Journal of Biomedicine and Biotechnology, 2006; 2006: (más artículos en esta revista)

Notas esenciales relativos al diseño funcional de siRNAs eficaz para mamíferos RNAi

Hindawi Publishing Corporation
Kumiko Ui-Tei [1], Yuki Naito [2], Kaoru Saigo [2]

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Resumen

Breve RNAs de interferencia (siRNAs) se utilizan ampliamente para lograr la interferencia por ARN (RNAi) en células de mamífero. Numerosos siRNAs puede estar diseñado para cualquier objetivo de genes, aunque la mayoría de los cuales sería incapaz de inducir de manera eficiente mamíferos RNAi. Algunos altamente funcional diseñado para siRNAs knockout de un gen pueden hacer que no guardan relación nonfunctional genes endógenos. Estos cuellos de botella importantes deben ser debidamente eliminado cuando RNAi tecnologías se emplean para cualquier experimento de mamíferos en la genómica funcional. En este trabajo se presenta por lo tanto, esencial notas y conclusiones respecto de la correcta elección de siRNA-secuencia de selección de algoritmos y basadas en la Web en Internet sistemas de software.

INTRODUCCIÓN

Interferencia por ARN (RNAi) es el proceso de secuencia de nucleótidos específicos de post-transcripcional silenciamiento génico [1 - 5]. En el caso de eucariotas inferiores como Drosophila y Caenorhabditis elegans, a largo dsRNA puede utilizarse como inductor RNAi [6 - 15], mientras que, posiblemente debido a la respuesta de interferón [16 - 20], ARN corto de interferencia (siRNA), un Dicer producto de la digestión dsRNA largo, se utiliza ampliamente para eliminar las genes de mamíferos a través de RNAi [21 - 23]. Interferón respuesta se puede lograr incluso transfección de siRNA [24 - 28] y puede ser permitido en la mayoría de los experimentos de células cultivadas, en la que siRNA concentración es igual o inferior a 100 nm [29]. En aplicación terapéutica, bajo siRNA dependientes interferón respuesta sería un motivo de preocupación [17, 18].

Teóricamente, (n-20) siRNAs dirigidos por un gen n bp de longitud se pueden diseñar. En Drosophila, más del 90% de estos siRNAs son capaces de reducir la actividad de los genes objetivo de más del 80% [29]. El diseño de siRNAs en el caso de Drosophila, así como otros eucariotas inferiores, por lo tanto no implica ninguna dificultad real. Sin embargo, aproximadamente el 80% de teoría designable siRNAs no sería muy funcional en el caso de mamíferos RNAi [29, 30]. Con determinados genes rica en GC, nonfunctional siRNAs puede aumentar en un 95% o más del total designable siRNAs [YN et al, inédito].

SiRNA coincidentes en ocasiones puede inactivar los genes que no sea el objetivo, un efecto secundario indeseado de la designada como "fuera de la meta efecto" [31, 32]. Las bases moleculares de este Queda por aclarar [33] aunque mRNA división, el punto culminante de la RNAi reacción [34 - 38], requiere una casi estricta secuencia de nucleótidos de identidad entre la porción de ARNm objetivo y el sentido capítulo (SS) de siRNA [33 , 39]. Así, al menos una fracción de siRNAs indeseables, dando lugar a la meta fuera de efecto a través de la desestabilización de mRNAs que no sea el objetivo, puede ser eliminado por ordenador basada en la búsqueda de homología [40 - 45].

En el diseño de siRNAs altamente funcional para mamíferos RNAi, secuencia de condiciones adecuadas o buenas algoritmos para la selección de siRNAs muy funcional y bien los programas informáticos adecuados para el genoma en todo el corto de homología de secuencia de búsqueda para reducir al mínimo la meta fuera de efecto son indispensables.

Demasiados sitios web están disponibles para funcional siRNA búsqueda de mamíferos como RNAi en parte enumeradas en la tabla 1. Estos sitios web pueden incorporar uno o varios algoritmos para la selección funcional siRNA previamente determinadas sobre la base de datos de validación biológica. Considerable de mamíferos RNAi datos están actualmente disponibles a fin de que, en algunos sitios web, los algoritmos originales pueden haber sido sustituidos con los modificados para ser más eficaz aún no aparecen en las revistas científicas, lo que hace difícil la evaluación de cada uno de los sitio web de fiabilidad. En consecuencia, el presente estudio se dirige a la atención básica de marcos y algunos problemas relacionados con la aplicación de algoritmos para la selección de siRNAs altamente funcional.

RNAi para inducir la actividad como una propiedad intrínseca de la secuencia de siRNA

RNAi actividad inducida en células de mamíferos depende en gran medida de la particular secuencia de siRNA utilizados [29, 30] y pueden variar dependiendo de la transfectadas tipos de células o transfección eficiencia. Para examinar estos factores, varios siRNAs dirigidos por el firefly luciferase genes (LUC) fueron sintetizados y transfectadas con luc codificación de ADN plásmido en una variedad de líneas de células de mamíferos, que incluyen humano HeLa, HEK293, y colo205, hámster chino CHO-K1, y E14TG2A ratón células madre embrionarias [55]. La concentración de siRNA se utilizan en estos experimentos fue 5-50 nM. siRNA que dependen de RNAi actividad fue examinado también en embriones de pollo [29]. La eficiencia de transfección colo205 es bastante baja y cerca de 1 / 100 veces más alto que el de HeLa [55]. Ni diferencia de las especies animales de que las líneas celulares o embriones se obtuvieron ni que la eficiencia en transfección tenido ningún efecto significativo sobre la actividad inducida por RNAi [29, 55]. RNAi actividad inducida en los mamíferos y las células de pollo a siRNA transfección puede ser determinada principalmente por la transfectadas propias secuencias siRNA en la medida de lo RNAi debido a 10-50 nM siRNA se refiere.

Tres algoritmos básicos para la selección de siRNAs funcional basado en la validación biológica

Muchos experimentos se han llevado a cabo para aclarar la secuencia posible de las necesidades funcionales de siRNAs RNAi mamíferos [29, 56 - 61]. Sólo tres algoritmos representante, que puede utilizarse ampliamente para funcional siRNA búsqueda de mamíferos RNAi, se presentan y discuten en los siguientes.

Algoritmo 1. Este algoritmo fue desarrollado por Ui-Tei et al [29]. Como se muestra en la Figura 1 (a1], todos los siRNAs que reúnan las siguientes cuatro condiciones secuencia se definen como clase I siRNAs en Algoritmo 1: (1) el 5 '-capítulo antisentido (AS) final, o una U, (2) el 5 'SS final, G o C, (3), el 5'-terminal de una tercera parte de AS, A / U-ricos, y (4) una larga G / C tramo, ausente de la 5'-terminal de las dos terceras partes de SS . Validación de datos obtenidos mediante luc como objetivo indicado de todos los 40 de clase I siRNAs arbitrariamente elegido para ser capaces de reducir la actividad de los genes objetivo de más del 70% [29]. RNAi Todos los experimentos se llevaron a cabo en el 50 nM siRNA.

Algoritmo 1 siRNAs con características totalmente contrario a los de clase I con excepción de siRNAs condición (4) se definen como de clase III siRNAs (Figura 1 (a2)]. Validación indicó que todos los 15 de clase III siRNAs arbitrariamente elegidos no son capaces de inducir eficiente de mamíferos RNAi [29]. De este modo, la mayoría, si no todos, clase I siRNAs posiblemente servir como siRNAs altamente funcional en células de mamífero. Clase III siRNAs son casi incapaces de inducir eficaz de mamíferos RNAi. Con la luc, el número total de, teóricamente, es designable siRNAs y 1.631 clase I siRNAs representan alrededor del 17%, lo que es más o menos idéntico al porcentaje (25%) de siRNAs altamente funcional estimada sobre la base de datos de validación [29], clase I siRNAs puede, pues, constituyen la mayoría, si no todos, de siRNAs altamente funcional en mamíferos RNAi.

Algoritmo 2. Este algoritmo fue propuesto por Reynolds et al [59, Figura 1B] que llevaron a cabo análisis de 180 siRNAs dirigidos mRNA de dos genes y encontraron las siguientes características asociadas con la funcionalidad de siRNA: bajo G / C de contenido, la preferencia por la estabilidad interna de baja a la 3 '-Término de la SS, y la ausencia de repeticiones invertida. Por otra parte, SS se presume que utilizar de preferencia A, U, y un SS en las posiciones 3, 10 y 19, respectivamente. El 5 'AS terminal no debe ser G / C. G pueden no estar presentes en la posición 13 (Figura 1 (b)]. En más de la mitad de la clase I, siRNAs, no hay base de las preferencias en la posición 3 y 10 [29, 55], a fin de que Algoritmos 1 y 2, respectivamente, pueden predecir considerablemente diferentes conjuntos de siRNA a ser funcionales.

Algoritmo 3. Este algoritmo fue propuesto por Amarzguioui y Prydz [60] que llevó a cabo el análisis estadístico en 46 siRNAs y encontró Algoritmo 3 a exigir las siguientes características funcionales de siRNAs. El 5 'AS terminal y su pareja son SS A / U y el 5' SS y su término como socio, G / C. Una combinación frente a la terminal de bases puede dar lugar a la falta de funcionalidad. Estos autores también encontraron que existe una asimetría en siRNA duplex fin la estabilidad, es decir, la A / U contenido diferenciado para los tres nucleótidos terminales en ambos extremos de los dúplex pueden considerarse esenciales para la funcionalidad de siRNA. Por otra parte, señalaron que prefieren una posición de 6 funcional siRNAs (Figura 1 (c)], aunque sólo una pequeña fracción de la clase I, siRNAs se asocia con una posición en SS 6 [29].

Para examinar en mayor detalle, las relaciones entre los tres algoritmos, que el porcentaje de siRNAs considerarse funcional de Algoritmo 1 (clase I) puede ser funcional como repredicted Algoritmos de 2 o 3 o viceversa, se determinó (ver [55, Figura 1D] . Sobre la base de los tres algoritmos, el total de secuencias de siRNA posible (4,4 × 10 7) diseñada utilizando secuencias RefSeq humano (versión 11) se encontraron nonfunctional por tanto como un 73%. Clase I siRNAs constituyen el 14% del total teóricamente previsible siRNAs , Mientras que los Algoritmos 2 y 3, respectivamente, predecir el 10 y el 20% como funcional siRNAs. Casi el 90% de la clase I, siRNAs podría ser funcional repredicted como Algoritmo de 2 o 3, o ambas cosas. Ochenta cuatro por ciento de siRNAs simultáneamente predecirse como funcional de Algoritmos 2 y 3 podrían ser repredicted o como clase funcional I de siRNAs Algoritmo 1. Más del 50% de siRNAs predecirse como funcional de Algoritmo 2 no se puede predecir a ser funcionales de Algoritmo 3. Setenta y siete por ciento de Algoritmo 3 funcional siRNAs no se puede repredicted como funcional de Algoritmo 2. Estos resultados pueden indicar que el algoritmo 1 es capaz de predecir la funcionalidad de siRNAs más confiabilidad que Algoritmos 2 o 3.

Algoritmo para la adaptación a corto las secuencias de nucleótidos

La rápida comparación de homología de las secuencias de todo el ARNm con siRNA AS / SS secuencias es indispensable para la identificación fuera de genes objetivo. BLAST [62] no puede ser un buen software para hacer esa comparación, ya que un número de plantas fuera de objetivo candidatos se pasan por alto y también un tiempo considerable se requiere para BLAST basada en el cálculo. El Smith-Waterman local alineación algoritmo [63] es correcta pero el tiempo que consume a ejecutar. Recientemente, Yamada y Morishita han desarrollado una muy rápida y precisa alineación algoritmo de secuencias cortas de nucleótidos [41] y este software es capaz de procesar 60 millones de siRNA de 21 secuencias de nucleótidos de longitud en 10 horas cuando se ejecuta en paralelo en diez PCs de bajo costo. El hardware de Snøve Jr y Holen [64] proporciona un rendimiento similar, aunque el número de unidades de procesamiento no está claramente especificado. Páginas web utilizando el Yamada-Morishita software o hardware de Snøve Jr Holen y por lo tanto, debe resultar mucho más rápido y fiable en comparación con BLAST.

La base desajuste introducción estudios indican que transfectadas siRNAs ocasionalmente causa phosphodiester división de bonos-no sólo de los auténticos destinatarios del mRNA mutado, sino también los objetivos con 1-2 base desajustes [33, 39]. Pero mutado objetivos con tres o más desajustes no podrá someterse división de la transfección de siRNA mismo [YN et al, inédito]. siRNAs menos de 84 (16/19 × 100)% de homología en la secuencia a cualquier parte del total de mRNAs que no sea el objetivo debe ser utilizado para RNAi, lo que reduciría el número de siRNAs funcional a 1 / 10 de la entrada. Es decir, sólo el 10% de la clase I siRNAs o inferior al 2% del total de siRNAs teóricamente utilizando designable humanos-Ref Seq secuencias que se disponga de mamíferos RNAi en cuando fuera de la meta debido a los efectos del mRNA destability se consideran. Computacional análisis indica que, incluso tan pocos disponibles siRNAs, por lo menos una clase funcional I siRNA puede ser asignado a más de un 99% de las secuencias de ARNm humanos (RefSeq secuencias) [YN et al, inédito].

miRNAs que participan en posttranscriptional silenciamiento génico de traducción a través de la regulación [65 - 73] poseen menos de homología con el objetivo, lo que indica siRNAs con menor homología en algunos casos, posiblemente, a participar en algunos fuera de objetivo reacciones [74]. La eliminación de un gran número de siRNA con baja homología de mRNAs que no sea el objetivo del genoma pueden llevar a que toda la silenciamiento de los genes en células de mamífero bastante difícil. El uso simultáneo de unos pocos a varios siRNAs dirigidos por un mismo gen (gen meta) puede eventualmente solucionar este problema, ya que en la mayoría de los casos, fuera de los objetivos objetivo no sería idéntico a los demás [31, 32].

Posiblemente los parámetros experimentales que afectan a la funcionalidad de siRNAs

siRNA mediada por RNAi actividad pueden variar considerablemente en función de no sólo la particular secuencia de siRNA, sino también parámetros como la concentración de siRNA, siRNA duración de la exposición y, posiblemente, objetivo mRNA concentración y estructura secundaria dentro de las células [29, 75]. Funcional siRNAs en algunos casos han sido encontrados para inducir la máxima actividad RNAi 1 día después de transfección, mientras que otros siRNAs para expresar la máxima actividad en 2 o 3 días después de transfección. Por lo general, funcionales de siRNA que dependen de RNAi persiste 1-2 semanas, mientras que prácticamente no RNAi es inducida dentro de las células, incluso después de una larga incubación con nonfunctional siRNAs. Clase I siRNAs, capaces de inducir altamente funcional RNAi cuando transfectadas a 50 nm, son considerablemente heterogéneo en la capacidad de lograr la RNAi que se utilizan para el día 1-transfección a la concentración de 50 horas (ver [29] de Ui-Tei et al) . La reducción de la actividad de los genes objetivo varió del 20 al 60% dependiendo de las secuencias de clase I utilizados siRNAs. Por lo tanto, secuencia adicional, posiblemente, las condiciones pueden ser encontrados a fin de definir una subclase de la clase I, con más funcionalidad, pero en ese caso, casi completa del genoma en todo el silenciamiento génico ya no podría ser posible.

Recientemente, Kim et al [76] mostró que un 27 bp dsRNA largo con extremos romos es mucho mayor en la funcionalidad de más de 21 bp largo siRNA y sugirió que a corto Dicer sustrato dsRNA en general puede ser mucho más funcional en comparación con el auténtico siRNAs 21 bp de largo. Sin embargo, posteriormente se comprobó que esto no es una característica general de 27 bp largo bluntended dsRNA [77]. A falta de 3 'sobreendeudamiento, Dicer dsRNA digiere sin control, lo que genera muchos productos que varían en longitud, la mayoría de los cuales pueden no ser tan funcional como 21 bp largo altamente funcional siRNAs [77]. RNAi para inducir la actividad, por lo tanto parece depender principalmente a la presencia de considerables altamente funcional siRNAs en la digestión para que los productos y, en consecuencia, el 27 bp largo romo-end dsRNA no sería necesariamente una buena opción para RNAi altamente eficiente.

siRNA-OLIGOMER DEPENDIENTE RNAi en células de mamífero

Long dsRNA en posesión de 2-nucleótidos 3 'domina en ambos extremos es exfoliados de Dicer de esos fines para generar siRNAs haber definido las secuencias de nucleótidos [28, 77 - 80]. De este modo, en caso de que casi todos los siRNAs producido por la digestión Dicer pertenecen a la clase I y la respuesta de interferón debido a dsRNAs de longitud equivalente a siRNA oligómeros no ser significativo, la inducción de múltiples eficaz-gen knockout en células de mamífero puede ocurrir con transfección de siRNA y oligómeros esto se ha descubierto recientemente a ser el caso [28]. A través de la utilización de la clase-I-siRNA oligómeros múltiples meta-gen knockout fue demostrado claramente que tendrá lugar.

ADN / shRNA mediada por RNAi

RNAi puede ser inducido mediante la introducción de la codificación de ADN tanto SS y AS de siRNA en células de mamífero. Tanto la RNA polimerasa II y III promotores, respectivamente, se utilizan para expresar corto horquilla RNA (shRNA) y ya ARN shRNA secuencia incluida en el medio [81 - 90]. El principal transcripción de la RNA polimerasa III es una mezcla de shRNAs con dos o varios consecutivos de la U en su 3 'sobreendeudamiento [81 - 88]. Dicer división de sitios shRNAs variar dependiendo de la longitud de 3 'domina [89] y, en consecuencia, varias especies diferentes de siRNAs se espera que sean generados a partir de shRNAs transcritas por la polimerasa III [88]. De este modo, la presencia de siRNAs altamente funcional en la digestión Dicer estos productos se requiere para el éxito de RNAi debido a la polimerasa-III-sistema. Además, cuatro de la U de A, o no debe incluirse en la nonoverhang secuencias de AS y SS, respectivamente, ya que estas secuencias de estimular la terminación prematura de la polimerasa-III-dependiente de transcripción [88].

En la polimerasa II impulsado por sistemas de expresión, que es el principal transcripción es larga polyadenylated RNA (PRI-al igual que los genes miARN-RNA), que es reconocido y exfoliados por el complejo nuclear de microprocesadores [91, 92]. Este complejo contiene Drosha, una RNasa III de tipo RNasa que cleaves la pri-genes miARN-ARN como para generar shRNA con un 2-nucleótidos 3 'pendiente [93]. El shRNA así producido se convierte principalmente a la superposición de dos siRNAs a través de la digestión Dicer (ver [28]], lo que indica que el éxito de RNAi se requiere la participación de siRNAs altamente funcional siRNA en estos productos.

Posibles bases moleculares de la secuencia asimétrica en los requisitos funcionales siRNAs

Cada Argonaute proteínas de mamíferos (eIF2Cs) está formado por un motivo PRP y dos dominios: Paz y PIWI [94]. Análisis estructural de los cristales de proteína Argonaute de Pyrococcus farious indicó que el dominio ha PIWI básicamente la misma estructura tridimensional como ribonucleasa H Argonaute y que pueden funcionar como un SLICER de ARNm [95]. PAZ y PIWI dominios puede reconocer por separado dos extremos de siRNA. La estructura cristalina del dominio de PAZ humanos Argonaute 1 sugiere que la PAZ dominio está anclada a la de 2 de nucleótidos 3 'sobreendeudamiento de los siRNA dúplex [96]. El dominio de PIWI Archaeoglobus fulgidus contiene un metal altamente conservadas-lugar de unión que pueden reconocer los 5 'de nucleótidos a partir de siRNA de un modo que no depende de la secuencia [97].

Algoritmos 1 y 3 predecir funcional siRNAs a poseer A / U y G / C en el 5 'AS y SS termina, respectivamente [29, 55, 60]. La GC par es termodinámicamente mucho más estable que el Au Pair y por lo tanto, las diferencias en la estabilidad en el terminal de base par el siRNA dúplex puede determinar la secuencia terminal de preferencia en muy funcional y nonfunctional siRNAs, muy probablemente por estimular asimétrica vinculante de PIWI y PAZ para dominios siRNA extremos.

El 5'-terminal de un tercio de AS de clase funcional I siRNAs es A / U-rico, posiblemente debido a siRNA preferible anulación de su AS fin [29, 56]. Un solo paso la función motora de la helicasa putativo siRNA Mayo descansar varios pares de bases de la A / U-ricos siRNA fin de estimular la formación de activos RISC que carecen de SS de siRNA. En caso de que este sea el caso, la introducción de base desajustes en la 3'-terminal de tercera SS de siRNA podrían aumentar notablemente la actividad inducida por RNAi. Los estudios con Drosophila extractos mostraron una importante base de desajuste que dependen de aumento en RISC formación [56]. Sin embargo, hasta la fecha no hay datos que confirman claramente presente en células de mamíferos cultivadas experimentos. Recientemente, una parte de RISC ha demostrado ser activado a través de división de la SS de siRNA en su centro [98]. La presencia de base de desajustes en la SS podría ser desfavorable a SS división y este efecto negativo podría prevenir en parte siRNA de ser desenrollada.

Este trabajo fue parcialmente apoyado por el Fondo Especial de Coordinación para la Promoción de Ciencia y Tecnología a KS, y subvenciones de los Ministerios de Educación, Cultura, Deportes, Ciencia y Tecnología de Japón a KS y K UT.