Journal of Biomedicine and Biotechnology, 2006; 2006: (más artículos en esta revista)

Inmunoensayos específicos para la fosfatasa alcalina placentaria como un marcador tumoral

Hindawi Publishing Corporation
Sérvio T. Stinghen [1], F. Juliana Moura [1], Patrícia Zancanella [1], Giovanna A. Rodrigues [1], Mara A. Pianovski [2], Enzo Lalli [3], Dodie L. Arnold [4 ], João C. Minozzo [5], Luis G. Callefe [1], Raúl C. Ribeiro [6], C. Bonald Figueiredo [1, 7]

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Resumen

Placentaria humana (hPLAP) y de células germinales (PLAP-like) las fosfatasas alcalinas son polimórficos y bomba de calor, estable enzimas. Este estudio fue diseñado para desarrollar inmunoensayos específicos para cuantificar hPLAP y PLAP-al igual que la actividad enzimática (AE) en el suero de pacientes con cáncer, las mujeres embarazadas, o los fumadores. Oveja policlonal anti-hPLAP anticuerpos fueron purificados por cromatografía de afinidad con toda la hPLAP proteína (ICA-PLAP ensayo) o un péptido sintético (aa 57-71) de hPLAP (ICA-PEP ensayo); el intervalo de trabajo se 0.1-11 U / L y el valor de corte fue de 0,2 U / L EA para no fumadores. La intra e interassay coeficientes de variación fueron del 3,7% -6,5% (ICA-PLAP ensayo) y 9,0% -9,9% (ICA-PEP ensayo). Un insignificante de reactividad cruzada se observó altos niveles de sin calefacción intestinal fosfatasa alcalina en ICA-PEP ensayo. Una correlación positiva entre la regresión del tamaño del tumor y EA se observó a un niño con carcinoma embrionario. Se puede concluir que ICA-PEP ensayo es más específico que ICA-PLAP, que sigue siendo útil para detectar otros PLAP / PLAP-como fenotipos.

INTRODUCCIÓN

Humanos, las fosfatasas alcalinas (FA) son enzimas dimeric de glycosylphosphatidylinositol anclado a la membrana celular. Específicas phospholipases puede cleave ALP de la membrana celular, produciendo ALP libre en el suero [1 - 3]. ALP consiste en una familia de cuatro isoenzimas: (1) ALP placentaria (PLAP; hPLAP o en el caso de la placenta humana ALP), y (2) de células germinales ALP (PLAP-o como GCAP), que son a la vez estable en el 65 ° C presente y el 98% de homología, así como (3) ALP intestinal (IAP), y (4) ALP tejido inespecífico (TNAP) o hígado / hueso / riñón ALP, que no son estables a 65 ° C y 88% actual y 56% de homología con PLAP, respectivamente [4 - 6].

PLAP está codificada por un gen altamente polimórficas de los cuales 3 común alelos y por lo menos 18 alelos raros existen; dando origen a 48 fenotipos conocidos [7 - 9]. El PLAP-al igual que la enzima está codificada por 4 alelos con al menos 10 fenotipos conocidos [9 - 12]. PLAP y PLAP-al igual que las enzimas pueden formar heterodimers [13].

PLAP se sintetiza en la placenta sinciciotrofoblasto que comenzará tras la 12 ª semana de embarazo [14] y es probable que participan en la transmisión de IgG de transporte [15, 16]. El PLAP-al igual que la enzima es sintetizada principalmente en los testículos, cuello de útero, y timo. Trace cantidades se sintetizan en la placenta y los tejidos del pulmón [17, 18]. En sanos, los adultos que no fuman PLAP y PLAP-al igual que la enzima actividades representan menos del 1% de todos los ALP [19, 20]. Fumar provoca elevadas concentraciones séricas de la PLAP-al igual que la enzima, lo que puede disminuir el valor de PLAP-como enzima como un marcador tumoral. Las concentraciones séricas de PLAP-al igual que la enzima volver al rango normal después de 1-2 meses de abandono del hábito de fumar [21 - 23].

Expresión ectópica de PLAP se asocia con el cáncer de ovario, testículo, pulmón, colon y tracto [14]. Expresión ectópica de la PLAP-al igual que la enzima está asociada con cáncer testicular: intratubular de células germinales neoplasia, sin clasificar (IGCNU), seminoma, carcinoma embrionario, coriocarcinoma y [23 - 25]. Roelofs et al [26] mediante RT-PCR han demostrado que seminoma y IGCNU expresar fundamentalmente la PLAP-al igual que la enzima, mientras que los carcinomas embrional expresar cantidades variables de PLAP y PLAP-como las enzimas.

Debido a su alta homología, PLAP y PLAP-al igual que las enzimas no pueden distinguirse fácilmente utilizando anticuerpos policlonales o monoclonales. Sin embargo, los anticuerpos monoclonales específicos C2 y 17E3 sólo podrán reconocer PLAP [27, 28]. En general, la actividad de la enzima se considera generalmente como para incluir ambos PLAP y PLAP-como.

Las concentraciones séricas elevadas de PLAP y PLAP-al igual que las enzimas se encuentran en un 25% -65,5% de los pacientes con cáncer de ovario [19, 29 - 35], y el 22% -89% de los pacientes con tumores testiculares [23, 36 - 42]. Los valores de las variables de PLAP y PLAP-al igual que la actividad enzimática o concentraciones séricas puede depender del método utilizado y de anticuerpos para la detección, así como sobre el tipo de cáncer o en escena. Seminomas puede tener un perfil molecular similar a carcinoma embrionario; explicando inmune aberrante perfiles [43].

Las pruebas de muestras de suero de pacientes con cáncer de ovario demostrado que los métodos de ensayo para PLAP / PLAP-como actividad de la enzima es menos sensible que la prueba de CA 125 (71% -85%) y alfa-fetoproteína (AFP) (88%) [44]; sin embargo , Las pruebas para PLAP / PLAP-al igual que la actividad enzimática fue considerado el mejor indicador de supervivencia [35], y más específicas (PLAP / PLAP-como; del 95%) que no son CA 125 (71%) [31]. Weissbach et al [23] han demostrado que los niveles séricos PLAP / PLAP-como era más sensible (56%) que otros marcadores tumorales, como la HCG (35%) y LDH (34%), en la evaluación de pacientes con seminoma.

Anticuerpos policlonales contra PLAP y PLAP-al igual que las enzimas pueden cruzar de reaccionar con el IAP de isoenzimas. En contraste, los anticuerpos monoclonales pueden no detectar todos los fenotipos ALP si el epítopo está ausente (por ejemplo, a causa de polimorfismo, o si se ha exfoliados de phospholipases) [45, 46].

Para eliminar estos dos problemas de este último, esta investigación ha sido diseñado para desarrollar y probar dos sensibles y específicos para inmunoensayos PLAP y PLAP-como actividades enzimáticas utilizando dos ovejas hPLAP anti-anticuerpos policlonales purificados por cromatografía de afinidad.

MATERIAL Y MÉTODOS
Animal de inmunización

Una oveja adulta fue vacunado con hPLAP (Sigma-Aldrich, St Louis, Mo, EE.UU.) a través de siete inyecciones subcutáneas en 14 días. La emulsión de la primera inyección fue preparada con 2 mg de hPLAP disueltos en 1 mL de 0,05 M tampón fosfato salino (PBS, pH 7.4) y 1 mL de Freund completo del adyuvante (Sigma-Aldrich, St Louis, Mo, EE.UU.). Los restantes 6 inyecciones fueron preparados utilizando Freund's adyuvante incompleto.

Óptima de vacunación animal se indicó de alta concentración sérica de anti-hPLAP. Esto fue medido por dos protocolos diferentes: prueba de inmunodifusión doble y ELISA indirecto. Animal se obtuvieron sueros (0,8 L) y las inmunoglobulinas se precipitó en una saturada de sulfato de amonio solución.

Purificación de anti-anticuerpos hPLAP

Específicas de lucha contra la hPLAP anticuerpos fueron purificados a través de una columna de cromatografía de afinidad. Un gramo de cianógeno-bro-mide activado Sepharose (CNBr-Sepharose; Sigma-Aldrich, St Louis, Mo, EE.UU.) se ha unido a 20 mg de hPLAP de acuerdo a protocolos descritos anteriormente [47].

Alícuotas de ovejas inmunoglobulinas fueron disueltos en PBS y se distribuyó a través de la columna a un caudal de 20 mL / h durante la noche a 4 ° C. Posteriormente, la columna fue lavada con PBS hasta absorbancia (280 nm) de la solución eluye habían regresado a los niveles basales. Recuperación de la inmuno-globulinas obligado a la hPLAP-Sepharose la columna se realizó el lavado de la columna con 0,1 M glicina-HCl, 0,15 M NaCl , PH 2,8, hasta que un pico de inmunoglobulina se obtuvo. Por último, la columna fue lavada con PBS hasta la absorbancia regresado a los niveles basales. La solución que contenga eluye anti-anticuerpos se hPLAP dializados la noche a 4 ° C en PBS.

Purificación de la lucha contra el aminoácido péptido 57-71

Un péptido sintético se extiende a partir de aminoácidos (aa) de residuos de 57 a 71 de hPLAP, realizados por una técnica informó de Kates y Albericio [48], fue sintetizada y generosamente proporcionada por el Laboratorio de Biofísica de UNIFESP (São Paulo, SP). Selección de péptido de 57-71 aa hPLAP difiere en 2 residuos de PLAP-como, el 3 de residuos de IAP, y el 9 de residuos de TNAP [6]. Esta secuencia de péptido fue escogido porque contiene epítopo libre (s), desplegada en un bucle y accesibles a los anticuerpos.

El péptido sintético (22,9 mg) fue inmovilizada a 1,0 g de CNBr-Sepharose de acuerdo con los métodos descritos anteriormente [47]. Alícuotas purificada que contiene anti-anticuerpos hPLAP se distribuyeron a través de la Sepharose-aa 57-71 péptido columna a un caudal de 20 mL / h. Sin hPLAP anti-anticuerpos (PLAP-Ab) que no reconoce la aa 57-71 péptido se eluye y separados para preparar la primera inmunoensayo, que fue nombrado ICA-PLAP. Anti-aa 57-71 péptido anticuerpos (PEP-Ab) se eluye y se recoge como se ha descrito anteriormente. Estos anticuerpos se separaron para preparar el segundo inmunoensayo, llamada ICA-PEP.

Norma curva

Purificada hPLAP (11 U / mg) (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, EE.UU.), 3 g / L en agua destilada, se utilizó como control, diluido en caseína 0,25%, 0,05% de Tween 20, y PBS (dilución de amortiguación) para obtener hPLAP actividades que van desde 0.17-11 U / L. La dilución de amortiguación se utiliza como solución estándar cero.

Especificidad

La IAP purificado (3 U / mg) (Calzyme, San Luis Obispo, Calif, EE.UU.), 1 g / L en agua destilada, se utilizó para determinar reactividad cruzada. Se diluye en tampón de dilución a concentraciones de 0.05-55 U / L. IAP muestras se probaron con y sin tratamiento térmico a 65 ° C durante 10 minutos.

Las muestras de suero
Análisis de la placenta (control positivo)

Una muestra de tejido de un término placenta se obtuvo y se utiliza como control positivo. Todas las muestras (suero y de tejidos) se almacenan en -80 ° C hasta el ensayo. Soluble extractos de tejido se obtuvieron tal como está descrita anteriormente [21].

Inmunoensayos: ICA-PLAP y ICA-PEP

A 96-Nunc así MaxiSorp microplaca (Nalge Nunc International, Roskilde, Dinamarca) se ha recubierto la noche a 4 ° C con 100 μ l de un 1,6 μ g / mL de solución anti-hPLAP anticuerpos (ICA-PLAP ensayo), o un 18,4 μ g / mL de solución anti-péptido 57-71 aa anticuerpos (ICA-ensayo PEP) en 0,05 M de carbonato de buffer, pH 9,6. Posteriormente, los pozos se lavaron dos veces con tampón de lavado (0,05% de Tween 20 en solución salina). Cada así se llenó con 100 μ l de amortiguador de bloqueo (2% en PBS caseína) y la placa se incubó durante 1 hora a 37 ° C. Después de lavar dos veces con tampón de lavado, 100 μ l de una solución que contenga hPLAP (0-11 U / L, la amplitud de la curva estándar) en una dilución de amortiguación (0,25% caseína, el 0,05% de Tween 20, PBS), y 100 μ l de experimentación muestra de suero, o de tejido homogeneizado el sobrenadante, se han añadido a los pozos. Después de la incubación durante 1 hora a 37 ° C, la placa se lavó 5 veces con tampón de lavado y 100 μ l p-nitrophenyl fosfato sustrato se añadió. Después de una incubación de 5 horas (ICA-PLAP ensayo) o de la noche a la mañana (ICA-ensayo PEP) a 37 ° C, la reacción enzimática se detuvo mediante la adición de 50 μ l de 3 M NaOH . La absorbancia (405/620 nm) se midió utilizando un lector de microplacas (Spectra, Tecan, Zurich, Suiza). Todas las normas y las muestras fueron probados por duplicado. El control positivo para todos los ensayos fue una mezcla de sueros tomados de 5 mujeres embarazadas y el 1 de extraer la placenta. Las muestras positivas fueron reanalizada después del tratamiento térmico a 65 ° C durante 10 minutos con el fin de inactivar IAP.

RESULTADOS
Producción, purificación y valoración de anticuerpos

Suero de hPLAP de ovejas vacunadas se puso a prueba de inmunodifusión en presencia de hPLAP (1 mg / mL), y los resultados fueron positivos hasta 1: 2 diluciones. Después del tratamiento el animal se le dio una inyección extra de hPLAP. Suero títulos se reanalyzed de ELISA indirecto 2 semanas más tarde, cuando adecuada inmunización fue revelado por los títulos de 1: 256000.

Purificada anticuerpos policlonales de Sepharose-hPLAP había una concentración final de 1,6 g / L, mientras que los anticuerpos policlonales purificados por Sepharose-aa 57-71 péptido tuvo una concentración final de 0,92 g / L.

Inmunoensayo características

La curva estándar fue lineal entre el 0,1 U / L y 11 U / L (Figura 1], y el límite de detección (que se define como la media +4 SD de la absorbancia del estándar cero para ALP) fue de 0,1 U / L, para ambos PLAP ICA-ICA-y los ensayos de PEP.

La intra e interassay variabilidad (n = 12) se evaluó midiendo 2 embarazada suero piscinas con una media PLAP actividad de 5,5 y 0,75 U / L para ICA-PLAP, y 4,8 y 0,98 U / L para ICA-PEP. La media intra e interassay CV fueron 6,5% y 9,9%, respectivamente, para el ICA-PLAP ensayo, y el 3,7% y 9%, respectivamente, para el ICA-PEP ensayo.

Reacciones cruzadas en el ICA-PLAP ensayo se observó en las concentraciones de IAP de 55 U / L y 27,5 U / L, exhibiendo la actividad de 1,22 U / L y 0,75 U / L, respectivamente. En la IAP las concentraciones de 55 U / L, la actividad de la ACI-PEP ensayo fue de 0,4 U / L. No reactividad cruzada se señaló para calentarse IAP, ya sea en ensayo; IAP demostrando que es muy sensible a altas temperaturas.

Resultados de suero de donantes de sangre

Promedio hPLAP / PLAP-al igual que la actividad no fumador para los donantes de sangre fue 0,06 ± 0,12 U / L (media ± desviación estándar), utilizando el ICA-PLAP ensayo, y 0,01 ± 0,04 U / L (media ± desviación estándar) con la ICA-PEP ensayo. Los fumadores han hPLAP / PLAP-al igual que la enzima actividades que van desde 0-1.72 U / L, con una media de actividad de 0,36 ± 0,41 U / L (media ± desviación estándar), según lo determinado por el ICA-PLAP ensayo, y las actividades de 0-1.65 U / L, con una media de actividad de 0,25 ± 0,36 U / L (media ± desviación estándar), utilizando el ICA-PEP ensayo. Figura 2 muestra la distribución de suero hPLAP / PLAP-al igual que las actividades de los donantes de sangre medido por el ICA-PLAP e ICA-PEP ensayos.

La correlación entre el ICA y PLAP-ICA-PEP en donantes de sangre fue alta (n = 93, r = 0,94), apoyando una justificación para el uso de ambos ensayos. Calor inactivación no interferir con hPLAP / PLAP-al igual que la actividad de fumador o no fumador donantes de sangre en uno u otro ensayo.

El hPLAP / PLAP-al igual que la actividad enzimática de valor de corte definido como el percentil 90 para la zona controlada por Israel-PLAP ensayo y el 100 º percentil para el ICA-PEP-ensayo para los no fumadores fue de 0,2 U / L para ambos ensayos. Basándose en los datos actuales, se propone un normal hPLAP / PLAP-al igual que la actividad enzimática valor de corte que van desde 0-0.4 U / L para los fumadores, pero nuevos análisis son necesarios para confirmar este umbral.

Sera embarazadas resultados

Las muestras de suero de 7 pacientes embarazadas se midieron sin calefacción (NI) y después de la inactivación de calor (I). hPLAP actividades oscilaron entre 0.1-53 U / L. La paciente embarazada en la 12 ª semana de gestación había hPLAP muy baja actividad. La paciente embarazada en la 18 ª semana de gestación tenían bajo hPLAP actividad (1.58-2.5 U / L). Los pacientes de la 27 ª semana para la 37 ª semana de gestación había hPLAP actividades que oscilaron entre 31-53 U / L (Tabla 1]. No hubo diferencias identificadas en hPLAP actividades cuando se comparan inactivada y noninactivated muestras utilizando el PLAP ICA-ICA-o ensayos de PEP.

Caso clínico

El 11,2 años de edad, los pacientes con carcinoma de ovario embrionario fue admitida con una visible y masa abdominal palpable. Antes de la quimioterapia (4 ciclos de cisplatino y Ifosfamide, a intervalos de 21 días), NI y muestras de suero había hPLAP / PLAP-al igual que la actividad enzimática de 9,5 U / L y 10,2 U / L, respectivamente, en el ICA-PLAP ensayo, y 9,3 U / L (NI y suero) en el ICA-PEP ensayo. En el 7 º día después del primer ciclo de quimioterapia es la masa palpable, pero ya no es visible, y hPLAP / PLAP-al igual que la actividad en suero fue de 5,7 U / L (NI) y 5,6 U / L (I), respectivamente, en el ICA - PLAP ensayo, y 5,7 U / L (NI) y 5,3 U / L (I) en el ICA-PEP ensayo. En la 14 ª día después de primer ciclo de quimioterapia la masa abdominal palpable no era más y hPLAP / PLAP-al igual que la actividad en suero fue 0,23 U / L (NI) y 0,25 U / L (I), respectivamente, en el ICA-PLAP ensayo Y 0,25 U / L (NI y yo) en el ICA-PEP ensayo. Cuarenta y dos días después de iniciar la quimioterapia una tomografía computarizada mostró pruebas de regresión completa del tumor, y la hPLAP / PLAP-como actividad de la enzima en el suero se mantuvo estable; exhibiendo 0,22 U / L (NI) y 0,20 U / L (I), respectivamente, para ICA-PLAP, y 0,23 U / L (NI) y 0,22 U / L (I) de ICA-PEP. hPLAP / PLAP-como actividad de la enzima en el suero fue indetectable, 210 días después de la iniciación de la quimioterapia (Figura 3]. Después de 4 ciclos de quimioterapia (ifosfamide/CDDP/VP16) regresión completa del tumor fue confirmada mediante análisis de imagen, la cirugía exploratoria, y el análisis histológico.

DISCUSIÓN

Inmunoensayos para hPLAP utilizando monoclonales o anticuerpos policlonales en general no distinguen PLAP de PLAP-como las enzimas, debido a la alta homología entre estas isoformas [6]. Anticuerpos policlonales contra las PLAP Mayo una reacción cruzada con IAP [29, 49], pero esto puede ser minimizado por la inactivación de suero de calor. Los anticuerpos monoclonales pueden no detectar hPLAP / PLAP-al igual que la actividad enzimática el epítopo si no está presente en las proteínas polimórficas [7, 45, 46]. La enzima es hPLAP más polimórficos (al menos 48 fenotipos) que la PLAP-al igual que la enzima (10 fenotipos) [8, 9, 11, 12].

Dos costo-efectivas, concretas, sensibles y se han desarrollado inmunoensayos para determinar hPLAP / PLAP-al igual que la actividad enzimática. Dos anticuerpos policlonales fueron seleccionados por cromatografía de afinidad; un PLAP Ab-que es capaz de reconocer la mayoría de PLAP / PLAP-como epítopos que no son reconocidos por los anticuerpos monoclonales, y un segundo anticuerpo (PEP-Ab) utilizados en la zona controlada por Israel-que reconoce PEP 57-71 aa la secuencia de hPLAP. PLAP / PLAP-como actividad determinada por PLAP-Ab fue, como era de esperar, inferior a PEP-Ab, lo que sugiere que el segundo anticuerpo monoclonal puede presentar características. Una sustitución de 1 de aminoácidos en un antígeno puede modificar el anticuerpo vinculante actividades [28]. El péptido sintético utilizado en este estudio difiere en 3 aminoácidos de IAP y 9 aminoácidos de TNAP [6], y tenía 15 residuos de aminoácidos (el mínimo necesario para construir un epítopo, que puede comprender 15-22 residuos de aminoácidos [50] ), Lo que sugiere que PEP-Ab reconoce PLAP epítopo específico (s).

La sensibilidad para ambos PLAP ICA-ICA-y los ensayos de PEP fue de 0,1 U / L; similares a las observaciones en los estudios que utilizan anti-hPLAP anticuerpos monoclonales [31, 51]. Reactividad cruzada fue observada por los altos niveles de IAP (27,5 U / L y 55 U / L) en la zona controlada por Israel y PLAP-ICA-PEP ensayos, respectivamente. Esta interferencia puede ser abolido cuando IAP se inactiva por calentamiento. El ICA y PLAP-ICA-PEP ensayos fueron altamente correlacionados (r = 0,94). El ICA-PLAP ensayo es menos específico, sino más rentable que ICA-PEP. Aunque ICA-PEP fue capaz de reconocer similar PLAP / PLAP-al igual que la actividad en calefacción y sin calefacción muestras, ICA-PLAP revelaría otras PLAP / PLAP fenotipos similares en las muestras sin calefacción. Tomados en conjunto, una combinación de ensayo utilizando cada uno de los anticuerpos puede minimizar el inconveniente del uso de anticuerpos monoclonales y policlonales. Por ejemplo, hPLAP / PLAP-al igual que la actividad en muestras de suero sin calefacción a partir del 5 de los no fumadores se encontró ligeramente por encima (≤ 0,6 U / L), valor de corte (0,2 U / L) sólo en el ICA-PLAP ensayo, lo que sugiere que estos resultados se debieron a reacción cruzada con el IAP, tal como se describe en otros estudios [29, 49]. IAP actividad en el suero está relacionada con la dieta y el grupo sanguíneo estado [52].

Nuestros datos muestran que el valor normal en suero para PLAP / PLAP-al igual que la actividad enzimática en adultos no fumadores es de alrededor de 0,2 U / L. Una distribución normal de Gauss hPLAP / PLAP-al igual que la actividad enzimática no se observó en el suero de individuos sanos que fumaban. Esa heterogeneidad entre estas personas y la consiguiente elevada desviación estándar de los valores medios se han notificado en estudios anteriores [39, 51]. En la literatura, PLAP actividad en el tejido pulmonar se informó de que se corresponda con PLAP actividad en la placenta, mientras que PLAP en el suero de los fumadores se informó como PLAP-al igual que la actividad [21, 51]; esta discrepancia no está bien entendido. La propuesta de corte correspondiente a hPLAP / PLAP-al igual que los resultados en el suero de fumadores sin cáncer en este estudio fue de 0,4 U / L, sin embargo, esto debe ser evaluado con la mejor serie de muestreo y, si bien teniendo en cuenta el estado clínico del individuo. PLAP / PLAP-al igual que mide la actividad enzimática en el suero de fumadores probablemente se origina en los pulmones (pneumocytes), donde el daño celular causado por el humo del cigarrillo pueden liberar PLAP-al igual que las enzimas en la sangre [21, 39], posiblemente de forma proporcional a la duración y intensidad del consumo de tabaco [39, 53].

PLAP actividad en muestras de suero de pacientes embarazadas medido por el ICA y PLAP-ICA-PEP ensayos no mostraron diferencias entre inactivadas por calor y noninactivated muestras, indicando que la proteína circulante se debe principalmente PLAP liberada por la placenta. Como era de esperar, hPLAP actividad aumentó linealmente con el avance del embarazo, ya que la placenta produce sinciciotrofoblasto PLAP alto nivel durante la 27 a 37a semanas de gestación. Esta relación sugiere que la vigilancia de hPLAP actividad podría ser utilizado como una herramienta adicional para evaluar la viabilidad placenta.

Desde PLAP / PLAP-al igual que la actividad podría ser detectada en niveles muy bajos en las primeras etapas del embarazo y el hábito de fumar en los individuos, los países desarrollados ensayos también podría ser utilizada para detectar PLAP / PLAP-al igual que la actividad en el suero de pacientes con cáncer. De hecho, este inmunoensayo era posible y muy útil en el seguimiento de un joven paciente con carcinoma embrionario. Tras el primer ciclo de quimioterapia, PLAP / PLAP-como actividad sérica disminuyeron en proporción al tamaño del tumor. Esto sugiere que el inmunoensayo de PLAP / PLAP-como actividad sérica puede ser un buen marcador para supervisar la respuesta a la quimioterapia o la eventual recurrencia del cáncer, minimizando la necesidad de exhaustivos análisis de imágenes. A fin de validar PLAP / PLAP-como actividad sérica como marcador tumoral, más muestras de suero de pacientes con cáncer son necesarias. Como se ha informado por otros autores, el aumento de los niveles de PLAP / PLAP-como se observó en 2 pacientes con seminoma testicular recurrentes 2 meses antes de la detección de tomografía computarizada [42]. El intervalo más largo entre el aumento de los niveles de PLAP / PLAP-como el cáncer y la posterior detección por análisis de imagen fue de 2 años en una mujer con un pequeño cáncer de ovario [54]. Determinación de PLAP / PLAP-como actividad utilizando inmunoensayos podría ser especialmente útil para el suero de pacientes con cáncer testicular y carcinomas de ovario, como es el caso de los marcadores más sensibles, tales como CA 125 y AFP. De hecho, PLAP / PLAP-al igual que la actividad parece ser más específico que CA 125 y AFP [31]. HCG y AFP se utilizan como marcadores tumorales para el cáncer testicular nonseminomatous, pero PLAP / PLAP-al igual que la actividad es el mejor marcador tumoral para el seguimiento de los pacientes con seminomas [39].

El ICA y PLAP-ICA-PEP inmunoensayos se podrían explorar para detectar hPLAP / PLAP-al igual que la actividad por encima de 0,2 U / L (valor de corte en los adultos) y fisiológico en condiciones patológicas, especialmente en pacientes con cáncer embrional o de otros tipos de cáncer en otros estudios (testículo, ovario, pulmón, colon y tracto). Por otra parte, se puede concluir que ICA-PEP ensayo es más específico que ICA-PLAP, que sigue siendo útil para detectar otros PLAP / PLAP-como fenotipos que eventualmente puede no ser detectado por el ICA-PEP. Calefacción inactivación de las muestras pueden eliminar IAP y otras actividad de la fosfatasa alcalina y, finalmente, también disminuirá PLAP / PLAP-como actividad, pero este efecto indeseado puede ser confirmada por pruebas de las muestras sin calefacción en el ICA-PEP ensayo.

Este estudio fue apoyado por la Fundação Araucária-PR (Grant # 2648) y CAPES-COFECUB. Fondos adicionales provinieron de los sirio libaneses en América Asociado Caridades (ALSAC), Memphis, Tenn, y de la NIH / NCMHD Grant 9T37MD001378-04 (MHIRT). Estamos agradecidos al Dr Luiz Juliano Neto, Laboratorio de Biofísica de la UNIFESP (São Paulo, Brasil), para el suministro de péptidos sintéticos.