BMC Genomics, 2006; 7: 209-209 (más artículos en esta revista)

Identificación de los ancestrales asesino inmunoglobulina-gen receptor como en primates

BioMed Central
Jennifer G Sambrook (js8@sanger.ac.uk) [1], Arman Bashirova (bashirovaa@ncifcrf.gov) [2], Hanne Andersen (handersen@bioqual.com) [3], Mike Piatak (piatakm@ncifcrf.gov ) [3], George S Vernikos (gsv@sanger.ac.uk) [1], Penny Coggill (pcc@sanger.ac.uk) [1], Jeff D Lifson (lifson@ncifcrf.gov) [3], Mary Carrington (carringt@ncifcrf.gov) [4], Stephan Beck (beck@sanger.ac.uk) [1]
[1] Immunogenomics Laboratorio, Wellcome Trust Sanger Institute, Genome Campus, Hinxton, Cambridge CB10 ISA, Reino Unido
[2] Laboratorio de Diversidad Genómica, Instituto Nacional del Cáncer, SAIC-Frederick, MD 21702, EE.UU.
[3] retroviral Patogénesis Laboratorio, Programa de la Vacuna contra el SIDA, SAIC-Frederick, MD 21702, EE.UU.
[4] Laboratorio de Diversidad Genómica, Programa de Investigación Básica, SAIC-Frederick, MD 21702, EE.UU.
[5] afiliación actual: Departamento de Enfermedades Infecciosas de la Facultad de Medicina de la Universidad Johns Hopkins, Baltimore, MD 21231, EE.UU.
[6] afiliación actual: BIOQUAL Inc, Rockville, MD 20850, EE.UU.

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Resumen
Fondo

Killer Inmunoglobulina-como Receptores (KIR) son esenciales inmuno-vigilancia moléculas. Ellos se expresan en natural killer y las células T, e interactuar con los antígenos de leucocitos humanos. KIR genes son altamente polimórficos y vital contribuir a la variabilidad nuestro sistema inmunológico. Numerosos genes KIR, pertenecientes a cinco diferentes linajes, se han identificado en todos los primates examinados hasta ahora y que se muestra en rápida evolución. Dado que siguen siendo pocos KIR orthologous entre las especies, con sólo uno de ellos, KIR2DL4, que se muestra a ser comunes a los humanos, simios y monos, la evolución de la familia de genes KIR en primates sigue sin estar clara.

Resultados

El uso de análisis comparativos, hemos identificado el linaje ancestral KIR (provisionalmente llamado KIR3DL0) en primates. Mostramos KIR3DL0 a ser muy conservadas con la identificación de orthologues en humanos (Homo sapiens), chimpancé común (Pan troglodytes), gorila (Gorilla gorilla), el mono rhesus (Macaca mulatta) y común marmoset (Callithrix jacchus). Predecimos KIR3DL0 para codificar una molécula funcional en todos los primates mediante la demostración de expresión en humanos, chimpancés y monos rhesus. Usando el mono rhesus como un modelo, una vez más muestran el perfil de expresión a ser típica de KIR de medición cuantitativa de KIR3DL0 enriquecido de una población de células natural killer.

Conclusión

Una de las razones por KIR3DL0 puede haber escapado descubrimiento durante tanto tiempo es que, en humanos, entre mapas en dos leucocitos inmunoglobulina-como receptor de las agrupaciones fuera de la conocida KIR grupo de genes en el cromosoma 19. Sobre la base de genómica, cDNA, de expresión y de datos filogenéticos, un nuevo informe linaje de los receptores de inmunoglobulina pertenecientes a la familia KIR, el cual es altamente conservado durante 50 millones de años de evolución de primates.

Fondo

El Asesino de inmunoglobulina-como receptor (KIR) la familia de genes codifica Complejo Mayor de Histocompatibilidad (MHC) de clase I receptores específicos que se expresan en Natural Killer (NK) y células T [1, 2]. En los seres humanos, estos son codificados dentro de los leucocitos Receptor Complex (LRC) [3] en el cromosoma 19q13.4, que al igual que la de MHC en el cromosoma 6p21.3, es una región característica de loci inmunológico: muy plástico, poligénica, polimórficos, que evoluciona rápidamente , Y asociado con la enfermedad [4]. Como resultado, KIR diversidad vital contribuye a la variabilidad nuestro sistema inmunológico, con consecuencias directas para la salud y la enfermedad [5, 6]. KIR que trabajan en concierto con su antígeno leucocitario humano (HLA) ligandos se ha demostrado que influye directamente en la resolución de infecciones virales tales como virus de la hepatitis C [7].

Numerosos KIR genes, tanto en su inhibitoria y la activación de formas, se han identificado en todos los primates examinados hasta la fecha y demostrado ser rápida evolución [8 - 11]. Inhibitoria KIR ya han citoplásmica colas en comparación con la activación de KIR, y típicamente contienen dos immunoreceptor tirosina basado en motivos inhibitoria (ITIMs) que se encargan de reprimir la inmunoreactividad de las células NK. La aparición de los primates activar KIRs se explica por dos procesos: la alteración en la duración y la secuencia de la cola citoplásmica en un ancestral de larga cola KIR para eliminar la ITIMs, acompañado de cambios de nucleótidos en la transmembrana (TM) de dominio a introducir un cargado de residuos [12]. Otro rasgo diferencial de las moléculas KIR es el número de extracelular inmunoglobulina (IG) dominios, que llevan los números D0, D1 y D2. Aunque KIR2DL4 se conserva en todos los primates estudiados hasta la fecha [11], es improbable que representan el KIR genes ancestrales. Estructuralmente, KIR2DL4 tiene un D0 + D2 organización y ha surgido por el exón pérdida de un período de tres Ig contienen progenitoras. El ITIMs presentes en el citoplasma de cola tampoco están conservadas entre todos los primates: los monos tienen dos, los monos tienen sólo uno, y en algunos casos, el motivo ha variado desde el consenso (gorila) [13]. KIR2DL4 ha cargado un aminoácido en TM la región, y en este sentido, podría actuar como activar KIR [8]. Se vincula a la no polimórficos HLA-G molécula, y esto puede explicar por qué este gen se ha mantenido relativamente sin cambios desde el último ancestro común. Aquí mostramos un nuevo linaje (provisionalmente llamado KIR3DL0) y demostrar que se divergentes a los que anteriormente se habían linajes y conservado durante 50 millones de años de evolución de primates. Características que se espera que estén presentes en los primates ancestrales común KIR, tales como tres dominios Ig, una larga cola frente al citoplasma, y dos ITIMs proporcionar una función inhibitoria, están presentes en todos los KIR3DL0 linaje. A efectos del presente informe, definimos "ancestrales", como la filogenéticamente más divergentes gen. En apoyo de este descubrimiento, presentamos genómica, cDNA, de expresión y de datos filogenéticos.

Resultados y discusión
Identificación del locus KIR3DL0

Aunque todavía situado en el LRC [3, 14], el ser humano KIR3DL0 locus mapas aproximadamente 180 kb centroméricas a la conocida KIR grupo (Figura 1A]. Esta ubicación entre las dos relacionadas con inmunoglobulina de leucocitos-como receptor (LILR) clusters puede explicar por qué este gen ha escapado descubrimiento durante tanto tiempo. A pesar de su ubicación fuera del grupo KIR, KIR3DL0 es claramente más relacionadas filogenéticamente a KIR genes que a cualquier otro Ig contienen genes dentro de la LRC (Figura 1B].

KIR Todos los miembros de la familia comparten una estructura similar de genes; discretos exones codificar la señal de péptido, ya sea dos o tres dominios extracelulares de inmunoglobulina, un tallo, región transmembrana y una cola citoplásmica. Como se muestra a continuación, la secuencia genómica de KIR3DL0 es característico de KIR y altamente conservadas en todos los primates (Figura 2], pero, en humanos, una sola supresión de siete nucleótidos al final del tercer dominio inmunoglobulina (IgD2) en el exón 5 conduce a una frameshift, impidiendo que se expresa en la superficie celular. Debido a la supresión, se utiliza la alternativa marcos de lectura para el final del exón 5 y los exones 6 / 7, resultando en una forma potencialmente secretada de KIR3DL0 con TM y no frente al citoplasma de dominios. La única posibilidad de que el resto de KIR3DL0 receptor de membrana de obligado sería una asociación con el adaptador DAP12 molécula mediada por un aminoácido cargado en el TM. DAP12 es capaz de estimular la actividad citotóxica ya que contiene un immunoreceptor tirosina basado en la activación y el motivo es el modo en que la activación de KIRs tener un efecto. A pesar de que el frameshift se ha traducido en la presencia de un acusado de aminoácidos (K) en la terminal de exón (exón 7), deducir la secuencia de aminoácidos no corresponde a un TM o núcleo hidrofóbico región, lo que hace que la asociación con DAP12 menos probable en este caso. KIR3DL0 Humanos se basa en una larga duración cDNA aislado de un ser humano línea de células NK (NK-92), y está respaldada por una secuencia parcial de cDNA [GenBank: BC033195 ] De la colección de genes de mamíferos (MGC), aisladas de diferentes humanos línea de células NK (NIH_MGC_106). Con el fin de comprobar para el polimorfismo, 86 individuos sanos no relacionados fueron secuenciados en toda la región y suprime el mismo frameshift causando supresión estuvo presente en todos los individuos.

La relación de KIR3DL0 KIR a la familia de genes se ve confirmado por análisis de la estructura genética. El uso de FINEX, un método que identifica a las familias de genes basado en la conservación de la estructura genética (intrón / exón fases) en lugar de similitud de secuencias [15], el pariente más cercano de KIR3DL0 es el prototipo humano de genes KIR KIR3DL1 con un significativo z-score de + 10,88 (datos no presentados). Por otra parte, utilizando VISTA [16], una herramienta de comparación de los genomas, importante en la conservación tanto codificantes y no codificantes secuencias está presente entre todos los primates KIR3DL0 secuencias y KIR3DL1 [véase la disposición 1].

La conservación de primates en KIR3DL0

Mostramos KIR3DL0 a ser muy conservadas en los primates con la identificación de orthologues en el chimpancé común (Pan troglodytes), gorila (Gorilla gorilla), el mono rhesus (Macaca mulatta) y común marmoset (Callithrix jacchus). Los dos ejemplares en marmoset se organizan en un cabeza a cabeza orientación y es probable que sean el resultado de una especie específica de la duplicación. Estos primates no humanos divergieron de los seres humanos aproximadamente 5, 7, 25 y 50 millones de años, respectivamente. En todos los casos, KIR3DL0 mapas syntenic a la región entre LAIR2 y LILRA2. Detalles de la organización genómica LRC en estos primates se describen en otros lugares.

El primate KIR3DL0 secuencias comparten el mismo exón-intrón de configuración y se pronostica que codifican proteínas funcionales (Figura 2]. Además de los cDNA humanos, la plena extensión cDNA secuencias fueron aisladas de chimpancé y del mono rhesus. Las variaciones entre la genómica y de cDNA secuencias pueden indicar KIR3DL0 a ser polimórfico. Aunque sólo dos secuencias podrían ser comparados por especie, hemos identificado cinco no-sinónimo sustituciones en chimpancé y un sinónimo de sustitución en humanos. La conservación de dos immunoreceptor tirosina basado en motivos inhibitorio, presente en la cola citoplásmica de la proteína predice KIR3DL0 secuencias de todas las especies estudiadas, indica una función inhibitoria de estos receptores. Estos motivos están presentes en un solo ejemplar en marmoset, que cuenta con el total de nueve exón estructura genética. La forma abreviada es que faltan los últimos tres exones de codificación de la TM y frente al citoplasma de los dominios, dando como resultado una forma potencialmente secretada, que es similar pero no idéntico, al KIR3DL0 cDNA en humanos (Figura 2]. Mientras que tres N-glicosilación sitios vinculados (NXS / T) se conservan en la mayoría de las secuencias analizadas, un nuevo sitio está presente en la IgD2 de las dos copias KIR3DL0 en marmoset. A corto marmoset en forma particular, el sitio de glicosilación extra aumenta el potencial nivel de glicosilación. Los altos niveles de glicosilación han demostrado ser esenciales para la secreción de algunas inmunoglobulinas [17].

Análisis filogenético

El KIR genes identificados hasta la fecha se han dividido en cinco linajes [8, 9, 11, 13]: linaje I comprende los genes con las configuraciones de dominio específico (IgD0 y IgD2 dominios), linaje II se define por ligando específico (HLA-Ay HLA-B), linaje III contiene una mezcla de genes KIR con dos o tres dominios Ig, linaje IV genes sólo se encuentran en monos rhesus, y el linaje V abarca KIR genes que carecen de tallo. Una vez establecido que KIR3DL0 se conserva en todas estas especies en los genes y los niveles de proteína (por ejemplo, 33-41% de similitud con KIR3DL1 humanos [véase la disposición 2], hemos utilizado el análisis filogenético para determinar si procede o no la nueva KIR3DL0 genes también representan un nuevo linaje KIR . Uso de la deducirse de larga duración de las secuencias de proteínas conocidas de primates KIR genes, el árbol se muestra en la Figura 3 se construyó. La novela KIR3DL0 secuencias de todas las agrupaciones por separado y con una alta confianza de arranque en la base del árbol, lo que demuestra que KIR3DL0 representa no sólo una novela, sino también el linaje ancestral de primates KIR genes. Con el fin de confirmar este hallazgo y determinar si, a causa de su ubicación, surgió de KIR3DL0 no recombinación homóloga entre KIR LILR y secuencias, aparte de árboles también fueron construidos para cada una de las KIR3DL0 dominios y los correspondientes dominios de KIR y LILR. En las condiciones utilizadas aquí (ver Materiales y Métodos para más detalles), todos los dominios KIR3DL0 agrupadas en la base del clado KIR, separados de los dominios LILR [véase la disposición 3]. El IgD1 dominio de KIR3DL0 está más estrechamente relacionada con la IgD0 dominios de la familia de genes KIR (incluido el IgD0 de KIR3DL0) en comparación con todos los demás dominios utilizados en el análisis.

Perfiles de expresión

Se confirmó KIR3DL0 expresión de cDNA de la clonación en humanos, chimpancés y monos rhesus. El cDNA humanos fue clonado a partir de una línea de células NK (NK-92), y el análisis preliminar muestra de expresión en otras cinco líneas de células NK, pero no en células Jurkat (células T) (datos no presentados). Para evaluar el patrón de expresión de manera más detallada, hemos elegido el mono rhesus. De sangre periférica de células mononucleares (PBMC) se obtuvieron y NKp46 + células, previamente demostrado ser enriquecido para la actividad citolítica NK [18], se aislaron de immunoaffinity métodos. En primer lugar, mediante RT-PCR, un 1,4 kb cDNA se identificó que codifica una proteína de 458 aminoácidos, y verifica en el silico-estructura de primates KIR3DL0. Un segundo fragmento también se observó y representa una forma alternativa de empalme del exón 5 desaparecidos; esta variante sólo tiene dos dominios Ig. En segundo lugar, los niveles de mRNA KIR3DL0 en estas poblaciones celulares se han cuantificado en tiempo real RT-PCR ensayo. A la vista de datos que indican que la IL-2 puede aumentar la expresión de KIRs, Rhesus NKp46 + células fueron cultivadas también en la presencia humana recombinante de IL-2 durante una semana, y la prueba de KIR3DL0 mRNA expresión al final de este período. Como se muestra en la Figura 4, los niveles de KIR3DL0 mensaje fueron moderadamente enriquecido NKp46 + en las células en comparación con unfractionated PBMC de los tres monos rhesus a prueba, aunque el número relativamente bajo de copias por célula NKp46 + sugiere que el receptor puede ser expresada por sólo un subconjunto de NKp46 + células. Cultura en presencia de IL-2 se debieron en gran upregulation de expresión de KIR3DL0 en las células de los tres animales.

Conclusión

Sobre la base de análisis comparativo de secuencias, hemos identificado un nuevo linaje de los receptores de inmunoglobulina y enséñalos a ser parte de la familia de receptores KIR, apoyado por cuatro líneas independientes de las pruebas. (I) similitud de secuencia: Usando el algoritmo de BLAST, la similitud en ambos el ADN y las proteínas es más alto nivel a KIR. (II) la estructura genética de similitud: Los nueve exón estructura genética y las fases de los límites del sitio de empalme son idénticos o similares a más KIR que a cualquier otra familia de genes. (III) filogenia: Longitud total dominio y por el análisis filogenético de dominio el nuevo grupo con secuencias de confianza alta en la base del clado KIR. (IV) Expresión: la clonación de cDNA y cuantitativos RT-PCR análisis demuestran una expresión típica de perfil KIR. Aunque los datos presentados aquí sugieren 3DL0 a ser el gen ancestral KIR en primates, no podemos descartar la posibilidad de selección han causado la divergencia observada. La situación en primates no queda claro. Sobre la base de nuestra propia y se informó anteriormente filogenética pruebas [12], la primordial no primates KIR gen se prevé que ser un período de tres Ig inhibidor del receptor, más parecida a KIR3DL0. Sin embargo, no hemos podido encontrar ninguna importantes coincidencias con KIR3DL0 en no primates, excepto para las secuencias se informó anteriormente [19 - 23] que tienen mayor similitud con KIRs más reciente. Recientemente, un grupo de genes Chir se ha identificado en gallina, pero estos se asemejan a la organización de dos KIRs de dominio [24]. Una posible explicación para estas observaciones es que KIR3DL0 se ha perdido de no genomas de primates. Polifilético pérdida de múltiples genes humanos de los primates no genomas de vertebrados se ha observado antes y ha dado lugar a la sugerencia de que tales acontecimientos son más frecuentes que se pensaba anteriormente [25]. Ambos rápida evolución convergente y probablemente han contribuido a, o incluso impulsado este proceso. En roedores, por ejemplo, Ly49 múltiples genes, que codifican C-tipo lectinas, llevará a cabo el KIR función análoga. Los dos murino Kirl1 y Kirl2 genes [21] falta la característica de activar / inhibitoria motivos de KIRs y plano de situación para el cromosoma X fuera de la LRC conservadas de otro modo. Del mismo modo, el único KIR-como secuencia en la rata (Kir3dl1) [19] carece de la región del tallo y tiene una alargada TM región. La secuencia, sin embargo, el mismo general (3DL) como estructura KIR3DL0 y mapas para la región syntenic en la rata LRC y, en este sentido, representa el más cercano no primates relativa a KIR3DL0.

Métodos
Cartografía y secuenciación

BAC contigs que abarca el KIR región se generaron y por etapas, tal como se describe anteriormente [11]. KIR3DL0 secuencias genómicas se obtuvieron de la siguiente manera: a la alimentación humana, utilizando Ensembl [26] asamblea NCBI-35; de chimpancé, utilizando Ensembl asamblea chimpancé-1; de gorila , La tasa de alcoholemia de la secuencia [EMBL: CR759947 y EMBL: CR759950], y para marmoset, la tasa de alcoholemia de la secuencia [EMBL: CR925829]. La secuencia única diferencia que cubre la región transmembrana en el chimpancé-1 montaje fue amplificado y secuenciado utilizando adelante (5'-caccaacattctttggagcaagtt-3 ') e invertir (5'-aggctgaggtggaagaatggc-3') primers. La región frameshift en el gen humano KIR3DL0 fue secuenciado en 86 individuos sanos (81 de raza caucásica, 3 African American, 1 de Asia, 1 desconocido origen étnico), utilizando adelante (5'-ttccaggccaacttttctgtgg-3 '), e invertir (5'-tctgtgatccagtgggcacca-3 ') Primers. KIR3DL0 secuencias de cDNA fueron obtenidos por transcripción reversa de RNA total usando Superíndice (Invitrogen). Total RNA fue aislado utilizando Trizol (Invitrogen). El chimpancé y Macaca KIR3DL0 cDNAs [GenBank: DQ224422 y GenBank: DQ157756 ] Fueron clonados por dos rondas de PCR de sangre periférica de linfocitos cDNA. La primera ronda de PCR se realizó con los primers KIR3DL0-F2, 5'-ctgtgtcctgcccaatagaag-3 ', y R2-KIR3DL0, 5'-cctcctaggaatagatccagg-3'. Para la segunda vuelta, hemos utilizado los cebadores KIR3DL0-F2 y R1-KIR3DL0, 5'-aggaatagatccaggtccttg-3 '. El cDNA humanos KIR3DL0 [GenBank: DQ224421 ] Fue clonado de una ronda de PCR utilizando el KIR3DL0-F2 y R1-KIR3DL0 primers.

Secuencia de análisis

Genómica secuencias fueron analizados mediante el ARTEMIS [27], ACT [28], y BLAST [29]. Múltiples secuencia de alineaciones se llevaron a cabo en ClustalX [30], y editado a mano para aprovechar al máximo la alineación. Los árboles fueron construidos utilizando el método Participar vecinos [31] en MEGA versión 2,1 [32], utilizando KIR3DL0 humanos derivados de secuencia genómica, con el frameshift en IgD2 corregido manualmente para lograr la secuencia de nuevo en cuadro. Los árboles tienen sus raíces en el punto medio, utilizando una supresión completa (Figura 1B] o supresión pairwise (Figura 3], la opción de corrección de Poisson, de arranque y 500 repeticiones. Global genómica comparaciones se hicieron usando VISTA [16]. FINEX [15] se usa en conjunción con su correspondiente estructura de base de datos de genes derivados de EMBL versión 181 (eucariotas).

Expresión análisis
Abreviaturas

Antígeno leucocitario humano (HLA); inmunoglobulina (IG); immunoreceptor tirosina basado en motivos inhibitoria (ITIM); Killer Inmunoglobulina-como receptor (KIR); leucocitario Inmunoglobulina-como receptor (LILR); leucocitario Receptor Complex (LRC); Complejo Mayor de Histocompatibilidad (MHC); sangre periférica de células mononucleares (PBMC); transmembrana (TM)

Autores de las contribuciones

JGS, GSV, el PC llevó a cabo el mapeo y análisis de secuencias. JGS redactado el manuscrito. AB llevó a cabo el cDNA análisis e interpretación de datos. HA, MP, JDL realizó perfiles de la expresión. SB y MC participado en el diseño y coordinación del proyecto, y ayudó a redactar el manuscrito. Todos los autores han leído y aprobado el manuscrito final.

Material complementario
Archivo Adicional 1
VISTA parcela de KIR3DL1 humanos y en primates KIR3DL0
La parcela VISTA compara la secuencia de conservación entre humanos
KIR3DL1
y
KIR3DL0
en humanos, chimpancés, gorilas y marmoset.
2 ficheros adicionales
Secuencia similitudes entre KIR3DL1 humanos y en primates KIR3DL0
El cuadro muestra secuencia de nucleótidos y aminoácidos similitudes entre humanos
KIR3DL1
y
KIR3DL0
a humanos, gorilas, chimpancés, monos rhesus y marmoset.
3 ficheros adicionales
Dominio por dominio análisis de KIR humanos y los genes LILR
Árboles filogenéticos se muestran para los dominios Ig, péptido señal, y la combinación de secuencias del tallo, transmembrana y cola citoplásmica.
Agradecimientos

Damos las gracias a J. Almeida, HR Hotz, K. Howe, S. Palmer, H. y S. Sehra Sims para la asistencia técnica y ayuda con el análisis. JGS, GSV, PC y SB fueron apoyadas por el Wellcome Trust. El reactivo de IL-2 se ha obtenido mediante el NIH y la investigación del SIDA del Programa de reactivos de referencia. Parte de esta labor fue apoyada con fondos federales del Instituto Nacional del Cáncer, Institutos Nacionales de Salud en virtud de un contrato no. No1-CO-12400. El contenido de esta publicación no refleja necesariamente las opiniones o políticas del Departamento de Salud y Servicios Humanos, ni la mención de nombres comerciales, productos comerciales, u organización implican endosos por el Gobierno de los EE.UU..