. Acondicionamiento de la estructura atómica de unliganded SIV Env en este complejo nos ha permitido proponer dos modelos funcionales para la espiga Env. SIV es un buen modelo de trabajo para el VIH-1, ya que los dos virus tienen un alto grado de similitud de secuencias y explotar CD4 y CCR5 como receptores celulares. Estos dos virus son también cree que compartir las estrategias de evasión de anticuerpos.

Se recogieron tres tomografía crio-serie contiene 77 viriones. Cada uno tenía cientos de espigas visibles en la superficie (Figura 1], en marcado contraste con reconstrucciones tomográficas NL43 de VIH-1 viriones [14]. Los núcleos se viral visible, pero no fueron analizadas ya que utiliza AT-2 (aldrithiol-2) inactivación que no podrá preservar la morfología del núcleo nativo (GCM Briggs, JB Forsdyke, H.-G. Kräusslich, SD y Fuller, datos no publicados) . El SIVmneE11S cepa empleada aquí, naturalmente, tiene una truncada gp41 intra-viral de dominio de 17 aminoácidos [2]. Este infecciosas del virus de la variante natural [15] contiene un mayor número de complejos Env SIV que contenga toda la gp41-cola, facilitando el análisis tomográfico.

El patrón de distribución de las espigas que parece ser al azar, con algunas zonas de ordenamiento local (vea la Figura S1]. Este pedido puede ser el resultado de una alta densidad de espigas que conduzcan a cerca de embalaje limitado por el diámetro del complejo Env.

Viral espigas fueron extraídos de la reconstrucción tomográfica, alineados el uno con el otro y, a continuación, utilizando un promedio de una adaptación del protocolo de procesamiento de imágenes utilizadas por Förster et al. [11]. La alineación de protocolo compensa el inherente carácter incompleto de tomografía de electrones datos (los "desaparecidos cuña"), que introduce la adaptación de otro sesgo en la reconstrucción [11] (véase Materiales y Métodos].

Un total de espigas de 2986 contribuyó a la final de los mapas (Figuras 2 y 3, y Video S1]. La resolución, sobre la base de un conservador 0,5 Fourier shell correlación umbral, es de 28 Å. La espiga exposiciones claras de 3 veces la simetría y los proyectos de aproximadamente 120 Å de la membrana viral. Se trata de un tallo de aproximadamente 35 Å de ancho y 50 Å de altura, límite máximo de tres densidades globulares que aparecen a veces en el tallo de una mano derecha hélice orientación. La distancia entre las puntas de los tres dominios globulares es de 110 Å. Esta morfología es sorprendentemente diferente del de virus de la leucemia murina (MuLV), el único otro viral espiga reconstruido utilizando este enfoque [11]. Esta diferencia en la morfología no es sorprendente ya que la superficie de proteínas de los dos complejos no están relacionadas en secuencia o estructura. MuLV SU es una más o menos en forma de L 70 KDa glicoproteína en el que siete N-glicosilación ligados sitios han sido identificados ([16, 17], mientras que SIV gp120 núcleo adopta una estructura ovoide con 23 posibles sitios de glicosilación [6]]. Hemos repetido la alineación utilizando los procedimientos MuLV espiga, y el enantiómero final de nuestra estructura como la puesta en marcha de modelos para descartar la posibilidad de sesgo de referencia. En ambos casos hemos recuperado la misma estructura final, lo que indica que nuestra elección a partir de modelo no sesgo la alineación. Las dimensiones de nuestra estructura son coherentes con la modelización molecular con los CD4 sujetos VIH-1 gp120 estructura cristalina [18] y con modelos basados en el núcleo SIV gp120 estructura cristalina [6]. Negativo tinción de viriones intactos [9] dio reducidas dimensiones, que refleja probablemente artefactos relacionados con la coloración y secado de la muestra. El volumen de la estructura, con exclusión de la membrana, es de aproximadamente 470 nm utilizando un ³ sigma 2 contorno.

El tallo gp41 aparece como una estructura compacta con no obvia la separación entre los tres monómeros. La membrana región proximal de gp41 se caracteriza por una muy conservadas hidrofóbicas región, lo que se piensa para mediar trimer auto-ensamblaje [19]. Nuestros datos apoyan firmemente este, ya que observamos un pacto tallo, en lugar de una separación en tres piernas como para MuLV [11]. Por otra parte, la densidad correspondiente a la región gp41 tallo es más corto y ligeramente más ancho que el posterior a la activación de la bobina en espiral conformación [20], de acuerdo con la hipótesis de que un drástico cambio conformacional es necesaria para gp41 para extender hacia, e insertar en, el objetivo membrana celular.

La forma del complejo sugiere un nuevo modelo para la organización trimer Env. Los volúmenes están en consonancia con la asignación de los dominios globulares de la gp120 y gp41 para detener. El gp120 protomers a veces parecen más de gp41 en lugar de apartarse de ella radialmente, ponerse en contacto entre sí en la parte superior de la espiga. La interacción entre gp120 monómeros a este contacto, es probable que sea débil, puesto que no es estable en ausencia de gp41 [21]. Esto es coherente con la necesidad de que el trimer de desarmar a permitir gp41 extrusión (Figura 4]. Una cavidad en el centro de la densidad, visible en un 2 sigma contorno nivel, sugiere que la gp120 trimer interfaz está separada de la parte superior de la gp41 trimer (Figuras 2 y 3].

Restando el volumen total de 28 Å de paso bajo-44-filtrada KDa trimer ectodominio gp41 [20] provienen de la región nos permitió asignar aproximadamente el resto de la densidad de gp120. Hemos equipado el modelo atómico de la SIV Sin gp120 dominio básico en esta densidad. Tanto la estructura atómica y la densidad disponibles son elipsoidales, que permita montaje en cuatro orientaciones. Estos encaja puede evaluarse a la luz de biofísica y bioquímica consideraciones [18]. La superficie de CD4 obligatorio debe estar expuesto en la superficie del trimer. Hidratos de carbono deben ser expuestos a solventes porque glicosilación sitios son casi exclusivamente presentes en las superficies expuestas las de las proteínas, y están obligados a Env para la evasión de anticuerpos neutralizantes. Algunos no-glucosilada, muy conservadas las secuencias son susceptibles de ser enterrado en el trimer interfaz o variable oculta detrás de los bucles. Además, el C1 y C5 regiones responsables de la interacción con gp41 [22] debe ser proximal a la gp120, gp41 interfaz. Sobre la base de estas consideraciones, dos encaja son coherentes con la densidad observada (Figura 3].

La precisión del ajuste está limitado por la resolución de la reconstrucción tomográfica, y por la falta de disponibilidad de las estructuras cristalinas. La estructura cristalográfica del SIV Sin gp120 núcleo carece de los bucles hipervariables V1V2 y V3, y la N-y C-terminal de dominios también están truncadas. El volumen de desaparecidos constituye una parte importante de la proteína (un total de 183 residuos están ausentes, aproximadamente un tercio de la proteína nativa). La movilidad de la variable regiones no se conoce: a pesar de que son muy flexibles en el monómero, que podrían ser parcialmente estabilizado en el trimer. Por otra parte, la conformación de la proteína en el cristal no se puede suponer para reproducir exactamente la conformación en vivo. Esto es particularmente cierto en el caso de una proteína que está sujeta a grandes cambios estructurales y que carece de una parte importante de sus componentes estructurales y elementos funcionales. Una estimación aproximada del volumen del mapa sugiere que la variable bucles son en su mayoría no es visible en la reconstrucción. La medida en que los azúcares son representados en el mapa de densidad de electrones no está claro. Por estas razones no es posible distinguir entre los dos sólo puede basarse en la forma de reconstruir la densidad. Tal vez sea posible distinguir los modelos basados en futuros estudios en los que gp120 protomers puede ser más precisa vinculante orientado por "hitos", como sCD4 o con anticuerpos conocidos epítopos, Env a la espiga de viriones intactos.

Los dos tienen mejor se adapte a una serie de características en común. En ambos equipados estructuras, todos los glycans se colocará de forma que puedan proyecto hacia el exterior de la superficie del trimer, y la variable regiones V4 y V5 se coloca en la parte superior del complejo, una orientación que facilite su reconocimiento por anticuerpos [23 ]. La superficie de CD4 obligatorio está expuesto en el borde exterior de cada gp120 protomer, y está orientado de tal manera que el acceso a la membrana asociada a CD4 en la celda objetivo es posible.

El tallo de la V1V2 bucle puntos hacia el exterior, tanto en accesorios, lo que implica una buena exposición a disolventes. Hay pruebas de que la V1V2 bucle de anticuerpos impide el acceso a la co-receptor en sitios de unión de monómeros gp120 [24]. Un modelo estructural sugiere que, dentro del trimer, este puede ser el resultado de una interacción entre el V1V2 bucle y el co-receptor del sitio de unión de monómeros adyacentes [6]. Esto no se puede excluir a cualquiera de nuestros modelos propuestos, aunque la conclusión de que V1V2 podría servir para ocultar la parte de CD4 obligatorio de bolsillo para protegerlo de reconocimiento de anticuerpos [24] sugiere que el bucle actúa en el mismo monómero para proteger regiones conservadas.

La C1 y C5 regiones propuesta de obligar a gp41 se encuentran en la N truncado y C termini de la proteína gp120. La distancia de los extremos truncado de la gp120, gp41 interfaz en tanto nuestros modelos es coherente con el plegamiento de los desaparecidos residuos hacia la gp41. También es probable que la punta de gp41 diverge hacia el exterior del tallo de obligar a gp120.

Los dos modelos que proponemos difieren dramáticamente en la orientación de la V3 bucles y en la posición de la co-receptor de sitios de unión. En el primer caso (Figura 3 A y 3 B), el V3 puntos base hacia el trimer interfaz. La densidad en la reconstrucción no ocupados por la estructura cristalina puede atribuirse a la V3 bucle, lo que iría más o menos paralela a la de 3 veces eje de simetría, siendo parcialmente expuestos en las cavidades entre los lóbulos. Trimer En este modelo, por lo tanto, el bucle V3 sería sustancialmente enmascarado de embalaje en el trimer eje, posiblemente reforzada por inter-V3 de Fianzas. En el segundo modelo (Figura 3 y C 3 D), el bucle V3 está orientada hacia el exterior, expuestos a disolventes. No hay más densidad correspondiente a la posición de V3, lo que significa que V3 sería muy flexible a los CD4-Sin trimer. El grado de exposición V3 antes de CD4 obligatorio depende del origen viral y su adaptación al crecimiento en cultivo de tejidos. Varios estudios demuestran la incapacidad de la mayoría de los V3 específicos de anticuerpos monoclonales (AcM) y de obligar a neutralizar cepas primarias del VIH-1 [25], y hay pocas pruebas para V3 loop-específica de anticuerpos neutralizantes contra el SIV actividad, mientras que V3 es un objetivo de anticuerpos neutralizantes en el cultivo de tejidos adaptados VIH-1 cepas [26]. CD4-gp120 compromiso se piensa para obtener un cambio conformacional en Env V3 que aumenta la exposición. Esto es experimental apoyado por el aumento de la accesibilidad de la V3 en el bucle Env trimer a unión de los anticuerpos y enzymic proteólisis CD4 posteriores a la participación [27, 28]. También es coherente con la naturaleza altamente expuesta de la V3 bucle en la estructura de la V3 que contienen gp120-CD4-Fab complejo [7]. El aumento de la exposición de V3 a los CD4 determinada conformación podría explicarse por una reordenación de la trimer en el primer modelo, o por un cambio conformacional que impliquen el bucle V3 en el segundo.

El co-conservada sitio de unión del receptor, que comprende el puente hoja [6] y las regiones, se piensa que es en gran parte inaccesibles en el trimer. Los datos experimentales apoyan este concepto, ya que la mayoría de CD4 inducida (CD4i) de superficie específica mAbs no pueden acceder a sus epítopos en las células CD4-unligated Env trimer, como lo demuestra la debilidad o ausencia de neutralización de estas mAbs [29]. El co-receptor vinculante región es principalmente enterrado en el trimer interfaz en nuestro primer modelo, y sólo una parte relativamente allosteric cambio dramático en cada gp120 protomer, o un importante cambio en la orientación gp120, o ambas cosas, permitiría su accesibilidad a los receptores de la superficie celular. Su posición en el segundo modelo propuesto es en la parte externa del lóbulo, en este caso el bucle V3 podría actuar como una protección de anticuerpos de reconocimiento y vinculante.

Un trimer modelo ha sido propuesto con anterioridad que en el interior de dominio de gp120 apunta hacia la gp120, gp41 y la interfaz exterior de dominio se extiende hacia el exterior [6]. Este modelo es incompatible con la orientación del eje mayor de la gp120 elipsoidal densidad en la densidad correspondiente a gp120 en nuestra estructura. En este modelo anterior, el bucle V3 está expuesta a la solvencia y co-receptor sitio de unión está enterrado en el trimer interfaz. Nuestros dos accesorios, no obstante, dejar claro que ni el bucle V3 es también apunta hacia el trimer de interfaz, o el co-receptor del sitio de unión es en el exterior del trimer, protegidos de disolvente de V3.

Es probable que el complejo de exposiciones Env algunos conformacionales flexibilidad. Regiones como variable de bucles y el co-receptor del sitio de unión transitoria podría ser expuestos y ocultos. La alta variabilidad en la medida de neutralización de las diferentes cepas virales de anticuerpos contra el bucle V3 y la capacidad de algunos virus para obligar a co-receptor sin necesidad de previo vinculante del receptor, podría reflejar la falta de una singular conformación de la asamblea trimer . En principio, el mapa que obtuvimos Mayo características promedio de más de una conformación del complejo Env. La futura labor se desarrollará en tres dimensiones adecuadas herramientas de clasificación para el análisis estructural de la variabilidad en la glicoproteína espigas.

Los dos modelos propuestos arrojar luz sobre varios importantes antigénica y mecanicista características del trimer Env. En primer lugar, proporcionan modelos en consonancia con el concepto que glycans y immunodominant variable bucles se coloca en gp120 superficies expuestas a la humedad la respuesta de anticuerpos neutralizantes. En segundo lugar, confirman que sólo un pequeño gp41 superficie está expuesta a unión de los anticuerpos, como lo ha propuesto anteriormente [30]. En tercer lugar, disponemos de dos posibles descripciones de la posición del bucle V3 y el co-receptor de carácter vinculante en la superficie no encuadernado espiga. Por último, al limitar el número de posibles gp120 accesorios a dos, excluyen otros posibles modelos para el trimer.

Durante el examen de la labor que aquí se presenta, otro estudio, se hizo pública la presentación de informes la estructura tridimensional de la SIV Env compleja en su conformación no encuadernado CD4 [31] obtenido mediante un electrón enfoque basado en la tomografía. A pesar de que la altura y la amplitud de las estructuras son similares, las formas de las dos estructuras diferentes, notablemente en la "región del tallo" de la espiga. En contraste con nuestra estructura, cada monómero en las tres dimensiones mapa obtenidos por Zhu et al. [31] es multilobed y la glicoproteína transmembrana gp41 dividido en tres densidades. Las razones de las diferencias entre las dos estructuras no están claros. Consideramos que es poco probable que las diferencias entre las dos estructuras reflejan una diferencia entre las dos cepas del virus. Una posibilidad que no podemos excluir es que los dos diferentes reconstrucciones representan dos diferentes conformaciones de la glucoproteína presente en la superficie viral seleccionados durante la aproximación y el promedio.

Los dos estudios difieren en una serie de detalles de la metodología de procesamiento de imágenes. En particular, hemos utilizado a partir de tres canales distintos modelos y han tratado la resolución anisotropía (causada por la "falta de cuña" en tomográfica datos debido a la limitada gama de inclinación) durante el proceso de adaptación [11]. Dada la novedad del procesamiento de imágenes procedimientos utilizados en esos estudios, de manera directa y detallada comparación de los dos enfoques es necesaria para descartar la posibilidad de que estas diferencias metodológicas son responsables de las estructuras contrastantes.

Las tres dimensiones de la reconstrucción in situ, funcional trimeric Env espiga es un importante paso adelante por dos razones.

En primer lugar, visualizar la forma tridimensional de la espiga da una idea de los posibles mecanismos moleculares de la fusión viral y la evasión inmune. Se sugiere la presencia de un gp120 trimer interfaz separados de la gp120, gp41 interfaz. Esto implica que el desmontaje de los receptores de la proteína de unión puede ocurrir en dos etapas: el desmontaje de la gp120 trimer interfaz seguida de la separación de gp120 de gp41. El primer paso podría ser activado por CD4 vinculante y ser necesarias para co-receptor de carácter vinculante. El primero de los dos encaja que presentamos podría ser una elegante explicación de este mecanismo, tal y como se representa en la Figura 4. En el esquema propuesto, los CD4 inducida por la rotación de gp120 monómeros se exponen simultáneamente tanto el bucle V3 y salvar la hoja, lo que permite co-receptor de compromiso.

En segundo lugar, las tres dimensiones densidad proporciona una base para la instalación de estructuras de resolución atómica, y la evaluación de modelos de estructura trimer. En este sentido, estos accesorios conducir a dos posibles modelos para la organización de los CD4-Sin Env trimer, que contribuyen a hacer avanzar el conocimiento de la trimeric Env asamblea y, por tanto, podría contribuir a la mejora de la estructura basada en las drogas y el diseño de vacunas.

Los estudios futuros, definiendo con gp120 ligandos ayudará a confirmar la correcta instalación.

SIVmneE11S partículas liberadas en el sobrenadante de infectados Hut 78 células (SIVmne / Hut 78 CL E11S) se inactiva por el tratamiento con aldrithiol-2, un agente oxidante suave que no altera la función Env [32], y luego purificado por centrifugación gradiente de sacarosa como se describe en [33].

Las muestras fueron mezcladas con adsorbido BSA-10-nm de oro coloidal y vitrificados de crio-microscopía electrónica [14]. Los datos fueron recolectados en un Philips CM300FEG microscopio electrónico de transmisión (FEI, Eindhoven, Holanda), equipado con un Gatan GIF 2002 postcolumn energía filtro (Gatan, Pleasanton, California, Estados Unidos), y las imágenes fueron recogidos con un 2K × 2K Multiscan CCD cámara (Gatan). El microscopio fue operado a 300 kV y una última ampliación de 55000 ×, lo que da un tamaño de pixel de 0,55 nm en la muestra. Tilt serie han sido recogidos en semi-automática, con un mínimo angular gama de 123 °, con un ángulo incremento de 3 °. Desenfocado se midió a lo largo de la inclinación del eje después de cada inclinación y de oficio. Tilt serie han sido recogidos en Desenfocado valores de -6 ± 0,5 μ m y -4 ± 0,5 μ m, con un total de electrones dosis de entre 50 y 70 electrones / Å ^2.

Con inclinación imágenes fueron alineados utilizando las bolas de oro como referencia a los marcadores en un plazo máximo de bolas de error de posicionamiento de dos píxeles (11 Å). Tridimensionales reconstrucciones fueron obtenidos usando ponderado atrás las proyecciones. Alineación, la reconstrucción, la extracción de sub-tomograms, y además el procesamiento de imágenes se realizaron con el TOM ( http://www.biochem.mpg.de/tom ) [34] paquetes de software implementado en MATLAB (Mathworks, Natick, Massachusetts, Estados Unidos). La visualización se realizó con Amira ( http://www.amiravis.com ) Y PyMOL ( http://pymol.sourceforge.net ).

Sub-tomograms (360 píxeles) que contiene viriones individuales fueron extraídos para su uso en el tratamiento posterior, tal y como se describe en [11]. Desde el -6 - μ m Desenfocado sub-tomograms, 300 picos virales fueron identificados por los ojos, extrajeron a 63-pixel cúbicos cajas, alineados y, a continuación, en promedio [11]. El cuadro de tamaño fue elegida para contener parte de la membrana viral y intraviral material. El promedio de la estructura se utilizó como una plantilla para la identificación de picos de más global, correlación cruzada de búsqueda de enmascarados tomograms esférica de cada uno de los viriones. Una cuña-desaparecidos función se aplicó a la transformada de Fourier de la plantilla a fin de que no preferenciales orientación de los picos fue seleccionado debido a los límites sobre el alcance de los datos inclina. Los picos correspondientes a las más altas 200 correlación cruzada picos para cada virus y se extrajeron manualmente inspeccionado para eliminar los falsos positivos como el oro y perlas de partículas superposición con otros vecinos a los virus. Un total de espigas de 2115 (a partir del 26 de viriones) fueron recogidos por el -6 - μ m de datos, y 4698 (de 51 viriones) para el -4 - μ m. Los primeros ángulos de Euler [11] fueron asignados para el -6 - μ m de datos de asumir la espiga se orientó perpendicular a la superficie viral y la alineación del eje z con el vector entre el centro de la partícula del virus y el centro de la espiga extraídos. Phi, la rotación en torno a este eje, fue inicialmente al azar. Quince alineación iteraciones se llevaron a cabo de acuerdo con [11] utilizando una máscara elipsoidal. Una primera alineación se realizó sólo permite la rotación alrededor del eje z. La vista a lo largo de z mostró clara de 3 veces la simetría después de cinco repeticiones (figura S2]. Diez repeticiones una mayor adaptación se llevaron a cabo permitiendo la rotación en torno a todos los ejes, la aplicación de 3 veces symmetrisation a la referencia. Una cuña de desaparecidos se aplicó a la transformada de Fourier de la forma adecuada girar las referencias en cada alineación antes de correlación cruzada con cada partícula [11]. Al omitir este paso puede llevar a la alineación de las partículas en relación con los desaparecidos cuña en lugar de la señal de partículas, la introducción de artefactos en la estructura final. Un promedio de reconstrucción se obtuvo la incorporación de espigas de 1820 con una correlación cruzada umbral fijado para el 80% de la media de correlación cruzada valor. Esta reconstrucción se utiliza como modelo de partida para la alineación de los picos de -4 - μ m de datos después de un plan similar que el utilizado para la -6 - μ m de datos. El número de espigas de incorporarse a la reconstrucción después de cada iteración se incrementó gradualmente la reducción de la cruz-coeficiente de correlación umbral. Después de más del 60% del conjunto de datos se incluyó, el muestreo angular del incremento fue el aumento de 5 ° a 2 °, y el general angular gama búsquedas se redujo. Alineaciones de phi sólo se llevaron a cabo cada tres a cinco alineaciones completas medidas para evitar la acumulación preferencial de ruido. Iteraciones se continuó hasta la concha de correlación de Fourier (FSC) y la curva de la media transversal coeficiente de correlación no mejoró aún más. La última reconstrucción había una resolución de 28 Å juzgado como utilizando el criterio 0,5 FSC, y se pasa bajos filtrados a la presente Resolución.

El modelo molecular del SIV unliganded gp120 fue inicialmente instalado manualmente en la densidad correspondiente a gp120 y luego refinado usando el programa URO [35].