Diagnostic Pathology, 2006; 1: 17-17 (más artículos en esta revista)

Virus de Epstein-Barr (VEB) y detección por PCR a escribir: una contribución al diagnóstico de detección de VEB-positivo linfoma de Burkitt

BioMed Central
Rocío Hassan (biomol@inca.gov.br) [1], Lídia Roxana Blanco (biomol@inca.gov.br) [1], Claudio Gustavo Stefanoff (biomol@inca.gov.br) [1], Deilson de Elgui Oliveira (elgui@fmb.unesp.br) [2], Fabricio E Felisbino (biomol@inca.gov.br) [1], Claudete Esteves Klumb (cklumb@easyline.com.br) [3], Carlos Bacchi E ( cebacchi@fmb.unesp.br) [2], Héctor N Seuánez (hseuanez@inca.gov.br) [4], Ilana R Zalcberg (zalcberg@inca.gov.br) [1]
[1] piso, de Río de Janeiro, RJ, Brasil
[2] Departamento de Patología, Botucatu School of Medicine, Universidade Estadual Paulista, São Paulo, SP, Brasil
[3] Servicio de Hematología, Instituto Nacional de Câncer (INCA), Praça Cruz Vermelha 23, 20230-130, Rio de Janeiro, RJ, Brasil
[4] piso, 20231-050, Rio de Janeiro, RJ, Brasil

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Resumen
Fondo

Virus de Epstein-Barr (VEB) se asocia a la etio-patogenia de un número cada vez mayor de tumores. La detección de VEB en muestras de patología es pertinente desde su alta prevalencia en algunos tipos de cáncer hace que el virus de un prometedor objetivo de las terapias específicas. ARN hibridación in situ (Rish) es el estándar de procedimiento de diagnóstico, mientras que la reacción en cadena de polimerasa (PCR) basada en métodos se utilizan para la cepa (VEB tipo-1 o 2) la distinción. Se realizó una comparación sistemática entre Rish y PCR para la detección de VEB, en un grupo de la infancia de células B no Hodgkin linfomas (LNH), con el objetivo de validar la PCR como un primer método rápido para el diagnóstico de VEB-asociado de células B NHL .

Métodos

La infección por VEB se ha investigado en formol fija parafina embebido en muestras tumorales de 41 niños con células B NHL, de los cuales 35 linfoma de Burkitt (BL), de Río de Janeiro, Brasil, por hibridación in situ de EBV-encoded RNA pequeños (Eber-Rish ) Y los ensayos de PCR basada en la amplificación EBNA2.

Resultados

Genomas EBV se detectaron en el 68% de todos los NHL. Tipo 1 y 2 representan el 80% y el 20% de la infección por VEB, respectivamente. Rish y PCR fueron muy concordantes (95%), así como de un solo y anidadas-PCR, que permite el uso de una sola ronda de PCR para el diagnóstico. Ensayos de PCR mostró una sensibilidad y especificidad del 96% y 100%, respectivamente, con un nivel de detección de 1 en el genoma EBV 5000-10000 EBV negativos células, con exclusión de la posibilidad de detectar bajo número de VEB-con las células de memoria.

Conclusión

Se describen las condiciones adecuadas de PCR con similar sensibilidad y fiabilidad para Rish, que se utilizará para el cribado diagnóstico VEB en alto grado B-NHL, en "en situación de riesgo" regiones geográficas.

Fondo

Epstein-Barr (VEB) es un herpesvirus humano generalizado principalmente de células B trópico, pero capaz de infectar células T y células epiteliales [1, 2]. La exposición inicial a VEB usualmente ocurre en la primera década de vida que producen persistente, infección latente asintomática. VEB infecta a más del 90% de la población sana y se mantiene a un bajo número de copias (1-50 × 10 -6 células) en memoria de células B [3, 4].

EBV se ha asociado a la etio-patogenia de un número creciente de cánceres [1, 2, 5, 6]. En los países en desarrollo, la prevalencia del VEB puede alcanzar el 80% en algunos tumores, por lo tanto, la explotación de VEB asociación con fines clínicos y terapéuticos de las intervenciones de interés [7 - 10].

Métodos específicos sensibles para detectar la infección por VEB se basan en la hibridación in situ (ISH), Southern Blot y PCR [11, 12]. ARN-ISH (Rish) para la detección de EBERs (VEB transcripciones altamente expresado en células infectadas latente) es el procedimiento estándar para VEB diagnóstico que permita la identificación y distinción de tipos de células infectadas [13, 14]. PCR basado en métodos se utilizan para determinar la cepa (tipo-1 o 2). Sin embargo, cuando sea estrictamente normalizada, PCR pueden tener un papel importante en el diagnóstico y el VEB en gestión de alto grado linfoma no Hodgkin (NHL), aunque las comparaciones sistemáticas entre Rish y PCR enfoques son escasos.

Se presenta una comparación entre Rish y un método de PCR para la detección del genotipo y la infección por VEB en 41 niños con células B NHL. También describe las condiciones de PCR resultantes similares en sensibilidad y fiabilidad para Rish, para validar la PCR como un primer método de diagnóstico rápido, seguido por Rish para el diagnóstico de VEB-asociados NHL.

Métodos
Pacientes y muestras clínicas

Cuarenta y cuatro niños (1-15 años), con diagnóstico de LNH en el Instituto Nacional de Câncer (INCA), Río de Janeiro, Brasil, se estudiaron. El Comité de Ética de Inca aprobó este estudio.

La muestra incluyó 38 Burkitt's lymphomas/L3-ALL (BL), 2 Burkitt's-como los linfomas (BLL) y 4 difuso de células B grandes linfomas (DLBCL). Diagnóstico histopatológico fue revisado de acuerdo a la clasificación REAL [15]. En 41 casos, embebido en parafina del tejido tumoral (PET) se dispone de muestras para Rish / PCR comparaciones. En 16 casos, PET y fresco muestras tumorales fueron comparados. En 9 casos, la médula ósea (MO), las células mononucleares y masa tumoral se estudiaron muestras de manera simultánea. BM infiltración se evaluó mediante parámetros morfológicos y moleculares procedimientos.

Treinta de sangre periférica (PB) muestras de donantes sanos y 26 ganglios linfáticos reactivos de VIH-negativos pacientes sin historia previa de cáncer, se refiere al laboratorio para la detección de clonalidad, se utilizaron como controles.

Eber-1 RNA hibridación in situ

EBV se diagnosticó la infección por Rish riboprobes utilizando para EBER1 tal y como se describe [16, 17]. PET secciones se deparaffinized, rehidratada, digeridos con proteinasa K, y hibridizada la noche a la mañana en una concentración de 0,25 ng / μ l con biotina de la sonda. La detección se llevó a cabo con un streptavidina-fosfatasa alcalina conjugada. Las diapositivas se counterstained con verde de metilo y montados con resina. Un caso de VEB-positivo linfoma de Burkitt se utilizó como control positivo; células que expresan EBER1 mostró manchas oscuras nuclear. El análisis se realizó a ciegas respecto a los ensayos de PCR.

Amplificaciones PCR

De alto peso molecular (HMW) ADN se obtuvo por métodos convencionales [18]. PET-Se extrajo el ADN siguientes medidas estrictas para evitar la contaminación cruzada. Adecuación de ADN para amplificaciones de PCR se evaluó en individuales y reacciones multiplex para amplificar cuatro genes constitutivos, tal como se describe [19].

VEB genotipificación se realizó por PCR anidada-[20]. La primera reacción de PCR amplifica una región de EBNA2 seguido por dos reacciones de amplificación anidada distintivo regiones (Tabla 1]. Single-PCR con dos ensayos de tipo-1 y -2, primers específicos se realizaron. DNA fue amplificado a 50 μ l reacciones que contengan 1,5 mM MgCl 2, gelatina 0,001%, 0,3 μ M de cada cebador, de 1U de Taq polimerasa de ADN Platinum (Invitrogen) y, alternativamente, o bien 500 ng de DNA HMW, 5 μ l de lisado o 1 μ l de la primera reacción de PCR-anidado. Ciclismo condiciones: Primera reacción: 94 ° C 2 min, 35 ciclos de 94 ° C 1 min, 52 ° C 90 seg, 72 ° C 4 min, seguido de 72 ° C durante 10 min. Anidados de reacción: 94 ° C, 2 min, 35 ciclos de 94 ° C 30 seg, 52 ° C 1 min, 72 ° C 2 min, seguido de 72 ° C durante 10 min.

Reproducibilidad se evaluó a través de un ciego prueba PCR con dos extractos de ADN obtenido a partir de cada una de 15 diferentes muestras de PET. También en comparación HMW-ADN y el PET de ADN amplificados de 9 pacientes. El EBV negativos Ramos y el VEB-positivo y Raji BC1 líneas celulares se utilizaron como controles positivos y negativos de tipo-1 y tipo-2 ensayos de PCR, respectivamente. Reacciones de PCR se realizaron al menos dos veces, en un PTC-100TM (MJ Research. Inc, Watertown, MA) termociclador.

La sensibilidad se realizaron ensayos con extractos de ADN secuencial, de 10 diluciones de Namalwa células, con dos genomas EBV integrado por célula [21] en un VEB-negativo de antecedentes.

Para probar la posibilidad de amplificación de VEB en muestras morfológicas o que carecen de pruebas moleculares de malignidad, BM aspirados y muestras tumorales de los mismos pacientes fueron comparados en 9 casos. La presencia de inmunoglobulina clonal (CIB) reordenamientos se investigó utilizando primers consenso (FR3-JH y FR2-JH) [19]. Una vez identificadas en la masa tumoral, clonal marcadores fueron investigados en BM para detectar la infiltración a nivel molecular.

Resultados
Rish detección y comparaciones con los ensayos de PCR

La infección se detectó en 28 de 41 de los pacientes (68%). En la primera serie de ensayos de forma paralela, EBV fue detectado por Rish en 27/41 casos y por PCR en 28/41 casos. Resultados discordantes fueron un RISH-positive/PCR-negative y dos RISH-negative/PCR-positive (7%). Cuando los dos ensayos se repitieron en diferentes muestras de la misma masa tumoral, la RISH-positive/PCR-negative ha sido confirmado, mientras que uno RISH-negative/PCR-positive ha demostrado ser RISH-positive/PCR positivo y el otro, Rish - negativa / PCR-negativos. Teniendo en cuenta Rish como el estándar de prueba para la detección de VEB, Rish dado lugar a un falso negativo caso (sensibilidad 96%), mientras que la PCR producido un resultado falso negativo, lo que corresponde al 96% de sensibilidad, especificidad 100%, 100% valor predictivo positivo y 93% valor predictivo negativo.

Detección molecular

Amplificaciones de los genes constitutivos de PET de ADN tuvieron éxito en 38/41 muestras (93%). Única y anidadas-ensayos de PCR para amplificar el gen EBNA2 se realizaron en todas las muestras (fig 1]. La infección se detectó en 28 de 41 (68%) casos. Análisis de VEB amplificaciones en el PET-muestras de ADN demostró PCR-positive/RISH-positive tres casos en los que los genes constitutivos no pueden ser amplificados por múltiples o singleplex. En estas muestras, los altos niveles de degradación del ADN no parece afectar a la amplificación de ADN viral, ya que, en todos los casos, los 801 bp, primer paso-y el único 250/300 bp-PCR productos se ampliaron. Una comparación de Rish y la PCR se muestra en la Tabla 2, que incluye los resultados de PCR con los casos constitutivos de amplificación.

Nested PCR y único, así como las pruebas de PCR ciego, con dos extractos de ADN de 15 muestras de PET, son totalmente concordantes, al igual que las comparaciones de ADN HMW-PET-y amplificaciones de ADN.

EBV-ADN podría detectarse en un mínimo de dilución de 1 Namalwa de células en 2 × 10 4-VEB negativo de las células individuales de PCR, con un 0,5 log 10 aumento de PCR anidado (fig 2].

La presencia de EBV se ha investigado en HMW de ADN a partir del 30 de sana PB y 26 policlonales lymphoproliferations. Ninguno de los PB y uno de los ganglios linfáticos reactivos (3,8%) mostraron resultados positivos por única y anidadas-VEB ensayos de PCR. En la 9 BM BL aspirados de pacientes, el genoma de VEB se detectó sólo en muestras BM infiltrados por VEB-positivo las células tumorales (Tabla 3].

Discusión

Una de las características más sorprendentes de pediatría BL es la frecuencia de la variante VEB asociación en diferentes regiones geográficas [5]. En África tropical es casi siempre relacionados con el VEB. Por el contrario, en BL esporádicos en los países desarrollados, EBV asociación ha sido demostrada en 15 y el 30% de los casos [5, 22]. La asociación de BL y VEB en los países en desarrollo es intermedio entre los esporádicos y endémicos tipos [8, 23, 24]. En América del Sur, una alta asociación de EBV y BL se informó en el Nordeste de Brasil (~ 80%) [25 - 27], y una asociación más bajo se observó en pacientes de Argentina y Chile [28 - 30]. En el presente estudio, hemos detectado una frecuencia de asociación de VEB 68% en 41 NHL infancia sureste de Brasil, que es mayor que en los países desarrollados. De este modo, el uso de EBV para la identificación de nuevos objetivos de la terapia en mala situación de riesgo, VEB-positivo linfomas es de interés, dando lugar a un esfuerzo para mejorar los actuales VEB diagnóstico.

Eber-ARN hibridación in situ es el estándar para el diagnóstico VEB en las células tumorales [14], mientras que los procedimientos de PCR se utilizan para VEB a escribir. A pesar de la sencillez de PCR podría favorecer su adopción como primera línea de método para el diagnóstico, su alta sensibilidad puede producir resultados positivos falsos debido a la detección de VEB-positivo células de memoria y / o no tumorales, los linfocitos espectador. Sin embargo, la frecuencia de VEB-positivo memoria células sanas en personas seropositivas representa menos del 1 / 50000 en casi todas las estimaciones [3, 4, 31], mientras BL y DLBCL se caracteriza principalmente por lymphoproliferation monomórficos de células con una alta carga viral cuando infectados por el VEB [31]. Estas observaciones nos llevó a validar los ensayos de PCR para el diagnóstico EBV en estos de alto grado NHL, cuando sea estrictamente normalizada de métodos de PCR pueden tener un papel importante. En primer lugar, en un centro de alta complejidad que ofrece el tratamiento del cáncer a una gran población, Rish es un segundo o tercer método de tiempo, sólo después de considerarse histopatológicos e inmunohistoquímicos diagnóstico. La pronta definición de la condición de VEB es importante en algunas situaciones, por ejemplo, para definir la matrícula de un paciente en una clínica de protocolo o en una carga viral estudio de seguimiento, o bien para proceder a estudios biológicos sobre el material fresco. En segundo lugar, el costo financiero de Rish puede limitar las áreas de escasos recursos los países, lo que hace el esfuerzo por desarrollar una justificación para VEB diagnóstico, incluida la PCR como de primera línea, el rápido enfoque seguido por Rish para su confirmación, significativo.

Se presenta un método fiable y para la detección de VEB y escribiendo en muestras clínicas. La elección de PET-PCR DNA como plantilla destinada a que los resultados de ambos métodos comparables, y para poner a prueba la fiabilidad de PCR en los más desfavorables condiciones técnicas. Nuestro comparaciones de detección de VEB Rish y PCR mostró que ambos métodos siempre muy concordantes de datos (95%), con la misma sensibilidad (96%). La baja de detección de VEB en lymphoproliferations reactiva (4%) también señala la conveniencia de la adopción de PCR como prueba de cribado de rutina, que puede ser instrumentado sobre la base única ronda de PCR, disminuyendo los riesgos potenciales de contaminación cruzada.

Los experimentos de PCR anidada de los ensayos con Namalwa bien conservada de ADN puso de manifiesto la mayor sensibilidad de nuestro método. Incluso esta sensibilidad excluido la posibilidad de detección de VEB-teniendo memoria células en muestras clínicas, reforzada por los análisis emparejados, de 9 de BM y muestras tumorales, en la que VEB se detectó por PCR sólo en los casos que muestran BM infiltración de VEB-positivo las células tumorales. Cabe mencionar que el proyecto de plan de diagnóstico depende de la sensibilidad de nuestro método de PCR, ya que un método más sensible podría conducir a una conclusión diferente.

En anteriores estudios de tipificación de PCR en BL, concordantes Rish / PCR se informaron los resultados de Rish-en los casos positivos que posteriormente fueron PCR-prueba [23 - 30]. Como no se proporcionó información sobre los resultados en PCR-negativos Eber casos, una muy alta sensibilidad de los VEB específicos de los métodos de PCR, lo que los hace inadecuados con fines de diagnóstico, no puede ser evaluada.

En este estudio, aunque sólo un gen viral se puso a prueba, el ADN viral parece ser más eficiente que amplifica el ADN genómico de PET, lo que plantea la posibilidad de que el ADN viral puede ser más resistentes a la degradación, probablemente debido a un efecto diferencial del tejido fijador en VEB ADN / proteína complejos [32]. Sin embargo, si la PCR se utiliza como una prueba de selección, amplificación de genes celulares debe considerarse obligatoria.

La detección molecular de VEB en los linfomas no ha producido la coherencia en los resultados debido a la heterogeneidad biológica y a las diferencias metodológicas [33 - 35]. Los criterios diagnósticos recomendados por la OMS-IARC [14] son adecuados para las entidades como HD, donde la heterogeneidad clínica de subtipos y tipos de células justificar este enfoque conservador [35]. Detección molecular VEB también debe considerarse con cautela en el periférico de células T NHL y anaplásico de células grandes linfoma, ya que comprenden entidades heterogéneas con la condición de clonalidad incierto [36, 37].

Conclusión

La elevada se observó correlación entre la PCR y Rish datos sugieren que el diagnóstico VEB podría ser actualizado para los linfomas como BL y DLBCL, con PCR como un rápido enfoque seguido por la confirmación Rish. Esto sería suficiente para VEB-diagnóstico en las regiones en desarrollo, especialmente en las zonas donde la situación epidemiológica de varias VEB-entidades asociadas sigue siendo poco clara [26, 27].

Conflicto de intereses

Los autores declaran que no tienen intereses en conflicto.

Autores de las contribuciones

RH diseñó el estudio, realizado e interpretado molecular y análisis Rish y escribió el manuscrito. LRW, CGS y FEF realizado e interpretado los análisis moleculares. DEO realizado e interpretado Rish análisis. CEK revisado clínico-patológicas de datos de los casos. Junta interpretarse Rish datos y revisado críticamente el manuscrito. HRS revisado críticamente y participó en la elaboración manuscrito. IRZ diseñó el estudio y revisión crítica del manuscrito. Todos los autores leído y aprobado el manuscrito final.

Agradecimientos

Apoyo financiero: Conselho Nacional de Pesquisa (CNPq), Grant 478264-2003-8 Brasil; NIH Grant R01CA082274-04S1, EE.UU., y Swissbridge Foundation, Suiza. RH quiere dar las gracias al Dr Claudio J. Bidau (Instituto Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro, Brasil) para la lectura crítica y útiles comentarios.