Journal of Biomedicine and Biotechnology, 2006; 2006: (más artículos en esta revista)

Prion de proteínas celulares y Caveolin-1 interacción neuronal en una línea celular precede Fyn / Erk 1 / 2 de transducción de señales

Hindawi Publishing Corporation
Mattia Toni [1], Enzo Spisni [1], Cristiana Griffoni [1], Spartaco Santi [2], Massimo Riccio [2], Patrizia Lenaz [1], Vittorio Tomasi [1]

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Resumen

Se ha informado de que la proteína prión celular (PrPc) se ha enriquecido en caveolae o caveolae-al igual que los dominios con caveolin-1 (CAV-1) que participan a eventos de transducción de señales de cinasa Fyn contratación. Mediante el uso de la Glutatión S-transferasa (GST) de proteínas de fusión de ensayo, se observó que PrPc firmemente interactúa in vitro con Cav-1. Por lo tanto, determinó la PrPc caveolar localización en un neuronal hipotalámico línea celular (GN11), por análisis de microscopía confocal, la flotación en gradiente de densidad, y coimmunoprecipitation experimentos. A raíz de la lucha contra la PrPc de anticuerpos mediada por la estimulación de las células vivas GN11, se observó que PrPc agrupan en dominios de membrana plasmática ricos en Cav-1 en el que convergieron quinasa Fyn para ser activado. Después de estos acontecimientos, una cascada de señalización a través de p42/44 MAP quinasa (Erk 1 / 2) tuvo su origen, lo que sugiere que, a raíz de las translocaciones de balsas a caveolae o caveolaelike dominios PrPc pueden interactuar con Cav-1 e inducir la transducción de señales.

INTRODUCCIÓN

Multiproteic caveolar complejos representan una sofisticada organización de membrana que participan en la transducción de señales. Su eficiencia está vinculada a la inserción de proteínas en una membrana de la zona restringida (50-100 nm), donde la generación de una señal vectorial tiene una característica y orientado y permite el reclutamiento de baja abundancia de proteínas con el fin de activar vías de señalización que, en células neuronales, parece que el control de la diferenciación y supervivencia celular [1 - 4]. Caveolae son una subclase de membrana microdomains distingue por su forma (son frasco-como invaginations) y por la presencia de proteínas de la membrana de la caveolin familia. Caveolin-1 (CAV-1) es un pequeño 22 kDa proteína altamente versátil, capaz de organizar varios caveolar funciones. Lisanti y compañeros de trabajo han mapeado precisamente la definición de la molécula de dos sitios que participan en la unión de caveolar mandantes: a región hidrofóbica (aa 82-101) llamado andamios de dominio (SD), y amore hidrófilo motivo presente en el C-terminal región indicado como motivo CID [5].

La proteína prión celular (PrPc) es una proteína secretada anclado a la superficie celular a través de un índice de anclaje y cree que funcionar como un receptor de superficie celular [6] o ligando [7, 8]. PrPc se caracteriza por un amino terminal no estructurados altamente flexible región caracterizada por la presencia de múltiples octapeptide repite altamente conservadas durante la evolución que son sitios de unión para los iones de cobre [9]. En células de neuroblastoma falta caveolae, PrPc se ha aislado en insoluble en detergente complejos denominados "caveolae-al igual que los dominios" (CLDs) y ha sido la hipótesis de que la conversión PrPc en su conformer PrP patológica tembladera (PrPsc) se produce en este compartimento subcelular [10, 11]. Los datos recientes obtenidos por microscopía electrónica en las células CHO confirmado claramente que PrPc es internalizado por caveolae [12]. Por otra parte, se ha observado que Cav-1 es coimmunoprecipitated de PrPc utilizando anticuerpos y que Cav-1 media el reclutamiento y la activación de Fyn quinasa después de PrPc anti-anticuerpos mediada por la estimulación [13, 14]. Prueba el apoyo de un papel de la PrPc en la regulación de la proliferación celular, la diferenciación y la supervivencia se ha reunido [15].

Fyn quinasa es miembro de la familia quinasa Src implicados en la transducción de señales. Se ha informado de que durante quinasa Fyn transducción de señales es noncovalently eventos relacionados con glycosylphosphatidylinositol (GPI)-anclada proteínas [16 - 18] y que quinasa Fyn, después de la palmitoylation de su Cys3, se incluye en caveolae [19]. Por otra parte, Se ha demostrado que, a raíz de anticuerpos mediada por la vinculación intersectorial, GPI-anclado dar lugar a proteínas de transducción de señales en los acontecimientos células T, células B, monocitos, granulocitos y [20] y que son secuestradas en caveolae [21].

Erk 1 / 2 ha sido intensamente estudiada en las neuronas debido a su participación en el hipocampo mecanismos que llevan al aprendizaje y la memoria de consolidación [22]. Caveolae desempeñar un papel importante en Erk 1 / 2 reglamento. De hecho, se ha informado de que Erk 1 / 2 está compartimentado en caveolae [23, 24] y que Cav-1 puede inhibir Erk 1 / 2 la actividad [25 - 29]. Curiosamente, se ha informado de que una relación recíproca entre Cav-1 y Erk 1 / 2 como la activación de la MAP quinasa p42/44 cascada hace que el downregulation de Cav-1 de expresión [30]. Por otra parte, el papel de la PrPc en Erk 1 / 2 activación ha sido analizado [14, 31, 32].

Los resultados aquí presentados demuestran que PrPc y Cav-1 in vitro interactuar y colocalize en GN11 células, un neuronal hipotalámico línea celular que expresa muy Cav-1 gene.Moreover, hemos examinado el papel desempeñado por caveolae y PrPc en la transducción de señales de las células transfecting GN11 con un nuevo vector PrPcexpressing mostrando una transfección de alta eficiencia, con el fin de comparar Fyn y Erk 1 / 2 quinasas actividad en wildtype y PrPc-overexpressing células. Nuestros resultados ponen de manifiesto el papel clave de caveolae sofisticados como microambientes PrPc en la que las agrupaciones de generar vías de transducción de señales.

MATERIAL Y MÉTODOS
Los anticuerpos utilizados

Anti-PrPc anticuerpos monoclonales (MAB) 3F4 (Western Blot (WB) 1: 3000; inmunofluorescencia (IF) 1: 50; DakoCytomation, Dinamarca); antimurine PrP-Nterminus antisuero policlonal Ab Tg (amablemente proporcionados por el Dr T. Yokoyama, Japón [33]], anti-humano PrP-C terminal anticuerpo policlonal de cabra (Pab) C-20 (Santa Cruz de Biotecnología, EE.UU.); antihuman DOPPEL proteína recombinante (hurDpl) Pab Q55 (BM 1: 100); Mab DPL 79 ( amablemente proporcionados por el Dr J. Grassi, Comisaría a l'Energie Atomique / Saclay, Francia); anti-Cav-1 Pab (BM 1: 5000; SI 1: 100; BD Biosciences, EE.UU.), anti-Cav-1-FITC conjugado de anticuerpos (IF 1: 50; Santa Cruz Biotecnología, EE.UU.), antihaemagglutinin (HA)-epítopo Pab (BD Biosciences, EE.UU.); anti-quinasa Fyn Pab (IF 1: 100; Santa Cruz Biotecnología, EE.UU.), anti-fosfato - Src familia (Tyr416) Pab (IF 1: 200; Señalización Celular, EE.UU.), anti-fosfato Erk1 / 2 Mab (BM 1: 1000; Señalización Celular, EE.UU.); anti - β ~ Pab-actina (BM 1: 1200; Sigma, EE.UU.), secundario anti-ratón-FITC o Cy3 y conjugado con anticuerpos (IF 1: 50, Sigma, EE.UU.); anti-conejo conjugada con Cy5 burro Ab F (ab ') 2 fragmento (IF 1: 50, Jackson, EE.UU.); anti-ratón y anti-conejo secundaria peroxidasa de rábano (HRP) y conjugado con anticuerpos (BM 1: 1000, Santa Cruz Biotechnology, EE.UU.). Los anticuerpos fueron diluidos en PBS-BSA 3% o 5% en leche sin grasa en polvo-TBS-Tween de amortiguación, ya que si el Banco Mundial o los experimentos, respectivamente. Para vivir la estimulación de células que los anticuerpos fueron utilizados en la dilución de 1: 100 en DMEM complementado con un 10% de FCS.

Plásmido construcción

Hemaglutinina de etiquetado PrP (PrP-HA) plásmido se preparó como sigue: la región de codificación (23-254) de ratón PrPc se preparó, tal y como se describe en Negro et al [34], con dos Mets en las posiciones 108 y 111 (L108M, V111M) para proporcionar el epítopo específico para las comunicaciones Mab 3F4. A continuación, la región de codificación se clonado en el vector de expresión de mamíferos pRK7HA (una especie de regalo del Dr Elisabetta Ciani, Bolonia, Italia), abajo de la etiqueta HA-secuencia, entre BamHI EcoRI y sitios de restricción. La región que codifica la PrP del ratón péptido señal (1-22) fue clonado en el vector recombinante, aguas arriba de la secuencia epítopo HA, entre AgeI y sitios de restricción HindIII. Vector de expresión humana DPL fue preparado como en [34].

GST vinculante ensayo

Recombinante de larga duración formas ofmorPrP (23-231) y la RDP-Hur (28-152) se generaron en, y se purifica, Escherichia coli, tal como se describe en Negro et al [34]. Para facilitar el epítopo específico para Mab 3F4, morPrP llevado dos Mets en las posiciones 108 y 111 (L108M, V111M). Murino Cav-1 formas fueron obtenidos recombinantly como GST-proteínas de fusión, tal como se describe en [35]. Para los ensayos obligatorios, 0,2 μ M de Glutatión STransferase (GST) o GST-Cav proteínas de fusión (prebound a glutation-Sepharose bolas) se incubaron durante la noche con equimolar cantidades de morPrP o hurDpl (en un volumen final de 0,25 ml), bajo agitación continua en 4 ° C. Proteínas obligado a glutation-Sepharose bolas se eluye, lavado, y immunoblotted para detectar la presencia de PrP o DPL. En la competencia experimentos, equimolar cantidades de cualquiera de Ab Tg o C-20 anticuerpos estaban presentes durante todo el período de incubación.

Determinación de la constante de disociación de la unión GST-Cav proteínas de fusión y morPrP

Diferentes concentraciones de morPrP (0.03-0.7 μ M) se incubaron con 0,2 μ MGST-Cav proteínas de fusión (GST-Cav 61-101, GST-Cav 135-178, y GST-Cav FL 1-178) en las mismas condiciones descritas anteriormente. Proteínas obligado a glutation-Sepharose bolas se eluye y expuestas a prueba Western Blot. El blots, teñidas con anti-PrP Mab 3F4, fueron analizados en luz transmitida por el software ImageMaster VDS (Pharmacia Biotech, Suecia) para medir la intensidad de las bandas. PrP concentración se representará gráficamente como una función de la intensidad de la banda se expresa en unidades arbitrarias.

Western blot

Por Western blot, desnaturalizado por primera vez las proteínas separadas por un 12% SDS-PAGE, transferidos por electroforesis en nitrocelulosa y, a continuación, dependiendo de la experiencia, incubadas con los anticuerpos específicos. Immunolabeling fue visualizado por procedimiento ECL (Amersham, Reino Unido) y la banda se midieron intensidades de software ImageMaster VDS (Pharmacia Biotech, Suecia).

Cultivo de células y transfección

GN11 células murinas [36] fueron cultivadas a 37 ° C en 5% CO 2 atmósfera en alto de glucosa-un medio de cultivo (DMEM, Sigma, EE.UU.), completado con un 10% inactivado por calor suero de ternera fetal (FCS, Cambrex BioWhittaker, EE.UU.), 2mm L-glutamina, penicilina (100 U / ml) y estreptomicina ( 100 μ g / ml), tal como se describe en [37].

Las células fueron transfectadas transitoriamente mediante el uso de reactivos Lipofectamine 2000 (Invitrogen, EE.UU.), según las instrucciones del fabricante. Para la diferenciación celular, phorbol ester 12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetato (TPA) (20 nM, Sigma, EE.UU.) se añadió a las células poco después de la transfección paso, en función de la experiencia. Por Western blot experimentos, las células fueron trypsinized 24 horas después de transfección y reseeded en 25 cm 2 frascos para obtener el mismo número de células transfectadas en cada frasco. Para evaluar el Erk 1 / 2 estado de fosforilación, las células fueron suero de hambre durante 4 horas antes de anticuerpos mediada por la ligadura de PrPc. Dependiendo de los experimentos, 30 μ M PP2 (Calbiochem, EE.UU.) se añadió a la media de 4 horas. En ambos inmunocitoquímica, inmunotransferencia y la experimentación, 48 horas después de transfección, mediada por anticuerpos estimulación se llevó a cabo en primer lugar por la incubación (10, 20, o 30 min, 37 ° C) intacta células vivas withMab 3F4, MAB DPL 79, o anti - β ~ Pab-actina y, a continuación, con secundario anti-ratón o anti-conejo de anticuerpos adicionales 10-120 min. (37 ° C), dependiendo del experimento. Luego, las células fueron lyzed en buffer de lisis (50mm Tris-HCL, pH 7,5, 2 mM EDTA, 100 mM NaCl, 1% Triton X100, 5 mM NaF, 1 mM Na3VO4, 10 mM β-glycerolphosphate, y los inhibidores de proteasas) o fija con paraformaldehído al 4%, por Western Blot o inmunofluorescencia análisis, respectivamente.

La inmunocitoquímica

PrPc-overexpressing GN11 las células cultivadas sobre cubreobjetos fueron fijadas con paraformaldehído al 4% y se incubaron con Mab 3F4 o fueron estimulados por el anticuerpo mediada por la ligadura y fijos. Las células fueron permeabilized con Triton X-100 (0,1% en buffer fosfato salino (PBS)) y saturados en PBS-BSA 3% durante 30 min. Luego, las células fueron incubadas con anticuerpos anti-Cav-1 o anti-fosfato Fyn Pabs (por doble tinción de fluorescencia experimentos) o con anti-quinasa Fyn Pab (por triple tinción de fluorescencia experimentos). Después de lavados, las células fueron incubadas con anticuerpos anti-ratón conjugado con FITC y con antirabbit-Cy5 (por doble tinción) o Cy3-(por triple tinción) conjugado con anticuerpos secundarios. Para la tinción de inmunofluorescencia triple experimentos, anti-Cav-1-FITC conjugado de anticuerpos se añadió. Por último, se diapositivas montadas en glicerol-PBS medio que contiene 30 mg / ml DABCO (Sigma, EE.UU.). Evaluación de la especificidad de anticuerpos se llevó a cabo ya sea por omisión o primaria de anticuerpos inespecíficos mediante el uso de sueros.

La microscopía confocal

La imagen confocal se realizó en 2000 un Radiance láser confocal de barrido microscopio (BioRad), equipado con una Nikon 40x, 1,4 NA objetivo, y con un Krypton y una Red de diodo láser, para excitar FITC (verde) y Cy5 (rojo) al mismo tiempo fluorescencia . Colocalización se evaluó en medio óptico secciones usando software LaserPix (BioRad) [38]. En resumen, las dos dimensiones gráfico de dispersión diagrama de cada celda fue analizada para evaluar la colocalización espacial de los fluorocromos. Para cada parcela diagrama de dispersión, con píxeles de gran colocalized fluorocromos, es decir, con valores de intensidad de más de 150 niveles de gris (en una escala de 0 a 255) para los dos detectores se han seleccionado para calcular la colocalización mapas y crear una imagen binaria.

Optiprep gradiente de flotación

Optiprep gradiente de densidad de flotación se realizó tal como se describe en Harder et al [39]. En pocas palabras, la PrP c-TPA-overexpressing células diferenciadas (una confluente 25 cm 2 frasco) se lyzed (20 min, 4 ° C) en 200 μ l de una TNE / TX buffer (25mm Tris HCl (pH 7.4), 150 mm NaCl, 5mm EDTA, 5mm TDT, 1% Tritón X-100, y los inhibidores de la proteasa), mezclados con 400 μ l de 60% Optiprep reactivo (Sigma, EE.UU.), situado en la parte inferior de un tubo Ultracentrifugar, y superpuestos, con 600 μ l de cada paso del 35%, 30%, 25%, 20% y 0% Optiprep (TNE / TX). El gradiente se escindió a 200,000 xg (4 horas, 4 ° C), después de que las fracciones se obtuvieron de la parte superior de la pendiente, precipitado con ácido, y se analizaron por Western blot.

Coimmunoprecipitation ensayo

En Cav-1 immunoprecipitation experimentos, las células que expresan transitoriamente el HA-etiquetados PrPc (un confluente 25 cm 2 frasco para cada una de las muestras) fueron lyzed a 500 μ l de una solución tampón que contiene 10mm Tris (pH 7,5), 150 mm NaCl, 1mM EDTA, 1% Triton X-100, 0,5% NP40, el 10% de glicerol, y los inhibidores de la proteasa. Precleared sobrenadantes se immunoprecipitated utilizando anti-Cav-Pab l (3 μ g / ml), seguido de incubación con proteína A Sepharose [35]. Después de lavados, immunoprecipitated muestras fueron procesadas mediante Western Blot para detectar PrPc. Para muestra deglycosylation, immunoprecipitates fueron tratados (24 horas, 37 ° C) con PNGase-F (5 U) (Roche Molecular bioquímicos, Alemania) [40]. Por PrP immunoprecipitation, el mismo protocolo descrito anteriormente fue seguida, con la excepción de la utilización de un anti-HA etiqueta de anticuerpos a immunoprecipitate. La presencia de Cav-1 en las muestras immunoprecipitated se ensayaron por inmunotransferencia con anti Cav-1 Pab.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN
La interacción entre PrP y Cav-1

Para evaluar la interacción entre Cav-1 y PrPc, llevamos a cabo in vitro vinculante experimentos como anteriormente se ha descrito en [35], mediante el uso de cuatro diferentes GST-Cav1 proteínas de fusión y un control GST-nonfusion proteína para impugnar mor-PrP. Encuadernación moléculas PrP fueron immunodetected de Western blot. Los resultados muestran claramente que GST-CavFL (de larga duración, aa 1-178), GST-CavSD (andamios de dominio, aa 61-101), y GST-CavCT (C-terminal región, aa 135-178) de manera muy eficiente obligar morPrP. No está obligado morPrP cuando solo GST y GST-CavNT (N-terminal región, aa 1-81) fueron impugnadas, lo que indica que la unión es específica (Figura 1 (a], 1).

La hipótesis de que la PrP no estructurados N-terminal región [41] podría representar un importante sitio de unión de Cav-1. Esta región se caracteriza por la presencia de un octapeptide secuencia PHGGGWGQ repetirá cinco veces en tándem y que participan en la unión de los iones de cobre [9]. Para demostrar nuestra hipótesis, que fueron evaluados por primera vez la RDP si se une a proteínas Cav-1. RDP es una proteína que muestra la secuencia de alta homología con la C-terminal de la PrPc, pero carece de la N-terminal octapeptide región [42, 43]. Para ello, probaron el hurDpl en las mismas condiciones utilizadas para la mor-PrP vinculante para Cav-1. Sin embargo, contrariamente a morPrP, hurDpl mostró ninguna interacción con Cav-1 (Figura 1 (a], 2).

Más detalles acerca de la PrPc N-terminal de los sitios que participan en la unión a Cav-1 se obtuvieron utilizando un anticuerpo policlonal Ab Tg. Este anticuerpo reconoce específicamente dos nonadjacent octapeptide repite (57-65 y 81-89), ya que una sustitución G / S fue suficiente para que derogue el reconocimiento. El uso de anticuerpos Ab Tg casi completamente bloqueado la morPrP vinculante para GST-Cav SD (61-101), mientras que un anticuerpo dirigido contra una PrP C-terminal epítopo tenido un efecto mucho más bajos (Figura 1 (a], 3). En conjunto, estos resultados indican que la octapeptide repite podría representar un PrP sitio de unión de Cav-1.

Los resultados de los experimentos encaminados a evaluar la afinidad PrP/Cav-1 constantes se muestran en la Figura 1 (b]. Los importes de morPrP que van desde 0,03 μ M de 0,7 μ M fueron incubadas con diferentes GST-caveolin proteínas de fusión, tal como se describe en Material y Métodos. Bandas intensidad en el oeste de blots se cuantificó por densitometría. Parcelas que representa la unión de GST-CavFL (1-178), GSTCavSD (61-101), y GST-CavCT (135-178) se muestran en los paneles B1, B2 y B3, respectivamente. Evaluación constante de disociación (KD) de reciprocidad parcelas mostró que Kd osciló entre el 8 y el 9 × 10 8 M -1 para todos los tres proteínas de fusión. Como no vinculante se observó utilizando GST solo o GST CavNT proteína de fusión, parece que es vinculante inespecíficos no se producen en nuestras condiciones experimentales.

Para determinar si la interacción entre PrP y Cav-1 observado in vitro se produjo también en un entorno fisiológico y si esta interacción tiene efectos sobre la transducción de señales, hemos utilizado, como modelo de celular, una línea celular inmortalizada de la hormona luteinizante liberadora de hormona (LHRH ) Las neuronas que expresa naturalmente altos niveles de Cav-1 [44] y que era propenso a ser transfectadas transitoriamente con una alta eficiencia con un plásmido de codificación de las etiquetas HA morPrP proteína.

En PrPc-overexpressing GN11 células, PrPc parece distribuidas de manera uniforme en la membrana plasmática (Figura 2 (a], 1) y presenta un bajo nivel colocalización con Cav-1 (Figura 2 (a], 3 y 4). Dado que se ha demostrado que los GPI-anclado proteínas que residen en balsas translocate a caveolae siguiente agrupación inducida por anticuerpos mediada transversal linki [21, 39], nos estimuló en vivo PrPc-overexpressing GN11 con células de lucha contra la PrPc de anticuerpos (30 min) y con FITC-conjugado anticuerpo secundario (30 min), tras observar que las agrupaciones PrPc en la membrana plasmática microdomains (en la Figura 2 (a], 5 y 9, puntas de flecha indican los grupos de PrPc) rico en Cav-1 (Figura 2 (a] , 6 y 10). En estos grupos que hemos detectado un alto nivel de colocalización entre PrPc y Cav-1 (Figura 2 (a], 8 y 12).

Con el fin de obtener un entorno neuronal más cerca de aquel en el que opera PrPc fisiológicamente, GN11 células tratadas con TPA, un inductor de la diferenciación celular (Figura 2 (b], 1-4). Análisis de PrPc-overexpressing GN11 células tratadas con TPA ha demostrado un aumento en la co-localización entre PrPc y Cav-1 (Figura 2 (b], 3 y 4). Desde los experimentos in vitro (Figura 1 (a], 2) han demostrado una incapacidad de Cav-1 de obligar a la RDP y desde la RDP es una proteína de superficie expuesta a la exoplasmic espacio a través de un índice-como ancla PrPc [45], análisis de microscopía confocal Se realizaron en GN11 células overexpressing la RDP diferenciadas con proteína TPA (Figura 2 (b], 5-8). Cuando se DPL vínculos cruzados, utilizando un anticuerpo específico, colocalización con Cav-1 a nivel de membrana plasmática es indetectable (Figura 2 (b], 7-8) que confirma un comportamiento diferente entre PrPc y la RDP y DOPPEL lo que sugiere que, aunque situados a través de un GPI ancla en el mismo microdomains de PrPc, podría ser incapaz de participar en la transducción de señales de supervivencia, favoreciendo así las condiciones lentamente conducen a la apoptosis. Por ejemplo, la falta de DOPPEL de obligar a Cav-1 podría perjudicar la quinasa Fyn reclutamiento debido a la activación de PrP c [13], por lo tanto, alterar el destino normal de la diferenciación celular que ocurre durante el desarrollo del cerebro. Nuestros resultados también pueden ayudar a explicar por qué la reintroducción de un wildtype gen Prnp, en PrP c 0 / 0 ratones expresando DOPPEL proteína en el cerebro, les rescata de la neurodegeneración [46]. De hecho, la PrP c, que presentan una mayor afinidad por transducing maquinaria, pueden desplazar DOPPEL proteínas y activar las señales de supervivencia. Prueba el apoyo de un papel de la PrP c en la regulación de la proliferación celular, diferenciación y supervivencia ha sido recientemente recopilados por Satoh y compañeros de trabajo [47], que comparó el perfil de expresión génica en fibroblastos líneas celulares derivadas de la PrP c-ratones deficientes (Prnp 0 / 0 ) Y fromPrP silvestre typemice. Observaron que la alteración de genes Prnp dado lugar a una regulación aberrante de una batería de genes importantes para la proliferación celular, diferenciación y supervivencia, incluidas las situadas en el barrio de Ras y RAC vías de señalización. Por otra parte, Kuwahara y compañeros de trabajo [48] observó que la reintroducción de especies silvestres del tipo de gen Prnp impedido la apoptosis en las células del hipocampo derivados de Prnp 0 / 0 ratones y cultivadas en suero libre de condiciones.

Para confirmar aún más la PrPc/Cav-1 colocalización, experimentos de flotación en gradiente de densidad se realizaron. La extracción de células con Triton X-100 a 4 ° C y el fraccionamiento de material insoluble OptiPrep o sacarosa-gradiente de centrifugación se consideran un estricto criterio para determinar si una proteína está presente en insoluble en detergente glycolipid ricos en dominios (excavaciones) y colocalizes con Cav -1 [49]. Sin embargo, es difícil obtener una separación entre balsas y caveolae.We aplicado este procedimiento a GN11 células transfectadas transitoriamente con Prnp o Prnd, y evaluó PrPc, Cav-1, y la RDP de distribución de Western Blot. Los resultados obtenidos (Figura 3 (a)] muestran una marcada colocalización entre PrPc y Cav-1 en baja densidad gradiente fracciones (Figura 3 (a], 1 y 2, resp.). Curiosamente, la RDP de proteína (Figura 3 (a], 3), incluso si se trata de un GPI-proteína ligada también, muestra una amplia distribución en la mayoría de las fracciones de la gradiente que no se correlaciona con Cav-1 distribución.

Mouillet-Richard et al [13] detectó la presencia de Cav-1 en immunoprecipitated muestras obtenidas mediante el uso de un anti-anticuerpo PrPc, en particular cuando las células neuronales fueron inducidas a diferenciarse. Hemos propuesto para confirmar estos resultados en células neuronales GN11 transfectadas transitoriamente con murino Prnpgene Prnpgene. Recíproco coimmunoprecipitation experimentos en la etiqueta-HA PrPc-overexpressing GN11 células se realizaron para confirmar aún más PrPc-Cav1 interacción (Figura 3 (b)]. Se encontró que el anti-HA-etiqueta anticuerpos coimmunoprecipitate Cav-1 (Figura 3 (b], carril 2) y, recíprocamente, que la lucha contra la Cav-1 anticuerpos coimmunoprecipitate PrP (Figura 3 (b], los carriles 3 y 4) en las células estimulada por la lucha contra la PrPc de anticuerpos-(30 min) y de anticuerpo secundario-(30 min) mediada por la ligadura. Después de deglycosylation tratamiento (Figura 3 (b], carril 4), el frotis típico de PrPc se resolvió en una sola banda de 27 kDa. Curiosamente, la sensibilidad de detección de Western Blot no permitió a revelar Cav-1 en coimmunoprecipitates de unstimulated células (carril 1), confirmando la importancia de la estimulación de anticuerpos en la interacción PrPc/Cav- 1.

Para seguir la suerte de PrPc/Cav-1 complejos, un timecourse de PrPc y Cav-1 después de las distribuciones de lucha contra la PrPc de anticuerpos mediada por la estimulación se analizó por microscopía confocal en que viven GN11 células overexpressing PrPc. En la Figura 4 se demuestra que la PrPc/Cav-1 colocalized señal, a nivel de membrana plasmática, se hizo evidente después de 60 min de la lucha contra la PrPc de anticuerpos mediada por la estimulación (A-D). Sin embargo, después de 90 min, PrPc fue destacado en el espacio intracelular y sólo unos pocos puntos de colocalized señales estuvieron presentes en la membrana plasmática (E-H). Después de 150 minutos, PrPc se convirtió casi exclusivamente intracelular (I), mientras que Cav-1 distribución apareció sin cambios (J), y colocalización señales fueron indetectables (K), (L). Es probable que, cuando son separados caveolae superficie de la membrana de disociación PrPc/Cav- 1 complejos se lleva a cabo. Sin embargo, el Western Blot análisis de PrPc en diferentes momentos (M, N, O) puso de manifiesto que no degradación de la PrPc, incluso después de 2 h, era evidente. Por otra parte, el grado de glicosilación PrPc se mantuvo inalterada.

La participación de PrPc en la transducción de señales

Puesto que la hipótesis de un papel de PrPc de agrupaciones y de PrPc-CV 1 colocalización en la transducción de señales, hemos realizado experimentos de microscopía confocal para evaluar si quinasa Fyn responde, en alguna manera, a un anti-PrP de anticuerpos mediada por la estimulación (Figura 4]. Biedi y colaboradores demostraron la contratación de Fyn quinasa de citoplasma a caveolae en fibroblastos overexpressing natural IGF-IR estimulada por la IGF-I [50]. De manera similar, después de la estimulación de la PrPc-overexpressing GN11 con células de lucha contra la PrPc de anticuerpos (30 min) y con el anticuerpo secundario (30 min) para inducir la PrPc parches, se observó el desplazamiento de la quinasa de Fyn el citoplasma hacia la membrana ( en la figura 5 (c], comparar la distribución de Fyn en un transfectadas las células sometidas a la estimulación (flecha) con una célula untransfected no sometidos a la estimulación (flecha)). Después de los anticuerpos mediada por la estimulación, reveló un alto colocalización entre PrP y Cav-1 (grupo D) y entre PrP y la quinasa Fyn (grupo E) en la membrana plasmática. Se informó anteriormente que PrPc y quinasa Fyn no colocalize en las neuronas, sin embargo en los experimentos de células no eran estimuladas por la lucha contra la PrPc de anticuerpos [51].

Para evaluar si la quinasa Fyn reclutados en los grupos de PrPc/Cav-1 fue activada, hemos realizado experimentos de inmunofluorescencia confocal, utilizando un anticuerpo que reconoce la forma activa de Fyn cinasa fosforilados en Tyr 416 (Figura 6]. En GN11 células que no expresan PrPc, la señal de Fyn quinasa activa es baja y amplia dispersas en el citoplasma (datos no presentados). Por el contrario, en PrP-overexpressing GN11 células que hemos detectado una baja activación de Fyn quinasa en la membrana plasmática (Figura 6, B y F). A raíz de lucha contra la PrPc de anticuerpos mediada por la estimulación (20 min), un mayor nivel de actividad quinasa Fyn situado en la correspondencia de las agrupaciones PrPc se detectó (J, N, puntas de flecha indican las agrupaciones PrPc). Después de 40 minutos de estimulación de anticuerpos, la señal de activa quinasa Fyn fue más débil y después de 60 min no es más detectable (datos no presentados). En conjunto, estos datos ponen de manifiesto que, a raíz de lucha contra la PrPc de anticuerpos mediada por la estimulación, parches PrPc en la membrana plasmática en las agrupaciones en las que quinasa Fyn es contratado y activado.

Se ha informado de que Fyn cinasa activada puede transduce una señal en cascada a través de Erk 1 / 2 quinasa [52]. Para evaluar si las células GN11 en la activación de PrPc de anticuerpos mediada por la ligadura desencadena una vía de transducción de señales a través de Erk 1 / 2, realizamos los experimentos reportados en la Figura 7. La incubación de PrP-overexpressing GN11 con células de lucha contra la PrPc (3F4) y secundaria de anticuerpos para un tiempo total de 20 y 40 min causó la activación de la quinasa de Fyn siguientes de lucha contra la PrPc de anticuerpos mediada por la estimulación, observados por microscopía confocal, puede desencadenar abajo una activación de Erk 1 / 2 quinasa de la inducción de su fosforilación (carriles 3 y 4), mientras que la incubación no guardan relación con los anticuerpos no tienen efectos (carril 5). Erk1 / 2 niveles de fosforilación no aumentar si las células fueron tratados previamente con la quinasa Fyn inhibidor PP2 (carril 6). Este resultado sugiere que la activación de Erk 1 / 2 vía de señalización. Nuestros datos, obtenidos en un modelo neuronal expresar Cav-1, confirman que PrPc desencadena una quinasa Fyn y Erk 1 / 2 vía de señalización como se informó anteriormente [15, 31, 32, 53].

Para obtener esta activación, PrPc y quinasa Fyn necesidad de co-localizar a caveolae: PrPc agrupaciones en la membrana plasmática tras el anticuerpo (u otros ligandos fisiológicos putativo) vinculante, y la quinasa Fyn se mueve desde el citoplasma a caveolae.

Con el fin de demostrar el papel esencial de Cav-1 en la PrPc-Fyn-Erk 1 / 2 vía de señalización, las reguladas o mal caveolin 1 mediante el uso de anti-Cav-1 oligonucleótidos antisentido Filipin y III, respectivamente. El objetivo era obtener una condición experimental en el que la ausencia de Cav-1 podría impedir la activación de la cascada de transducción de PrPc desencadenada por la agrupación. Sin embargo, estos tratamientos en las células GN11 no permitía obtener resultados claros, ya que provocó un fuerte aumento de Erk 1 / 2 fosforilación nivel (datos no presentados). La capacidad de Cav-1 inhibe directamente a Erk 1 / 2 activación ha sido reportado en otros modelos experimentales [25, 26]. Por otra parte, el hyperactivation de Erk 1 / 2 signalingwas informó en Cav-1 (-/-) null ratón las células y los tejidos [28, 29, 54], y, en NIH-3T3 células en las que Cav-1 se downregulated de antisentido [27 ]. El efecto inhibidor de Cav-1 en Erk 1 / 2 puede explicar por qué, en nuestra cellularmodel, es tan difícil de demostrar la participación directa de Cav-1 de transducción de señales en los acontecimientos desencadenados por la estimulación PrPc.

Los datos aquí presentados confirman la participación de PrPc en la transducción de señales a través de eventos Fyn y Erk 1 / 2 quinasa y demostrar caveolae a ser el lugar físico en que esta señal en cascada conmutadores. In vitro vinculantes los resultados de los experimentos sugieren que una interacción física entre PrPc y Cav-1 podría participar en estos eventos de señalización, aunque esto es poco probable hoy en día teniendo en cuenta la ubicación de aceptación de PrPc y Cav-1 en el lado opuesto de la membrana plasmática.

Damos las gracias al Dr R. Maggi y el Profesor F. Piva (Departamento de Endocrinología de la Universidad de Milán, Italia) para proporcionar GN11 células. Dr Romina D'Angelo (CNRS / Instituto Curie, París, Francia) ayudó con la PrP-HA plásmido construcción. El presente trabajo fue apoyado por becas de MIUR (PRIN 2004) a VT.