Journal of Occupational Medicine and Toxicology (London, England), 2006; 1: 12-12 (más artículos en esta revista)

Análisis de secreciones las vías respiratorias en un modelo de dióxido de azufre inducida por la enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC)

BioMed Central
Ulrich Wagner (ulrich.wagner @ Klinik-loewenstein.de) [1], Petra Staats (staats@med.uni-marburg.de) [1], Hans-Christoph Fehmann (wagnerul@mailer.uni-marburg.de) [ 1], Axel Fischer (axel.fischer @ charite.de) [3], Tobias Welte (welte.tobias @ MH-hannover.de) [4], David Un Groneberg (david.groneberg @ charite.de) [4]
[1] Departamento de Medicina Pulmonar y Cuidados Críticos División, Philipps-University, Baldingerstr., D-35043 Marburg, Alemania
[2] Departamento de Medicina / Medicina Respiratoria, Klinik Löwenstein, Geißhölzle 62, D-74245 Löwenstein, Alemania
[3] alérgicos Charité-Centro, Otto-Heubner-Centro, Neumología e Inmunología, Charité - Universitätsmedizin Berlin, libre y de la Universidad Humboldt de Berlín, Augustenburger Platz 1 O-1, D-13353 Berlín, Alemania
[4] Departamento de Medicina Respiratoria, la Escuela de Medicina de Hannover, Carl-Neuberg-Str. 1 OE 6870, D-30625 Hannover, Alemania
[5] Instituto de Medicina Ocupacional, Charité - Universitätsmedizin Berlin, libre y de la Universidad Humboldt de Berlín, Ostpreussendamm 111, D-12207 Berlín, Alemania

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Resumen

Hipersecreción crónica y flema son los principales síntomas de la enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), pero los modelos animales de la EPOC se define con una hipersecreción funcional no se han establecido hasta la fecha. Para identificar un modelo animal de la combinación de signos morfológicos de inflamación de las vías respiratorias y funcional hipersecreción, las ratas fueron continuamente expuestos a diferentes niveles de dióxido de azufre (SO2, 5 ppm, 10 ppm, 20 ppm, 40 ppm, 80 ppm) por 3 (a corto plazo ) O 20-25 (largo plazo) días. La histología reveló un incremento dosis-dependiente en la formación de edema y la infiltración de células inflamatorias en el corto plazo-los animales expuestos. El edema submucoso fue sustituido después por fibrosis a largo plazo de la exposición. La actividad secretora basal fue sólo aumentó significativamente en el grupo de 20 ppm. Asimismo, estimuló la secreción aumentó significativamente sólo después de la exposición a 20 ppm. BrdU-ensayos y AgNORs-análisis demostró metaplasia celular y la hipertrofia glandular y no como la hiperplasia subyacente correlación morfológica de la hipersecreción.

En resumen, SO2-exposición puede llevar a remodelación de las vías respiratorias características y los cambios en la secreción de moco en las ratas. Puesto que sólo a largo plazo la exposición a 20 ppm conduce a una combinación hipersecreción de las vías respiratorias y la inflamación, sólo este modo de exposición debe utilizarse para imitar humanos EPOC. Las concentraciones menores o superior a 20 ppm o la exposición a corto plazo no inducir el síntoma respiratorio de hipersecreción. El presente modelo puede ser utilizado para caracterizar los efectos de nuevos compuestos en la secreción de moco en el fondo experimental de la EPOC.

Introducción

La enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC) es una crónica de las vías respiratorias enfermedad inflamatoria que se caracteriza por la hipersecreción, la tos y la afluencia de células inflamatorias [1, 2]. La EPOC es actualmente estimado para convertirse en la 3 ª causa más común de muerte en 2020 [3]. La clínica y características morfológicas de la enfermedad están mediadas por humoral [4] y / o mediadores neuronales [5, 6] y la pantalla de protección de primera línea contra las respuestas irritantes inhalados. Sin embargo, dentro de la exposición crónica a sustancias nocivas como el humo del tabaco, el polvo urbano, profesional o factores [7 - 9], los mecanismos de protección inicialmente conducir a un estado de la producción de flema crónica [10], inflamación de las vías respiratorias, tos y, limitar significativamente el calidad de vida [11]. En estas condiciones, opciones terapéuticas como la eficacia de los fármacos administrados tópicamente convertirse influido negativamente pharmacotransporters respiratorias y puede ser influenciado negativamente [12 - 15].

Junto al humo de tabaco de exposición, ya sea activa o pasiva, una serie de otros factores ambientales pueden estar asociados al desarrollo de la EPOC [16]. Dióxido de azufre pertenece a estos factores y su asociación con enfermedades de las vías respiratorias han sido investigados desde el smogs Londres [17], lo que se sabe que uno de los primeros caracteriza dramático del medio ambiente urbano exposición a contaminantes del aire [18].

La OMS definición de la EPOC sólo se basa en criterios clínicos. Por otra parte, hay algunos métodos morfológicos como el índice de Reid para definir características histológicas de la enfermedad [19]. Sin embargo, parámetros funcionales, como por ejemplo la descripción de las vías respiratorias alérgicas obstructiva enfermedades alérgicas como asma bronquial [20], no existen. A este respecto, en llamativo contraste con los numerosos enfoques experimentales para determinar la inflamación en las vías respiratorias enfermedad [21, 22], los modelos para caracterizar la actividad secretora de la vía aérea en las condiciones de inflamación crónica de las vías respiratorias no se han establecido hasta la fecha. Con respecto a una situación de falta de estrategias válidas para la hipersecreción de terapia hay una necesidad urgente de nuevos modelos establecidos para probar las nuevas opciones terapéuticas [23, 24].

Junto a Pyrrhocorax pyrrhocorax crónica, que sólo ha sido abordado recientemente en mayor detalle en los esfuerzos internacionales de investigación [25 - 36], también la secreción de moco pertenece a los pocos síntomas respiratorios con muy limitadas opciones terapéuticas. Una variedad de enfoques morfológicos para caracterizar la secreción de moco en las vías respiratorias se han desarrollado en los últimos años [37]. Con la primera identificación de mucina proteínas moleculares como la columna vertebral de las vías respiratorias moco [38], los estudios morfológicos fueron capaces de determinar la expresión de mucina en las células respiratorias de la parte superior [39] y las vías respiratorias inferiores [40 - 42]. Por otra parte, la patogénesis de la mucosa de células de metaplasia se evaluó en un modelo murino de asma usando morfometría [43]. Sin embargo, estos métodos pueden ser utilizados de manera eficiente para determinar la calidad de la mucosidad secretada, pero no exactamente para evaluar la actividad secretora basal o en virtud de patología inflamatoria crónica que puede encontrar en asma o EPOC. Por lo tanto, un ensayo se establezcan las necesidades que abarca un modelo de la EPOC se define con un hypersecretory estado de las vías respiratorias. El presente estudio tuvo como objetivo abordar este objetivo mediante la combinación de un modelo animal de dióxido de azufre inducida por lesiones pulmonares con la evaluación de las vías respiratorias secreción basal de la secreción estimulada y análisis. Diferentes concentraciones de SO2 se utiliza para identificar un modelo que incluye tanto la hipersecreción, tal como se define por elevación de la secreción basal y la secreción estimulada y cambios morfológicos similares a los encontrados en humanos EPOC. El uso de este enfoque el primer modelo que muestra una clara asociación entre hipersecreción como el prominente síntoma clínico de la EPOC y el pathomorphological características de la enfermedad debe ser establecido.

Métodos
Animales

En total, 96 libre de agentes patógenos macho Sprague-Dawley, las ratas (Institut für Versuchstierzucht, Hannover, Alemania), con un peso de 350-400 g fueron utilizados. Los animales fueron alojados en condiciones normales de condiciones de laboratorio y alimentadas ad libitum, de conformidad con las normas de la ley sobre bienestar animal y el comité local de animales.

La exposición

Para la exposición al SO2, 4 animales fueron trasladados a un plexi-glas cámara con un volumen de 57,2 litros. Luego, continua la exposición de más de 24 h de SO2 se inició en una dilución controlada de aire y SO2 de un depósito que contiene SO2 en una concentración de 1000 mg/m3 utilizando dos medidores de flujo. 12 litros / min de la resultante de SO2 diferentes mezclas de aire-se dirigió entonces a través del vidrio plexi cámara utilizando un tercer medidor de flujo. Un ventilador en el interior de la cámara siempre constante movimiento del aire y la atmósfera se midió utilizando un higrómetro, termómetro y barómetro. Las concentraciones de SO2 se midieron en línea (ECS 102-1, MPSensor Symytems GmbH, Munich, Alemania). Control de grupos fueron expuestos en un plexi de vidrio similar a la cámara de aire fresco 12 litros / min en lugar de SO2 utilizando las mismas condiciones y la medición de la concentración de SO2.

Diseño experimental

El transcurso del tiempo y la relación dosis-de los posibles cambios en la actividad secretora se evaluó. Por lo tanto, diferentes dosis de tiempo y horarios se utilizaron: a corto plazo (3 d) y largo plazo (20 - 25 d) los períodos de exposición permanente al SO2 fueron elegidos para determinar la secreción a corto y largo plazo la exposición (Figura 1].

Por otra parte, diferentes dosis de SO2 se examinaron y 6 grupos de cada período se evaluaron: 5 ppm, 10 ppm, 20 ppm, 40 ppm, 80 ppm y el control (n = 4 en cada experimento).

Al final de ese período de tiempo las vías respiratorias han sido recogidos por la medición directa de la actividad secretora. Además, los tejidos se fija la perfusión tisular para estudiar la remodelación de la histología.

Medición de la actividad secretora

Las vías respiratorias actividad secretora se midió como se describe en los estudios publicados previamente [44 - 47]. En breve, un collar incisión línea media y la mediana de esternotomía se realizaron y la tracheas fueron extirpados y se trasladará inmediatamente a 4 ° C frío M199 medio de cultivo (Serva, Heidelberg, Alemania). Tejido conectivo y se eliminó la tracheas se abrieron a través de un paries membranaceus incisión. La tráquea preparativos fueron montados en las cámaras para obtener una mucosa y submucosa, a los cuales 7 ml de la M-199 en medio Earl's equilibrada solución de sal (con carbogen equilibrado a 37 ° C, pH 7.4) se añadió. Luego, el 50 μ Ci de Na 2 35 SO 4 se colocó en la submucosa parte de la preparación y que se les permita equilibrar. La solución luminal se recogieron cada 15 min y se sustituirá por medio fresco sin etiqueta. Después de la actividad basal se midió, estimuló la secreción se evaluó a través de la acetilcolina. A luminal estimulación con 1 mmol / l se realizó.

La recogida sondas fueron almacenadas en diálisis de celulosa tubings (cut-off masa 12000-14000 masa molecular) y dializados contra agua destilada que contenga etiqueta SO 4 para sustituir a no incorporarse Na 2 35 SO 4. Para evitar la degradación bacteriana, azida sódica se añade a una concentración de 10 mg / dl. Los niveles de radiactividad fueron medidos en un líquido scintillation contrarrestar con los condes de la etiqueta macromoléculas, que anteriormente se caracteriza, que representaba el índice de actividad secretora de moco [48 - 50].

Histología

Histología se llevó a cabo en fijado en formol e pulmón muestra. 5 μ m se cortaron secciones de parafina de los tejidos incrustados y montados en portaobjetos de vidrio. Histología de rutina se llevan a cabo tal y como se describe anteriormente [51] con hematoxilina-eosina, Alcian Blue y el periódico-Acid-Schiff (PAS) de reacción.

Proliferativa actividad glandular y de superficie de las células epiteliales
El análisis de los datos

El secretora basal y estimulado la actividad se mide como los cargos por minuto (cpm). Los datos se presentan como ± SD El análisis estadístico se realizó mediante la prueba de ANOVA de Friedman y el Wilcoxon Mann-Whitney U-test.

Resultados
Actividad secretora

Para determinar la actividad secretora en la bronquitis y experimentales para identificar un modelo con la proximidad a las condiciones humanas en relación con hipersecreción y cambios morfológicos, los animales fueron expuestos a cinco diferentes concentraciones de SO2 y se encontraron diferencias significativas entre la exposición y los grupos de control.

A corto plazo la exposición a SO2
La exposición prolongada a SO2
La remodelación de las vías respiratorias

Para correlacionar la hipersecreción según la evaluación basal de la acetilcolina y estimulada actividad secretora a los cambios en la estructura de las vías respiratorias, a fin de determinar un modelo que exhibe ambas características morfológicas típicas de la EPOC y la clínica característica predominante de la enfermedad, hipersecreción, las vías respiratorias de los 12 grupos fueron examinados para la remodelación de las vías respiratorias y se encontraron diferencias.

Proliferativa actividad glandular y de superficie de las células epiteliales

Para caracterizar la actividad proliferativa de glándulas y células epiteliales superficiales, uno en vivo BrdU-ensayo fue realizado. Sin embargo, en contraste con la actividad proliferativa de los órganos de control (esófago), no significativo para la tinción de BrdU se encontró de estructuras glandulares y de superficie del epitelio y la tinción positiva sólo se encuentran de vez en cuando (Figura 7].

Por otra parte, AgNORs-Se realizó un análisis (Figura 7]. En este caso, diferencias significativas entre los grupos se encontraron en el largo plazo-los animales expuestos. En las glándulas, las únicas diferencias significativas estuvieron presentes entre los 20 ppm grupo y el grupo control (p <0,05). En el área de la superficie, epitelio, todos los grupos difieren significativamente de unos a otros. Es decir, un índice de 1,8 ± 0,1 se encontró para el control de los animales y el 3,9 ± 0,3 (p <0,05). Por ductal células epiteliales, Sólo se encuentran diferencias significativas entre el control y el 10 y 10 ppm y 20 ppm (p <0,05).

Discusión

Las vías respiratorias protege la mucosidad de las vías respiratorias contra sustancias nocivas und condiciones fisiológicas [54, 55]. Sin embargo, bajo condiciones patológicas como la enfermedad pulmonar obstructiva crónica, la hipersecreción puede influir negativamente en la calidad de vida y pertenece a las principales características de la enfermedad [56].

En contraste con el gran número de modelos animales y técnicas para evaluar los mecanismos fisiopatológicos que ocurren en pacientes con asma bronquial alérgica [43], sólo unos pocos modelos animales de la EPOC se han establecido hasta la fecha. Estos modelos utilizan la exposición al humo de tabaco, ya sea [57], el dióxido de nitrógeno [58] o dióxido de azufre [59] y producir todos los elementos que imitan la EPOC morfológicamente con cambios inflamatorios y variable de enfisema. La importancia clínica de la hipersecreción, que es una piedra angular de la EPOC, no se ha evaluado directamente en modelos animales hasta ahora y nuestro observaciones iniciales nos llevaron a concluir que los parámetros del proceso y los períodos de exposición podría afectar dramáticamente la producción de moco en estos modelos. Por lo tanto, hipersecreción puede no ser un elemento integrador de los modelos descritos anteriormente de la EPOC y por lo tanto, la integridad de estos modelos como un enfoque humano a imitar la EPOC pueden ponerse en duda. Para desentrañar estas cuestiones, el presente estudio tuvo como objetivo establecer un modelo de la EPOC que no sólo se muestran los cambios morfológicos, sino también una hipersecreción funcional que puede encontrar en los pacientes con la enfermedad. Un ensayo deben ser identificados, que permite la evaluación de la actividad secretora en condiciones experimentales de la EPOC.

Para evaluar funcionalmente las vías respiratorias actividad secretora, establecido con anterioridad se aplicaron técnicas que permiten medir tanto la basal y la metacolina-traqueal secreción estimulada [44 - 46, 48 - 50].

Como la exposición a dióxido de azufre ha sido previamente informado para dar lugar a una forma experimental de la EPOC [59], el presente estudio tuvo como objetivo identificar un modo de SO2 exposición que abarca no sólo los rasgos morfológicos de la EPOC, sino también un estado de hipersecreción y, por tanto, permite para estudiar los efectos de posibles nuevos modulación de la secreción de compuestos en el fondo de las vías respiratorias y la inflamación hipersecreción en el futuro. Cinco diferentes concentraciones de SO2 se han utilizado en dos períodos. Histopatología de rutina reveló signos de bronquitis con el aumento de las concentraciones. En el largo plazo los grupos de la exposición, los signos de remodelación de las vías respiratorias fibrótica se encontraron. Cambios similares también han sido reportados en otros estudios como el SO2 utilizando compuestos nocivos para evocar la bronquitis experimental [59]. El objetivo es correlacionar los cambios morfológicos en las ratas a las vías respiratorias y la hipersecreción de encontrar un protocolo de exposición que garantiza que ambos rasgos característicos de la bronquitis y la hipersecreción están presentes y pueden ser evaluados.

Basales y la acetilcolina estimulada secretora se evaluaron las actividades para proporcionar dos resultados de la secreción de moco. Hipersecreción no se ha encontrado en todos los modos de SO2 exposición incluso en la presencia de signos morfológicos de la bronquitis, lo que indica que ya se ha informado protocolos y modelos pueden carecer de una hipersecreción funcional y, por tanto, estar sesgados por no mostrar una característica clave de la EPOC. En este sentido, el análisis morfológico de los tres días de exposición grupos demostrado que los cambios en la estructura de las vías respiratorias pared se puede encontrar después de este breve período de exposición con los tejidos que presenten signos de edema agudo, pérdida de la integridad ciliar y la afluencia de células inflamatorias con concentraciones crecientes de SO2. Sin embargo, basal y estimulado la actividad secretora no reveló ningún signo de hipersecreción y en su lugar, en el grupo de 40 y 80 ppm de exposición, las tendencias de la disminución en la secreción se han encontrado, lo que indica que a corto plazo la exposición a una serie de 5 a 80 ppm de SO 2 no puede llevar a un adecuado modelo de la bronquitis que englobe tanto hypersecretory inflamatoria y los cambios.

En los grupos que fueron expuestos a SO2 para 25 (20) días, un aumento altamente significativo estuvo presente en el estado basal secretora de las 20 ppm grupo con 309,1 cpm ± 36,9 vs 99,5 ± 27,1 cpm en el grupo control, y también el estimuló la secreción fue elevada en este grupo. Estos cambios funcionales son concomitantes con cambios morfológicos remodelación de las vías respiratorias y la inflamación crónica incluyendo la fibrosis. En cambio, las mayores concentraciones no parece aumentar la basal o la secreción estimulada y más significativamente las concentraciones superiores a 80 ppm no son tolerados por los animales.

Para caracterizar la actividad proliferativa de glándulas y células epiteliales superficiales, in vivo y ensayos de BrdU AgNORs-análisis se realizaron. Sin embargo, en contraste con la actividad proliferativa de los órganos de control (esófago), no significativo para la tinción de BrdU se encontró de estructuras glandulares y de superficie del epitelio. Como BrdU es un nucleósido análogo que se incorpora en el lugar de la timidina cuando las células dividen [60], la ausencia de importantes BrdU manchas indica que el observado hipersecreción no se debe a un aumento de la actividad replicativa cromosómicas de las células glandulares. Por lo tanto, un AgNORs-Se realizó un análisis que está relacionado con la actividad transcripcional rRNA y biosíntesis de proteínas celulares [53] y se encontró una diferencia significativa entre el grupo de 20 ppm y el grupo control, pero no de mayor o menor concentración.

Los dramáticos cambios morfológicos especialmente de los epitelio superficial sin actividad mitótica significativa y sin notable BRDU incorporación sugiere que una metaplasia, con la consiguiente hipertrofia de las glándulas aparato en lugar de como la hiperplasia subyacente correlación morfológica de la hipersecreción. Estos resultados demuestran que la exposición de Sprague-Dawley, las ratas más de 25 días para una concentración de 20 ppm de SO2 conduce a un modelo experimental de la EPOC con moco y metaplasia de células glandulares hipertrofia, que abarca tanto las características clínicas y morfológicas características de la enfermedad. La posibilidad de evaluar funcionalmente la actividad secretora en determinadas condiciones experimentales ofrece la oportunidad de estudiar los efectos de posibles nuevos compuestos en la secreción de las vías respiratorias en la EPOC. Por otra parte, los efectos de los mediadores de la inflamación incluyendo especies reactivas del oxígeno [61] o neuromediators [62, 63] y los mecanismos de transporte de drogas [64, 65] se puede evaluar en un entorno de producción de flema y la bronquitis.

Como se ha demostrado que la erradicación de células inflamatorias no conduce automáticamente a una mejora de los síntomas clínicos en las enfermedades de las vías respiratorias como el asma alérgica [66], otras características de las enfermedades de las vías respiratorias como tos, hipersecreción o se centra actualmente como base para nuevas opciones terapéuticas para mejorar la calidad de vida. A la luz de estas nuevas estrategias [67], modelos para evaluar la tos y la hipersecreción son necesarios [68]. Por lo tanto, actualmente el modelo determinado de 25 días de exposición con 20 ppm de SO 2 puede encontrar una amplia aplicación. Sin embargo, el SO2 es un gas relativamente nocivos y su toxicidad puede limitar, por tanto, un uso generalizado [69]. Actualmente, hay una serie de otros modelos disponibles EPOC [24]. Estos incluyen la exposición al humo de tabaco y futuros estudios sobre el estado secretora en diferentes protocolos de humo de tabaco de concentración y tiempo de exposición puede ofrecer una alternativa al protocolo establecido actualmente.

En conclusión, el presente estudio se evaluó la influencia de cinco diferentes concentraciones de SO2 en dos períodos de exposición. Parte de la que actualmente utilizan las concentraciones que son mucho más elevados que los valores umbral internacional no se ha traducido en ningún cambio. Entre las diferentes concentraciones se constató que sólo un 25 días duradera período de exposición a 20 ppm de SO2 conduce a un modelo experimental de la EPOC que no sólo muestran signos morfológicos de la enfermedad, sino también la predominante clínica de la hipersecreción de moco. El modelo puede utilizarse en el futuro para determinar el papel de mediadores y los efectos de los nuevos compuestos en aerosol en la secreción de las vías respiratorias en el fondo de la EPOC.

Autores de las contribuciones

UW, PS, AF, HCF, TW y DAG han participado en el diseño y la realización del estudio. También han participado en la redacción del artículo o revisar críticamente importante para el contenido intelectual. Todos ellos han dado su aprobación del estudio que se publicará

Declaración de intereses

Los autores declaran que no tienen intereses en conflicto.

Agradecimientos

Nos gustaría dar las gracias al Dr E. Oplesch por su valiosa asistencia y D. Quarcoo útil para los debates. Este estudio fue apoyado por becas de la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, WA 844/3-2, SFB 587 B13, GR 2014/2-1) y Deutsche Atemwegsliga (DG2003).