Medical Immunology, 2006; 5: 1-1 (más artículos en esta revista)

Obtención de virus-ingenuo de los individuos los linfocitos T citotóxicos dirigidos contra conservadas del VIH-1 epítopos

BioMed Central
A Pedro Reche (reche@research.dfci.harvard.edu) [1], B Derin Keskin (derin_keskin@dfci.harvard.edu) [1], Rebecca E Hussey (rebecca_hussey@dfci.harvard.edu) [1], Petronela Ancuta (petronela_ancuta@dfci.harvard.edu) [2], Dana Gabuzda (Dana_Gabuzda@dfci.harvard.edu) [2], Ellis L Reinherz (ellis_reinherz@dfci.harvard.edu) [1]
[1] Laboratorio de Inmunobiología y el Departamento de Oncología Médica, Dana-Farber Cancer Institute, 44 Binney Street, Boston, MA 02115, EE.UU.
[2] Facultad de Medicina de Harvard, Boston, MA 02115, EE.UU.
[3] Departamento de Inmunología del Cáncer y el SIDA, Dana-Farber Cancer Institute, 44 Binney Street, Boston, MA 02115, EE.UU.

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Resumen

Linfocitos T citotóxicos (CTL) proteger contra los virus, incluido el VIH-1. Para evitar el escape viral mutantes que frustrar la inmunidad, escogimos 25 epítopes CTL se define en el contexto natural de la infección con el funcional y / o las limitaciones estructurales que mantienen la secuencia de conservación. Mediante la combinación de HLA vinculante predicciones con los conocimientos relativos a frecuencias de los alelos HLA, un indicador estimar la población cobertura de la protección (PPC) se calculó y epítopo piscinas montados. Sorprendentemente, sólo una minoría de inmunocompetentes infectados por VIH-1 individuos responde a las piscinas con PPC> 95%. Por el contrario, el virus de ingenuo individuos de manera uniforme ampliar IFN γ y células productoras de montaje anti-VIH-1 actividad citolítica. Esta disparidad sugiere un diseño de vacunas cambio de paradigma de infectados a sujetos normales.

Fondo

Aunque han pasado más de 20 años desde el descubrimiento de que el VIH-1 es la causa del síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA), aún no estamos cerca de hacer realidad una vacuna para detener la devastación creada por la pandemia del SIDA [1]. VIH-1 de liquidación de la huésped humano sistema inmunológico y el desarrollo eficaz de inmunidad natural nunca han sido observados en pacientes con SIDA. En consecuencia, se correlaciona de protección inmunitaria se desconoce (revisado en [2]]. Varias características del VIH-1 la biología han dado lugar a desafíos sin precedentes para el desarrollo de una vacuna [3, 4]. En primer lugar, el virus ha extraordinaria diversidad genética de una población mundial escala, así como a nivel de la única persona infectada [5, 6]. Con hasta un mil millones de nuevas partículas virales producidas por día en una persona infectada, el VIH-1 la variabilidad genética puede ser mayor dentro de una acogida en todo el mundo que la variabilidad de los virus de la gripe A en cualquier año. Esta secuencia / epítopo variabilidad que impide el eficaz celular y la respuesta inmune humoral. En segundo lugar, infección por VIH-1 blancos CD4 + células T helper, por lo tanto embotamiento mecanismos que, normalmente, ampliar la inmunidad adaptativa. En tercer lugar, el VIH-1 es difícil de neutralizar porque la dotación glicoproteínas virales están protegidos por un escudo glycan, y existen en varias conformaciones diferentes, lo que hace epítopos conservados en gran parte inaccesibles al anticuerpo mediada por la neutralización [4].

CD8 + citotóxicos los linfocitos T se ha demostrado que contribuyen al VIH-1 a través de la contención directa de matar a las células infectadas y la producción de solubles anti-viral mediadores [7 - 9]. En un estudio, los pacientes de SIDA con un alto anti-VIH-1 específica CTL CD8 + en sangre los niveles de exposición en general mejor estado clínico [10]. Por otra parte, vivo en la contención del VIH-1 replicación parece coincidente con la aparición de CTL específicos, mucho antes de anticuerpos neutralizantes [8]. Por el contrario, mutaciones virales resultantes en la pérdida de VIH-1 o el virus de inmunodeficiencia símico (SIV) el reconocimiento de CTL están vinculados al aumento de la replicación viral in vivo y la disminución de la función inmunológica [11, 12]. Experimental agotamiento de los linfocitos T CD8 + SIV antes de la infección en monos incontrolada conduce a la replicación viral, se aceleró la enfermedad y la muerte [13]. Colectivamente, estos datos sugieren que la inducción de CTL respuestas a una adecuada selección del CTL epítopos virales antes de que el VIH-1 podría exposición integrada por un elemento importante en el VIH-1 el desarrollo de una vacuna. Este estudio se ocupa de Obtención de CTL contra conservadas del VIH-1 epítopos usando sangre de donantes sanos y las consecuencias de nuestras conclusiones sobre la futura prevención del VIH-1 vacuna diseños.

Métodos
Generación de un consenso VIH-1 proteoma

Un consenso del VIH-1 proteoma que lleven una secuencia consenso de la pandemia del VIH-1 productos genéticos (GAG, POL, ENV, VIF, TAT, REV, VPU / VPX, VPR, y NEF), con la variable de residuos enmascarados se obtuvo como se indica a continuación. En primer lugar, múltiples alineamientos de secuencias para los VIH-1 productos genéticos incluso el establecimiento de todas las secuencias de VIH-1 se recuperaron clados de la epidemia del VIH en las bases de datos de Los Alamos [14] (Tabla 1]. Luego, la variabilidad de secuencias en las alineaciones se calculó utilizando una variabilidad métricas (V), formalmente idéntica a la ecuación de la entropía de Shannon [15]. En pocas palabras, V por sitio está dado por:

donde Pi Pi es la fracción de residuos de aminoácidos tipo i, y M es igual a 20, el número de tipos de aminoácidos. V va de 0 (total conservación, sólo un tipo de aminoácidos está presente en esa posición) a 4.322 (los 20 aminoácidos están representados por igual en esa posición). Tenga en cuenta que a fin de lograr el máximo valor de V = 4,3, por lo menos 20 secuencias son obligatorios. Gap símbolos (-) fueron considerados para obtener la secuencia de consenso, pero no se computa para el cálculo de variabilidad. Por último, las secuencias de consenso con la variable posiciones enmascarados se obtuvieron de la siguiente manera. Una variabilidad del umbral (Vt) se estableció 1,0, y para cada posición en la alineación V se comparó con el Vt, si VVt el más frecuente de residuos se ha seleccionado como el consenso, de lo contrario si V> Vt "." símbolo se utiliza para enmascarar la secuencia en esa posición (la pandemia del VIH-1 proteoma consenso generado en tal forma se muestra en archivo adicional 1].

Predicción de la péptido-HLA I vinculante y la determinación de la HLA-I vinculante perfil de epítopos CTL

MHCI-péptido vinculante predicciones fueron obtenidas utilizando la posición específica de las matrices de puntuación (PSSMs), también conocido como el peso o matrices de perfiles, que se obtienen a partir de péptidos alineados sabe que se unen a las moléculas de MHCI [16]. PSSMs utilizada en este estudio fueron obtenidos a partir de 9mer péptidos, y, por ende, predijo péptido todas las carpetas se 9mers. El uso de este enfoque se ha demostrado que ≥ 85% de cierto péptido-MHCI aglutinantes se encuentran entre la parte superior del 2% de puntuación péptidos de una proteína [16]. El potencial de unión de cada seleccionado CTL epítopo a 55 moléculas HLA I de representante PSSMs que están disponibles se evaluó lo siguiente: A) la secuencia epítopo se adjunta al azar a una proteína de 1000 aminoácidos de longitud (siempre el mismo) con un aminoácido distribución obtenidos a partir de VIH-1 secuencias; B) MHCI-péptido vinculante predicciones de esta proteína son aleatorios obtenidos mediante la correspondiente PSSMs; C) vinculante de la CTL epítopo a una molécula HLA I se considera a ocurrir si su secuencia se encuentra entre los primeros 2% ranking de péptidos. Ciclismo a través de los pasos anteriores resultados en una tabla que consta de unas previsiones de HLA I vinculante para cada perfil CTL epítopo.

Cálculos la frecuencia acumulativa fenotipo

Dado un conjunto de alelos HLA I (N), su frecuencia acumulada fenotípica (CPF) en una población dada puede reconstruirse desde los genes y las frecuencias de haplotipos de los alelos individuales usando la ecuación 2.

donde la EPF cuenta i plazo previsto para la fenotípica de frecuencias de cada uno de los alelos (i), y la ECPFij ECPFij cuentas plazo previsto para la combinada fenotípica de frecuencia de cada dos par de alelos (ij) en la N conjunto. EPFi se calcula mediante la ecuación 3:

EPFi = 2xGFi - (GF i) 2 Eq. 3

GF donde i es la frecuencia de genes del alelo i. Por otra parte, habida cuenta de un par de alelos (ij), ECPF ij se calcula el momento de considerar si pertenecen al mismo gen HLA I (HLA-A,-B,-C) o no. Si lo hacen pertenecen a un mismo gen, que asumir un equilibrio de Hardy-Weinberg y calcular ECPF ij de la siguiente manera:

ECPF ij 2xGF i = j xGF; Eq. 4

Sin embargo, si los dos alelos pertenecen a diferentes genes y sus frecuencias de haplotipos está disponible (HF ij) calculamos ECPF ij utilizando la siguiente fórmula:

ECPF ij = 2xHF ij - (HF ij) 2 Eq. 5

Si las frecuencias de haplotipos no está disponible, ECPF ij se calcula como si pertenecían al mismo gen mediante la ecuación 4. En este estudio, HLA I alélica y haplotipo frecuencias utilizadas para los cálculos anteriores son los publicados por Cao et al [17], que corresponde al 5 de los principales grupos étnicos de América (Negro, el Cáucaso, hispanos, nativos americanos, y asiáticos). Tenga en cuenta que para el cálculo de la ACB, hemos utilizado un método similar a la de Dawson et al. [18] que, a diferencia de los métodos de Schipper [19] y Gulukota [20], considera haplotipo frecuencias y, por tanto, desequilibrio en el ligamiento genético. Sin embargo, en contraste con Dawson et al., Reducir al mínimo el número de péptidos que han de incluirse en la vacuna en lugar de los alelos que están obligados a ser los objetivos vinculantes para los péptidos.

La selección de un conjunto mínimo de epítopos proporcionar una población determinada cobertura de la protección (PPC)

Para un conjunto de epítopos CTL, el PPC se define la proporción de población que podrían montar una respuesta inmune a ninguno de estos epítopes. Dada la necesaria HLA I restricción de las respuestas CTL, el PPC de un conjunto de epítopos CTL coincide con la proporción de la población que presenta al menos uno de los alelos HLA I orientadas por la unión cualquiera de los epítopos, y es a su vez, dado por la ACB de los dirigidos I alelos HLA. Siempre que un conjunto de epítopos CTL (N CTL) y sus perfiles vinculante (alelos HLA I se unen a ellos), un algoritmo para la selección de un subconjunto mínimo de epítopos (K) proporcionando una PPC ≥ 95% se llevó a cabo como sigue:

1. Empecemos por examinar todos los subgrupos independientes (X), de epítopes CTL en N K de tamaño (número de epítopos), a partir de 2.

2. Para cada subconjunto independiente de epítopos, su HLA I vinculante perfiles se han puesto en común en una sola no redundante gama de alelos HLA I, y la ACB se calcula por 5 principales grupos étnicos de América utilizando el gen HLA I haplotipo y frecuencias informó de Cao et al [ 17]. Sólo epítopo subconjuntos llegar a un ACB ≥ 95% para los cinco grupos étnicos se guardan y devuelto por el algoritmo.

3. Si ninguno de los subgrupos independientes epítopo X de tamaño K se encuentra para llegar a un ACB ≥ 95% el algoritmo aumenta el tamaño de subgrupo 1 y bucles más de 1 a 3.

4. El algoritmo se detiene en bicicleta y que muestra los resultados cuando por lo menos 4 independientes subconjuntos de epítopos de tamaño K llegar a un ACB ≥ 95%. Si sólo el 3 conjuntos independientes de tamaño K se encuentran para llegar a un ACB ≥ 95%, el programa del ciclo, una vez más, y encontrar los subconjuntos de tamaño K + 1 que llegar a un ACB ≥ 95% y, a continuación, salir.

VIH-1 epítopos CTL específicos y montaje de piscinas péptido

Los 25 péptidos considerados en este estudio que consta de VIH-1 epítopos CTL específicos fueron sintetizados por Co Invitrogen (Carlsbad, CA). HPLC análisis demostró que la pureza de los péptidos sintetizados crudo fue 86-92%. Todos los péptidos había esperado masas como se ha confirmado por espectrometría de masas. Crudo péptidos se utilizaron durante los primeros ensayos de péptidos vinculante y péptidos seleccionados crudo se purifica a> 96% por HPLC en fase reversa para más experimentos. Varias piscinas péptido se obtuvieron mediante la combinación de un exceso número de epítopos CTL proporcionar una PPC ≥ 95%, con piscina péptido # 1 que contiene todos los péptidos seleccionados y grupos más pequeños # 2 - # 5, tal como se definen en los resultados. Todos los péptidos piscinas fueron preparados en DMSO a 200 μ m cada uno.

Generación del VIH-1 específica de células T líneas

Langerhans-al igual que APC se diferencian las células de los donantes adherente monocitos en medio DMEM suplementado con 20% de donantes de suero, L-glutamina (2 mM), penicilina (100 U / ml), estreptomicina (100 μ g / ml), 2-ME (50 μ M). (DMEM completo), GM-CSF (50 ng / ml), IL-4 (50 ng / ml) y TGF β 1 (10 ng / ml) (Peprotech) durante una semana. Disociados células de Langerhans, se madurado con 1 μ g / ml peptidoglicano (Sigma) durante la noche. Las células fueron pulsados con el VIH-1 péptido piscinas (10 μ M total) durante 3 h y irradiados (3000 rad). Fresh PBMC de donantes fueron preparados por Ficoll-Paque (Amersham Biosciences) centrifugación. PBMC de donantes se chapada a una densidad de 10 7 células / ml, junto con 5 × 10 4 / ml de péptido irradiados cargado de donantes de células de Langerhans en 24 placas y cultura en medio completo DMEM con 10 μ M HIV-1 péptido piscinas. Culturas fueron alimentados con 10 U / ml IL-2 (BD biociencias) cinco días después de la estimulación y re-estimulado con péptido cargado irradiado (3000 rads) frescos de donantes PMBC cada semana. Repetición de 96 placas fueron bien pulsado con 1 μ Ci así por 3 H timidina después de 4 días de cultivo, cosechadas después de 18 h, y 3 H timidina incorporación se detectó mediante un β contra (Perkin Elmer 1450 LSC).

CTL análisis

A0201 + TAP-T2 deficiente hibridoma las células diana (ATCC) o A2 supertype transfectadas 721,221 líneas celulares fueron chapados a una densidad de 10 6 células / ml en 24 y placas. Las células fueron pulsados con 10 μ M-A0201 restringido el VIH-1 o péptido piscina 10 μ M A0201restricted HTLV-TAX como péptido control negativo durante 18 horas a 37 ° C. Las células fueron lavadas dos veces con DMEM los medios de comunicación (20% de suero de ternera fetal, L-glutamina (2 mM), penicilina (100 U / ml), estreptomicina (100 μ g / ml), 2-ME (50 μ M). (DMEM los medios de comunicación) . Pulsátil y con 100 μ C, de 51 Cr durante 90 minutos a 37 ° C. Meta células fueron lavadas tres veces con suero libre OptiMEM los medios de comunicación (Gibco) para eliminar el exceso de Cr 51 y chapados ordenados con el VIH-1 específica linfocitos T CD8 + al 30 : 1, 10:1, 3:1 y 1:1 ratios. Después de cuatro horas de incubación de 50 μ l de la cultura sobrenadante se mezclan con líquido scintillation cóctel (Perkin Elmer Optiphase Supermix) y se analizaron por 51 Cr liberación utilizando una luminiscencia contra (Perkin Elmer 1450 LSC). Porcentaje específico cromo liberación se calculó utilizando la fórmula [(liberación experimental-liberación espontánea) / (máximo liberación en el 5% Triton-100x-liberación espontánea)]. Para analizar las respuestas a CTL, naturalmente, procesado por VIH-1 epítopos, TAP suficiente T1 hibridoma las células diana T1 (+ A0201, B5101 +, CD4 +) se infectaron con el VIH 0,5 MOI-IIIB por celda durante 3 horas. Células fueron lavadas y chapada a una densidad de 10 6 / ml DMEM en los medios de comunicación. 2-3 días más tarde, el VIH-IIIB células infectadas T1 se utilizaron en 51 Cr liberación de ensayo tal y como se describe más arriba. intracelulares tinción de p24 FACS se utilizó para demostrar que la práctica totalidad de las células diana eran VIH-IIIB-infectados.

IFN-γ ELISPOT ensayo sobre infectados por VIH-1 células de donantes

CD8 + T-cell respuestas a las piscinas del VIH-1 epítopos fueron cuantificados por el interferón gamma (IFN-γ) ELISPOT ensayo de la siguiente manera. De sangre periférica de células mononucleares (PBMC) aislados de VIH-1 en pacientes infectados fueron chapados a 100000 por pocillo con piscinas péptido a una concentración final de 10 μ M en la lucha contra el interferón gamma MAB 1-D1K (Mabtech, Estocolmo, Suecia) recubierto polivinilideno 96 -- así placas (Millipore.MA) y procesado tal como está descrita anteriormente [21]. Para cada uno de los péptidos, el ensayo se realizó por triplicado. Controles positivos y negativos fueron obtenidos por los distintos incubando PBMC con medio solo (control negativo) y phytohemagglutinin (PHA) como control positivo para los pacientes ingenuos. Para la evaluación general de immunocompetence de VIH-1 en pacientes infectados, un péptido CEF piscina se utilizó como control positivo interno. El CEF se compone de piscina óptima de células T epítopos para CMV y VEB y Los virus de la gripe proporcionada por el NIH reactivo programa. Sólo VIH-1 en pacientes cuya sangre arrojó positivo CEF y / o PHA respuestas fueron elegidos como temas para el presente estudio.

El número específico de IFN-γ secretora de las células T se determinó con un sistema automatizado ELISPOT lector (AID, Strassberg, Alemania), calculado restando el promedio de control negativo y el valor expresado en el número de espacios de formación de las células (SFC) 10 6 por entrada células. Controles negativos fueron aproximadamente el 50 por SFC 10 6 células de entrada para el VIH-1 y los pacientes infectados por alrededor de 40 temas para ingenuos. La respuesta fue considerada positiva si había 50 por SFC 10 6 células de entrada y la actividad era, al menos, tres veces mayor que la media de antecedentes actividad.

IFN γ - la producción sobre el VIH-1 de células T específicas generados a partir de líneas de ingenuo donantes

VIH-1 piscina péptido-específicas líneas de células T se generaron como se ha descrito anteriormente. Dos semanas después de la segunda estimulación, 25000 y por VIH-1 en células T específicas se chapada en anti-interferón gamma MAB 1-D1K (Mabtech) recubierto polivinilideno placas de 96 pocillos (Millipore) con 25000 por así irradiados PBMCs de donantes y estimulado con 10 μ M de cada VIH-1 péptido piscina. Las placas fueron procesados in situ y la formación de las células se calculará según el método descrito más arriba.

HLA-A 0201-vinculante de ensayo

A0201 + TAP-T2 deficiente hibridoma de células (ATCC) fueron chapados a una densidad de 10 6 células / ml en 24 y placas. Las células fueron pulsados con 10 μ M A0201 restringido el VIH-1B péptidos, 10 μ M A0201restricted HTLV-TAX (LLFGYPVYV) péptido control positivo y 5 μ g / ml β 2 microglobulina (BD biociencias) durante 18 horas a 37 ° C en el suero libre AIM5 los medios de comunicación ( Gibco). A0201 expresión fue determinada por citometría de flujo (FACSAria), utilizando conjugado con FITC BB7.2 MAB (BDbiosciences). La media de fluorescencia de células (MCF) intensidades se normalizaron a HTLV-TAX péptido control positivo utilizando la fórmula [(MCF.sample-MCF.control) / (MCF.HTLV-TAT-MCF.control)].

DimerX tinción

A2: Ig proteína de fusión DimerX (BD Biosciences) fue pasiva cargado con los distintos A0201 restringido el VIH-1B péptidos o control positivo VEB péptido a 640 molar en exceso de PBS pH 7,2 la noche a la mañana. VIH-1B específica las células CD8 + se colorearon con péptido cargado A2: Ig proteína de fusión DimerX reactivo y detectado por PE-conjugados A85-1 MAB (anti-ratón IgG1, BD biociencias). DimerX tinción fue determinada por citometría de flujo (FACSAria, BD Biosciences). El esfuerzo de control negativo se obtuvo utilizando la pandemia del VIH-1 de células T específicas y una línea no pertinentes VIH-1 péptido cargado DimerX. El control positivo se obtuvo utilizando PBMC de donantes estimulados con 1uM BMLF-1 VEB péptido durante una semana y luego teñidas con EBV péptido cargado dímero X.

Generación de alelos HLA específicos para transfectants péptido vinculante y análisis de restricción
Resultados y discusión
Estrategia para la selección de VIH-1 específica de células epítopos CTL y la generación de péptido piscinas

En este estudio, se acercaron a la formulación de objetivos CTL de una colección única de 199 VIH-1 epítopos CTL recuperados de Los Alamos la base de datos sobre el VIH [14]. Los péptidos son todos 9mers, que es la duración óptima del péptido para MHCI vinculante, y se sabe que obtener respuestas CTL en uno o más infectadas por VIH-1 las personas, lo que indica que son procesados naturalmente en el curso de la infección. Identificación de epítopos procesados elimina un obstáculo en CTL epítopo a base de diseño de vacunas. Sin embargo, el éxito de CTL estrategia basada debe enfrentar la variabilidad de secuencias del VIH-1 cepas y el polimorfismo de las moléculas de MHCI humanos (HLA I). VIH-1 secuencia variación contribuye en gran medida inmune a la evasión. De hecho, se ha sugerido que en un nivel de población, el VIH-1 variantes han ido evolucionando para adaptarse a las respuestas CTL [23, 24]. Sin duda, CTL escape variantes pueden surgir dentro de mutaciones y / o de acompañamiento del VIH-1 epítopos CTL [12].

Para seleccionar objetivo epítopos menos probabilidades de escapar de la CTL, primero sometido representante de todos los virus VIH-1 clados (Tabla 1) a una entropía de Shannon (H) la variabilidad del análisis [25], eliminando así o "enmascaramiento" de cualquier residuo con H> 1. Ver archivo adicional 1 para el resultado del VIH-1 proteoma consenso. Todos los residuos seleccionados en los epítopos CTL, por lo tanto, son cuasi-invariante. La más proximal de residuos de acompañamiento el C-terminal de la CTL epítopo es un factor determinante para la división de la proteosoma, y mutaciones en residuos que pueden derogar el reconocimiento de células T [26]. Por lo tanto, también excluidos los epítopos CTL con un C-terminal de acompañamiento de residuos con H> 1. Como resultado, sólo 37 de los 199 VIH-1 CTL péptidos fueron elegidos.

Polimorfismos HLA I complicar el desarrollo de una amplia protección CTL epítopo vacuna mediante la limitación de la cobertura de la población. Para que una selección de epítopes CTL, la población cobertura de la protección (PPC) está dado por el porcentaje de frecuencia acumulada fenotípica (CPF) de los alelos HLA restringir estos epítopes. ACB puede reconstruirse desde los genes HLA y frecuencias de haplotipos en la población. El uso de la I gen HLA y frecuencias de haplotipos informó de Cao et al. [17] para cinco grandes grupos étnicos de América (Negro, el Cáucaso, hispanos, nativos americanos, y asiáticos), hemos desarrollado un algoritmo que computa la primera unión de cada epítopo a 55 alelos HLA I seleccionado y, a continuación, epítopo combinaciones proporcionar una PPC ≥ 95% para todos los grupos étnicos considerados (detalles en el apoyo a los métodos). A partir de este análisis, prevé que tan sólo cinco epítopos de los 37 conserva el VIH-1 epítopos CTL específicos debe ser reconocido por = 95% de la población, independientemente de su origen étnico. Por otra parte, hemos identificado 5-epítopo combinaciones utilizando sólo 25 de los 37 conserva el VIH-1 epítopos CTL específicos (Tabla 2]. Estos epítopos CTL 25 se distribuyeron de la siguiente manera: POL (transcriptasa inversa, integrasa y la proteasa), 14 de epítopos; GAG, 5 epítopos; ENV, 3 epítopos, y NEF, 3 epítopos. Ninguno de los epítopos fueron encontrados en los cinco restantes proteínas marcos de lectura abierta (ORFs) codificado por el VIH-1 del genoma (VIF, TAT, REV, VPU / VPX, y VPR). Esta distribución refleja, en gran parte, del volumen global así como el grado de conservación de los diferentes VIH-1 ORFs. Por otra parte, la inspección visual de las estructuras 3D revela que estos epítopos abarcar los residuos que son importantes tanto para la integridad estructural y / o actividad catalítica. Por ejemplo, epítopos TLVDVGDAY y VIYQYMDDL de VIH-1 la transcriptasa inversa (POL) son 6 y 4 los residuos, respectivamente, participan en sustrato de carácter vinculante y catálisis [27]. La pena por mutaciones en cualquiera de estos sitios con respecto a la aptitud viral presumiblemente se opone listo desarrollo de variantes de escape.

Una minoría de VIH-1 responde a pacientes VIH-1 específica CTL péptido piscinas

Que tan sólo 5 péptidos pueden proporcionar la necesaria PPC en gran medida se deriva de su capacidad de obligar a muchos a diferentes moléculas HLA I. El péptido SPRTLNAWV sí se prevé para obligar a ocho distintas HLA I alélica variantes, ofreciendo un PPC que van desde 35% en los asiáticos al 52% en los indios de América del Norte. Esa promiscua MHCI-péptido vinculante a menudo reside en previamente definidos supertypes HLA I (es decir, con similares alelos péptido vinculante especificidad [28]], por ejemplo, el péptido SPRTLNAWV se une a la B7 supertype y el péptido AVFIHNFKR a la A3 supertype. No obstante, la promiscuidad es vinculante no se limita exclusivamente a HLA I supertypes. Por ejemplo, el péptido EKEGKISKI se prevé que se unen a los alelos B2701, B3801 B39011, B3909, B4402, B5101 y B0801, que no se ajustan a cualquier conocido supertype, y péptido LVGPTPVNI se prevé que se unen a varios alelos en la A2 supertype ( A0201 A0202 A0205 A0209), pero, además, a otros no relacionados con los alelos de HLA-B locus (B2701 y B3801).

Con el fin de evaluar la exactitud de la predicción PPC, cinco piscinas péptido fueron creados, cada solubilized en DMSO y la combinación de epítopos CTL (200 μ M cada uno) para proporcionar una PPC ≥ 95% (péptidos incluidos en las piscinas se muestran en la Tabla 3]. Péptido 1 piscina figuran los 25 seleccionados péptidos que péptido piscinas # 2 (15 péptidos), # 3 (13 péptidos), # 4 (11 péptidos), # 5 (7 péptidos) que comprende 55, 13, 11, 5, 2, respectivamente , De distintas 5-péptido que producen combinaciones ≥ 95% PPC. Péptidos 1-5 piscinas fueron diseñadas de manera que los péptidos en los grupos más pequeños están contenidas en las grandes piscinas. CD8 + T cell respuestas a estas piscinas fueron controlados por el IFN γ ELISPOT ensayo utilizando PBMC muestras de una cohorte de 47 infectados por VIH-1 los pacientes. Los pacientes fueron en gran medida heterogéneos con respecto a sus antecedentes I HLA y se incluían los diagnosticados durante aguda o crónica por VIH-1 con o sin terapia HAART y algunos a largo plazo no progressors (Cuadro 4]. Además, estos pacientes inmunocompetentes como fueron juzgados por su capacidad para obtener las respuestas a una piscina de CMV, EBV y el virus de la gripe péptidos y / o PHA [29]. Un resumen del paciente del antígeno específico de las respuestas CD8 se da en la figura 1. Sorprendentemente, el porcentaje de pacientes que presentan las respuestas a las piscinas de prueba es mucho menor que la esperada, con un rango de 31% a 45%. No hubo diferencias significativas con el VIH-1 péptido piscinas entre infectados por VIH-1 grupos de pacientes (p <0,0001) (véase Figura 1A y archivo adicional 2].

Células T respuestas obtenidas de todos los VIH-1 ingenuo donantes a prueba con el VIH-1 específica CTL péptido piscinas

Los errores en la predicción de HLA I vinculante perfiles de epítopos pueden haber contribuido a las anteriores discrepancias entre experimental y espera respuestas. Sin embargo, la predicción de MHCI-péptido vinculante de por sí es bastante precisa y, en general, experimental HLA I vinculante puede ser confirmada por lo menos el 75% de HLA I predijo aglutinantes [30]. Así pues, si bien no descarta la posibilidad de que los errores en la predicción de epítopos de HLA I vinculante perfiles puedan existir, no pueden en cuenta por la gran divergencia entre el CTL espera respuestas y los observados experimentalmente. Más probable, deterioro funcional de CTL en crónicamente infectadas por VIH-1 pueden hacer que los pacientes CTLs incapaces de producir IFN γ [31, 32]. Además, las especificidades de las respuestas CTL cambiar durante la progresión de la enfermedad [33]. Los objetivos de CTL respuestas observadas en las personas durante el transcurso de cualquier infección viral están determinados por las modalidades sutiles immunodominance influido por muchos factores, entre ellos otras moléculas HLA y patógenos encuentros anteriores [34]. Para hacer frente a estas posibilidades, analizamos las respuestas por VIH-1 ingenuo de los individuos cebado PBMC de cada diez donantes a alta densidad de las células con el VIH-1 péptido-piscina pulsos autólogo de Langerhans-al igual que las células seguida de restimulation péptido con pulsos fresca PBMCs. Hemos probado el resultado VIH-1 piscina péptido específico de células T ELISPOT líneas de análisis. (Figura 1B] Todos los donantes generados IFN γ con una magnitud significativamente mayor (p <0.0001) que ELISPOT las respuestas generadas por el VIH-1-sujetos infectados.

Caracterización de las respuestas A0201 restringido en el VIH-1 ingenuo personas

A fin de evaluar las células T específicas de las respuestas, hemos elegido la más común subtipo HLA, A0201 para un análisis detallado. Ocho VIH-1 con péptidos A0201 restricción (Tabla 2] fueron pulsada individualmente en el PAT deficiente A0201 + T2 línea celular hibridoma para analizar péptido funcional vinculante. Un control positivo péptido derivado de los HTLV-TAX proteína [(aminoácidos 11-19. LLFGYPVYV)] se utilizó para normalizar péptido vinculante positivo (valor = 1). Un predijo A0301 restringido el VIH-1 péptido fue utilizado como control negativo (valor = 0). Cada VIH-1 se encontró péptido de obligar a A0201, como se indica por el aumento de superficie A0201 expresión en péptido-pulsado células T2 (Figura 2A]. Posteriormente, A0201 restringido el VIH-1 péptidos se combinaron en una piscina y se utilizaron para un A0201 principal donante, lo que resulta en la proliferación selectiva a la pandemia del VIH-1 péptido piscina en comparación con el control (Figura 2B]. Estas células producen IFN γ a la estimulación con el VIH-1-péptido pulsos el antígeno de células presentadoras (PBMCs) en los ensayos de ELISPOT (Figura 2C]. Después de tres rondas de estimulación, el 25% de las células en cultivo se CD8 + y 62% eran CD4 + (Figura 2D]. Dado que ~ 20-30% de MHCI vinculante péptidos se prevé que se unen a MHCII como así, este resultado no es inesperado (datos no presentados). También generó dos líneas celulares de control: la primera, un toxoide tetánico de células T específicas de acuerdo con el 78% CD4 + y CD8 + no células T suscitó toda la proteína de estimulación, y la segunda, un VEB de células T específicas de acuerdo con el 62% CD8 + y el 29% de células CD4 + provocados por la estimulación con un immunodominant VEB epítopo BMLF1 (GLCTLVAML). Linfocitos T CD8 + se ordenan de la pandemia del VIH-1 de células T específicas línea después de varios estímulos in vitro (Fig. 2E, en primer lugar la parcela) y sus especificidades péptido determinado por cada péptido-cargado DimerX tinción (Figura 2E]. Uno a nueve por ciento de los linfocitos T CD8 + específicas para cada uno de los seleccionados del VIH-1B péptidos (Figura 2F].

Actividad citotóxica de VIH-1 péptido específico de linfocitos T CD8 + derivadas de VIH-1 ingenuo donantes

A continuación, para poner a prueba el potencial para la actividad citolítica de la pandemia del VIH-1 péptido específico de líneas de células T, T2 hibridoma células fueron pulsados con A0201 restringido VIH-1B péptido piscinas y específicos lisis se determinó por la norma 51 Cr liberación de ensayo. Como se muestra en la Figura 3A, la pandemia del VIH-1 péptido específico de linfocitos T CD8 + muertos A0201 restringido el VIH-1 piscina péptido-pulsado con células T2 ~ 50% de lisis específica a un E: T ratio de 30:1. El mismo T2 células cargadas con HTLV-TAX péptido como un control negativo no se zadas. Para determinar si el VIH-1-péptido específico A0201 restringido CTL puede reconocer y lyse infectadas por VIH-1 células, infectadas por el hibridoma línea T1 (+ A0201, B5101 +, CD4 +) con el VIH-virus IIIB y, a continuación, determinar si el VIH-1 péptido específico A0201 restringido CTL puede reconocer el VIH-IIIB células infectadas T1 y matar a las células diana en un 51 Cr liberación de ensayo. VIH-1 T CD8 específicas de las células procedentes de dos donantes distintos A0201 reconocidos y mataron a 20-28% de los infectados por VIH-1 T1 células 2 y 3 días después de la infección en un E: T ratio de 30:1, mientras que las células no infectadas T1 no se zadas ( Figuras 3B y 3C]. También señaló que, si bien algunos de estos péptidos (por ejemplo, TLNAWYKVI) relacionados vincular a alelos, linfocitos T CD8 + estimulados desde el A0201 * donantes no específicamente lyse péptido-A0202 pulsátil, A0203 o A0204 objetivos (Figura 4]. De este modo, una determinada respuesta CTL es menos que degenerar unión a péptido MHC.

Como se muestra en la Figura 4, A0201 restringido por VIH-1 específica CTL demostrar alloreactivity y matar A0202, A0203 y A0204 transfectadas 721-221 objetivos en ausencia de VIH-1 péptido de carga. Por otra parte, en la presencia del VIH-1 péptidos, alloreactivity contra A0202, A0203 y A0204 transfectadas 721-221 objetivos disminución, como se muestra por la disminución de lisis. Estos resultados sugieren que A0201 restringido VIH-1 se unen a péptidos A0202, A0203 y A0204, en sustitución de posibles péptidos endógenos que median gran parte de la evidente alloreactivity. El análisis de la A0204 transfectant es un claro ejemplo de este fenómeno.

Conclusión

El presente informe apoya la idea de que las respuestas de células T en pacientes con VIH se vean afectados y aboga por la optimización de la composición de epítopo vacunas basadas en la utilización de datos obtenidos a partir de ingenuos individuos. Sin embargo, las respuestas presentes en infectadas por VIH-1 temas y la capacidad de crecer péptido específico de células T CD8 de ingenuos individuos no son directamente comparables. Más trabajo experimental deberá incluir el análisis de las respuestas de células T ingenuas y en infectadas por VIH-1 en pacientes que utilizan vitro estimulado las células T CD8 y el VIH-epítopos CTL específicos. Tal vez este enfoque dilucidar si clonal supresión o anergia existe, por ejemplo.

En general, estos hallazgos demuestran que el normal, el VIH-1 ingenuos individuos poseen las células T capaces de reconocer y ampliar los segmentos conservados en contra de la pandemia del VIH-1 proteoma. Aunque sólo una minoría de crónicamente infectadas por VIH-1 los pacientes responde a esos grupos de epítopos, las respuestas de protección viral pueden suscitó normal de todos los temas examinados. De este modo, la ausencia de respuesta por VIH-1 en pacientes infectados no es una consecuencia intrínseca de los agujeros en las células T humanas repertorio, sino más bien las secuelas de la exposición crónica a los antígenos, immunodominance patrones y / o disfunción celular. En este sentido, la capacidad del VIH-1 para conducir las respuestas celulares fuera de la pertinente, invariante segmentos capaces de ofrecer protección hacia mutable epítopos CTL que escapan a base de la destrucción es una reminiscencia de la lucha contra el VIH-1 respuesta de anticuerpos en pacientes con infección crónica [4 ]. En este último, los anticuerpos se dirigen a la variable de los bucles por VIH-1 sobre la proteína gp160 en lugar de invariante posibles sitios de neutralización. De este modo, los mecanismos de escape viral enviar tanto las células T y células B frente a las direcciones improductivas. Humanos que las respuestas de células T puede ser obtenido a partir de virus a las personas ingenuo conserva los segmentos de la pandemia del VIH-1 proteoma sostiene que CTL-dirigido vacunas podrán fijar estos epítopes, y pone de relieve la importancia de evaluar la respuesta inmune normal de las personas, así como el VIH-1 los pacientes infectados. Más allá de VIH-1, immunoprotection contra otras enfermedades infecciosas crónicas como la malaria, así como los trastornos neoplásicos pueden beneficiarse de un cambio de paradigma en diseño de vacunas, centrado en el potencial en la respuesta inmune normal y no en poblaciones de pacientes.

Lista de abreviaturas utilizadas

SIDA, síndrome de inmunodeficiencia adquirida; ACB, junto frecuencia fenotípica; CTL, los linfocitos T citotóxicos; TARGA terapia antirretroviral de gran actividad; VIH-1, el virus de inmunodeficiencia humana-1; PPC, la población cobertura de la protección; SIV, el virus de inmunodeficiencia símico

Conflicto de intereses

Los autores declaran que no tienen intereses en conflicto.

Autores de las contribuciones

PAR: Contribuyó al diseño del estudio, llevado a cabo todos los análisis bioinformático y produjo el manuscrito

DBK: Contribuciones para el diseño experimental del trabajo, llevado a cabo todos los experimentos inmunología y ayudó con el papel escrito.

REH: Establecido el único alelo HLA I 721221 transfectant las líneas celulares utilizadas en este estudio con la ayuda del PAR.

PA: Asistida viven con la infección por el VIH estudios

Dirección General: Contribuir a la elaboración de infectados por el VIH / autólogo de células-CTL análisis

ELR: Diseñado y supervisó el estudio y contribuyó al manuscrito.

Material complementario
Archivo Adicional 1
VIH-1, donde el consenso proteoma variable residuos están enmascarados con la extensión "." Símbolo
2 ficheros adicionales
Estadísticas del péptido en las respuestas a ELISPOT de ensayo para los tres subgrupos
Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado por el NIH AI43649 subvenciones y AI57330 a ELR. Los autores reconocen la Inmunología Core en la Facultad de Medicina de Harvard Centro de Investigación para el SIDA para llevar a cabo el IFN γ ensayos sobre el VIH-1 + temas. Damos las gracias al Dr HaeSook Kim de asistencia con el análisis estadístico. Apreciamos comentarios y sugerencias de los Dres. Marcus Altfeld, Christian Brander y Bruce Walker en el Massachusetts General Hospital y el doctor Philip Chandler en el Colegio Médico de Georgia.