Journal of Biomedicine and Biotechnology, 2006; 2006: (más artículos en esta revista)

MicroRNAs en la regulación de genes: cuando el menor está sujeto a todos

Hindawi Publishing Corporation
Dominique L. Ouellet [1, 2], Marjorie P. Perron [1, 2], Andrée-Lise Gobeil [1, 2], Pierre Plante [1, 2], Patrick Provost [1, 2]

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Resumen

Codificadas por el genoma de la mayoría de los eucariotas examinado hasta el momento, microRNAs (miRNAs) son pequeños ~ 21-nucleótidos (nt) noncoding RNAs (ncRNAs) derivado de una cascada biosíntesis de la participación de procesamiento secuencial de los pasos ejecutados por la ribonucleases (RNases) III Drosha y Dicer. A raíz de su reciente identificación, miRNAs han adoptado rápidamente el centro de la escena clave como reguladores de la expresión génica. En esta revisión, se resumen de nuestro conocimiento actual de la ruta de biosíntesis de los genes miARN y sus componentes proteínas, así como los procesos que regula a través de miRNAs, que se sabe que ejercen una variedad de funciones biológicas en eucariotas. A pesar de la importancia relativa de miRNAs aún no se ha valorado plenamente, desregulado expresión de proteínas derivadas de los genes miARN ya sea disfuncional o anormal de la biogénesis de los genes miARN basada en la regulación de genes puede representar un importante factor etiológico en varios, como aún no identificadas, las enfermedades. Por lo tanto es nuestra necesidad de entender mejor la complejidad de los mecanismos básicos que subyacen los genes miARN la biogénesis y función.

INTRODUCCIÓN

En 1990, un grupo de biólogos de plantas tratado de acentuar la pigmentación de color púrpura petunia pétalos de aumentar la síntesis de antocianinas a través de la sobreexpresión de un transgén codificación chalcona sintasa. Inesperadamente, este transgén inducida por la formación de flores blancas, en asociación con un bloque en la síntesis del pigmento y 50 veces la reducción en los niveles de mRNA del transgén; este intrigante fenómeno se denomina cosuppression [1, 2].

Tres años más tarde, en el ámbito de la biología del desarrollo, Lee et al [3] identificó dos lin-4 transcripciones, con los más pequeños (~ 21 nt) son complementarias a siete secuencias repetidas en el 3 'nontranslated región (NTR) de la heterochronic gen lin-14 mRNA, identificado previamente por Wightman et al [4]. Estos hallazgos sugiere que lin-4 podría regular lin-14 a través de una traducción del RNA antisentido: mRNA y la interacción juegan un papel importante en el calendario de desarrollo en el nematodo Caenorhabditis elegans (C elegans) [3, 5].

Estos estudios convergieron en 1998, cuando el fuego et al [6] obtuvo evidencias sobre la participación de doble hundidos (ds) RNA intermedios en un fenómeno denominado interferencia por ARN (RNAi). Los autores observaron que dsRNA inducida por una especie más potente interferencia genética que cualquiera de los dos capítulos solo en C elegans. Un año más tarde, mientras investigaba posttranscriptional silenciamiento de los genes (PTGS) como natural mecanismo de defensa antiviral, Hamilton y Baulcombe [7] observó la presencia de ARN antisentido viral de ~ 25 nt de virus en plantas infectadas. Los autores observaron que estos pequeños ARN's son lo suficientemente largo como para transmitir la secuencia especificidad y sugirió que pueden ser importantes factores determinantes de la especificidad PTGS. Tras la presentación de informes que los documentos de dsRNA inducida por la degradación del ARNm es mediada por 21 a 23 nt RNAs [8, 9] llevado a los biólogos moleculares y genetistas para buscar el origen endógeno de los pequeños RNAs. En 2001, tres grupos independientes miRNAs definido como una novela familiar de los pequeños (~ 22 nt) endógeno ARN's que son diversos en secuencia y patrones de expresión, evolutivamente generalizada, y que participan en la secuencia específica, posttranscriptional mecanismos de regulación de la expresión génica [10 - 12 ].

Ahora sabemos que los genes miARN genes que se codifican en el genoma de la mayoría de los organismos eucariotas y transcritos por la RNA polimerasa (POL) II miRNAs en primaria (pri-miRNAs). Estos estructurado ARN's son luego procesadas por la RNasa III nuclear Drosha, actuando en concierto con el síndrome de DiGeorge región crítica, 8 (DGCR8) de proteínas dentro de un complejo conocido como el microprocesador [13 - 16], en ~ 60 a 70 nt tallo bucle precursores de los genes miARN (pre-miRNAs) [17 - 19]. A raíz de la exportación de núcleo para el citoplasma de los Ran-GTP dependientes transportista Exportin-5 [20 - 23], el pre-miRNAs son exfoliados en la base del bucle de una segunda enzima RNasa III situado en el citoplasma, Dicer, a generar un imperfecto genes miARN: los genes miARN * ~ dúplex de 21 a 24 nt. Dicer acaba de poner de manifiesto a actuar junto con la respuesta transactivating RNA-proteína de unión (TRBP) dentro de un pre-procesamiento de los genes miARN complejo. Tras el capítulo de selección / separación, madura ~ 22 nt miRNAs se incorporan a, y guía, efector que contienen los genes miARN ribonucleoprotein (miRNP) complejos que contienen Argonaute 2 (Ago2) hacia mRNAs específicos. Dicer y TRBP Recientemente se han demostrado ser parte de un ARN funcional humanos inducida por silenciar complejo (RISC), con lo cual el acoplamiento y la puesta en marcha de medidas efector RNAi [24]. El ARNm orientados inicialmente será sometido, ya sea a división de traducción o la represión, dependiendo de si los genes miARN: mRNA emparejamiento es perfecto o no [25]. Los genes miARN guiada por silenciamiento de ARN vía se ilustra en la Figura 1.

En los seres humanos, los conservadores pronósticos indican que hasta un 30% de los genes puede estar regulada por un mecanismo de ese tipo! Por lo tanto, potencialmente todas las vías celulares puede regirse por miRNAs, lo que puede contribuir al perfeccionamiento de la expresión génica a nivel mundial. La importancia de miRNAs en la regulación de genes se aprecia mejor cuando su función o la desregulación, o de que la maquinaria celular mediar su biosíntesis y función, se determinarán entre las causas subyacentes de varios trastornos genéticos. De hecho, es fácil concebir que sobreexpresión de la proteína resultante de defectos basados en los genes miARN mRNA reglamento puede poner en peligro la función normal de las células y causar enfermedades genéticas. A su vez, el gen responsable (s) pueden ser sensibles a RNAi basado en la inactivación, lo que ilustra la transición entre la investigación fundamental a las aplicaciones clínicas de RNAi.

Hoy en día, los genes miARN mimetics pequeños RNAs de interferencia (siRNAs) son cada vez más importantes herramientas moleculares, ya que a menudo es el método de elección utilizado por los investigadores que tienen por objeto elucidar la función de un gen. Más importante, quizás, es el alto potencial del enfoque de aplicaciones terapéuticas, llevando varias empresas de biotecnología para desarrollar y perfeccionar las herramientas, y mejorar el diseño de nuevas estrategias terapéuticas con el fin de aprovechar las ventajas naturales de la maquinaria silenciamiento de ARN para silenciar la expresión de que causan enfermedades genes. Esto requiere una mejor comprensión de los genes miARN basados en ARN silenciar a la maquinaria humana.

Componentes de la maquinaria RNAi

La endógeno genes miARN guiada por silenciamiento de ARN maquinaria se compone de varias proteínas diferentes, complejos de proteínas, y los tipos de ARN's. ¿Cómo integrar estos elementos entre sí para formar esta importante funcional en cascada es objeto de intensas investigaciones. Vamos a discutir primero la proteína componentes, identificados hasta ahora, que son los genes miARN que regulan la biogénesis y función (ver Figura 1]. Las secciones siguientes se destinarán a la identificación de miRNAs y sus objetivos, las funciones biológicas de miRNAs, así como su participación en las enfermedades.

ARN polimerasa II

RNA pol II, que regula la transcripción de la codificación de proteínas RNAs mensajeros (mRNAs), ha sido identificado como la principal unidad transcripcional de genes miARN genes [17, 26] a partir de algunas especulaciones sobre la potencial implicación de RNA pol III [25]. El pri-genes miARN transcripciones, lo que puede ser de más de 1000 NTS [26] y hasta varias kilobases de longitud, poseen la firma del RNA pol II se caracteriza por un 5 '7-metil guanilato (m7G) y un tope de 3' poli (A ) Cola [17]. Aunque los genes miARN genes se puede encontrar como las agrupaciones que forman sus propias unidades transcripcional [19, 26], ~ 40% son transcritas intronic de la secuencia de codificación de proteínas los genes [27, 28]. Un estudio realizado por Rodríguez et al [27] ha demostrado que la expresión de un gran subconjunto de mamíferos miRNAs pueden ser transcriptionally vinculada a la expresión de otros genes, que codifican las proteínas y los dos ncRNAs. Aunque la mayoría de los pri-miRNAs son noncoding RNAs, cuyas regiones genómicas no se correlacionan con las transcripciones conocidas [29], algunas de ellas contienen marco de lectura abierta (ORF) susceptibles de ser traducidos. Sin embargo, el análisis de ambos endógeno y overexpressed pri-miRNAs que mostró muy poco de larga duración pri-genes miARN transcripciones alcanzado el citoplasma, probablemente debido a que fueron procesados por Drosha antes de que pudieran ser exportados desde el núcleo [17].

Drosha

La RNasa III Drosha es una clase II endoribonuclease que fue identificado, clonado, y los primeros implicados en preribosomal ARN (pre-rRNA) el tratamiento [30] (ver Figura 2]. Los miembros de la clase II RNasa III familia se caracterizan por una duplicación de la RNasa III de dominio (RIIID), un C-terminal dsRNA vinculante de dominio (dsRBD), así como una prolina-rica región (PRR) y una arginina / serina ( RS)-ricos en el dominio N-terminal de la región [18, 30]. Anteriormente conocida como la RNasa III humanos, Drosha fue identificado como el enzima mediar el primer paso en la biogénesis de los genes miARN mediante la conversión de pri-miRNAs en pre-miRNAs [18] (véase el cuadro 1], confirmando anteriores resultados obtenidos con las fracciones nucleares de humanos células cultivadas [19].

Drosha homólogos se expresan en C elegans [13, 31], Drosophila melanogaster (D melanogaster) [13, 31], y Mus musculus [32], pero no en Schizosaccharomyces pombe (S pombe) ( http://www.sanger.ac.uk/Projects/S_pombe/ ) Y Arabidopsis thaliana (A thaliana) [30]. La ausencia de Drosha en especies inferiores revela diferencias fundamentales en la puesta en marcha medidas de regulación de los pequeños ARN biosíntesis, que pueden haber sido evolucionado durante el curso de la evolución.

Pri-la transformación de los genes miARN Drosha se obtiene un pre-producto con los genes miARN termini que lleve la firma de RNases III, es decir, un 5 'fosfato y 2 nt domina a los 3' hidroxilado fin [18, 19, 33]. Desde la salida del bucle y la adyacente del tallo, Drosha cleaves pri-miRNAs después de aproximadamente dos helicoidal se convierte en el tallo para producir 70 ~ nt pre-miRNAs [18]. Lee et al utilizado deletional mutagénesis en la Mir-30a seguida de la transformación in vitro para demostrar que las secuencias que cubren nt ~ 20 ~ aguas arriba y aguas abajo 25 nt de la esperada división sitio eran necesarias y suficientes para apoyar la transformación [18]. Más allá de la pre-genes miARN división sitios, alrededor de una hélice a su vez de detener la extensión también es esencial para el procesamiento eficaz. Si bien la división Drosha sitios son en gran parte determinado por la distancia desde la terminal de lazo, las variaciones en la estructura del tallo y la secuencia en torno a la división sitio pueden ajustar la división real de los sitios elegidos [34]. A cleaving modelo fue propuesto en el que los dos RIIID de Drosha formar un dímero intramolecular de crear un sitio catalítico para la transformación de sustrato [15]. Este modelo es similar al propuesto para Dicer [35]. Los dos RIIIDs de Drosha humanos son distintos en su rol dentro del dímero: los recortes RIIIDa el 3 'del capítulo, mientras que el RIIIDb cleaves los 5' capítulo, independientemente uno del otro [15]. Han et al sugirió que Drosha Mayo reorientar una vez que el reconocimiento del extremo 3 'del pri-miRNAs [15] y, a la alimentación humana como Dicer, los lugares en el centro de procesamiento de <20 pares de bases de la terminal [35].

Fraccionamiento de HEK 293 núcleos de células extractos de cromatografía de filtración en gel identificado un pri-genes miARN actividad de procesamiento correspondiente a una masa molecular de> 700 kDa [15]. Esta actividad pico desplazado a <650 kDa después del tratamiento del extracto con RNasa A, lo que indica que Drosha pueden funcionar en un gran complejo de <650 kDa. Análisis de Drosha immunoprecipitates de espectrometría de masas reveló la presencia de DGCR8 en ese complejo [13, 14]. Un distinta, más grande Drosha complejo que contiene el cuadro de DEAD DDX17/P72 RNA helicasa, la heterogénea nuclear ribonucleoprotein M4 (hnRNPM4), y el producto proteico del sarcoma de Ewing gen (SAT) se informó de [14]. Como se examinó en Arvand y Denny [36], SAT pertenece a una familia de genes que codifican proteínas que pueden servir como adaptadores entre el RNA pol II y complejos factores de empalme del RNA. Porque Drosha También se ha demostrado previamente para participar en las pre-rRNA procesamiento [30], este gran complejo Drosha ha sugerido para mediar en tales pre-rRNA actividades de procesamiento [14].

DGCR8/microprocessor

DGCR8 fue identificado en anti-Flag immunoprecipitates preparado a partir de una HEK-293 línea celular estable expresar Bandera-Drosha [14]. Este Drosha-DGCR8 complejo, que también ha sido observado en otros organismos [13, 16], que se ha denominado microprocesador [14]. DGCR8 contiene dos dsRBDs WW y un dominio que puedan interactuar con el N-terminal-prolina rica región de Drosha [14].

La función exacta de DGCR8 en el microprocesador complejo sigue siendo incierto, pero puede estar relacionado con los genes miARN pri-reconocimiento. De conformidad con una propuesta de modelo, DGCR8 que interactúan con el tallo, y quizás también la única hundidos (ss), región de esta estructura, para guiar el reconocimiento de la pri-tallo de los genes miARN Drosha dsRBD. Por otra parte, aunque no exclusivamente, DGCR8 también puede interactuar con el ss región de ARN para orientar correctamente los complejos en pri-miRNAs [15]. Gregory et al [14] han demostrado que el knock-down de DGCR8 resultados en, como se observa a Drosha agotamiento, una disminución pronunciada en los genes miARN maduro. El agotamiento de ambos Drosha y DGCR8 dado lugar a un considerable acumulación de pri-miRNAs, mostrando el requisito de que el microprocesador complejo de genes miARN tratamiento in vivo [14].

DGCR8 El gen se encuentra en la región q11.2 del cromosoma 22 humano que contiene genes ~ 30 y es parte de un común monoallelic supresión [37]. Pacientes portadores de esta supresión heterocigotos y otras anomalías cromosómicas en esta región mostrar fenotipos clínicos define como el síndrome de DiGeorge, Conotroncal anomalía síndrome de cara, y síndrome velocardiofacial [38]. Cardiopatías congénitas, apariencia facial característica, inmunodeficiencia, problemas de comportamiento y son otras manifestaciones de estos trastornos genéticos [38].

Exportin-5

Localización subcelular estudios anteriormente mostró que los genes miARN pri-y pre-procesamiento de los genes miARN está compartimentado en el núcleo y el citoplasma, respectivamente [19], lo que sugiere la existencia de un pre-genes miARN las exportaciones nucleares paso. Menos de dos años más tarde, tres grupos independientes informaron de la identificación de Exportin-5, un miembro de la nuclear karyopherin β transportista familia [21], como la nuclear pre-transportador de genes miARN [20, 22, 23].

Exportin-5-mediada por los genes miARN pre-ya sea de transporte se redujo a downregulation de Exportin-5 de siRNAs [23] o el incremento a sobreexpresión en células de mamífero [39]. Exportación de pre-miRNAs fue reducido en gran medida por la inhibición de la Ran guanine nucleotide factor de cambio, lo que sugiere que es catalizado por RanGTP [22]. De hecho, RanGTP era necesaria para vinculantes específicos de pre-miRNAs por Exportin-5 [23]. El reconocimiento de pre-miRNAs teniendo un 2 nt 3 'pendiente de Exportin-5 fue superior que el pre-miRNAs con 5', o si no se domina [40]. En cuanto a la pre-terminal genes miARN lazo y tallo, que debe ser más de 16 nt de longitud, su reconocimiento no es específicos de secuencia [20, 40]. El reconocimiento de un minihelix motivo por el ARN permite el transporte de Exportin-5, como lo demuestra el transporte eficiente de VA1 ARN de adenovirus 5 [41]. El lugar exacto de los vínculos de coordinación entre Exportin-5 y de las armas nucleares y citoplasmáticas pasos de la biogénesis de los genes miARN siguen siendo oscuros y necesitan una investigación más a fondo.

Dicer

Dicer es una ribonucleasa III que se identificó por primera vez como una enzima capaz de generar ~ 21-23 nt secuencias de ARN guía de dsRNA para iniciar RNAi en células Drosophila S2 [42]. Dentro de un plazo de dos meses, tres documentos null informó de que mutaciones en el gen alterado Dicer calendario de desarrollo, en asociación con los genes miARN defectuoso maduración y la acumulación de pre-miRNAs, en C elegans [43, 44] y Drosophila [45]. Dicer cDNA Humanos, que se habían identificado dos años antes [46], más tarde fue clonado y la proteína recombinante expresada, lo que permite la caracterización de sus propiedades ARN vinculante y RNasa actividad [47, 48]. Localizada principalmente en el citoplasma [49] o el retículo endoplasmático [47] de cultivos de células, Dicer humanos es una gran proteína compuesta de varios dominios: un N-terminal putativo ATPasa y helicasa dominio que contiene un cuadro de DECH, un dominio de función desconocida ( DUF283), un PIWI / Ago / Zwille (PAZ) de dominio, y un C-terminal RIIID, tándem compuesto por motivos RNasa III y un C-terminal dsRBD [35, 42, 47, 48].

Recientemente, los datos facilitados por Zhang et al [35] apuntaban a la existencia de un único centro catalítico en humanos Dicer. Los autores proponen un modelo en el que Dicer funcionaría a través de la dimerización intramolecular de sus dos RIIID, asistida por el acompañamiento de ARN vinculante dominios, PAZ, y dsRBD. El dominio de PAZ Dicer podrán participar en el reconocimiento de la terminal 3 'domina de su pre-genes miARN sustrato [35]. En este modelo, cada RIIID cortes un solo capítulo de la ARN dúplex sustrato después de dos vueltas de α-hélices, al final opuesto al que exfoliados de Drosha, para producir un nuevo final que lleven una hidroxilado 2 nt 3 'y un sobreendeudamiento fosforilados 5 'End. El 2 nt sobreendeudamiento se mide por la adecuación de la dímero más que por la distancia entre activos residuos en una cadena de péptidos, mientras que la duración del producto (~ 21 nt) está determinada por la distancia entre la PAZ de dominio y el sitio activo [ 35].

El estudio genético reveló que Dicer es esencial para el desarrollo de mamíferos, como Dicer-ratones deficientes mueren en la fase embrionaria [50, 51]. Sin embargo, la DCR -1 gen puede ser interrumpido en ratones embrionarios (ES) de las células condicional de genes orientación. La generado Dicer nulo células madre embrionarias son viables, a pesar de ser totalmente deficiente en la generación de miRNAs, y mostrar graves defectos en la diferenciación tanto in vitro como in vivo [52]. Similar condicional inactivación del gen Dicer en líneas de células ES en peligro la proliferación, así como los genes miARN maduración, posiblemente racionalizar el fenotipo observado en Dicer nulo animales [53]. Silenciamiento epigenético de las secuencias centroméricas repetir [52, 53] y la expresión de dsRNAs homóloga pequeños [52] También se redujo notablemente en Dicer nulo células madre embrionarias. Re-expresión de Dicer en eliminatorias células rescatado estos fenotipos [52]. Estos resultados sugieren la participación de Dicer en múltiples procesos biológicos fundamentales en los mamíferos, que van desde la diferenciación de células madre para el mantenimiento de la estructura de la heterocromatina centromérica y centroméricas silenciar [52].

Es pertinente señalar que Dicer es potently actividad estimulada por la escasez de proteólisis inducida por bajas concentraciones de proteinasa K in vitro [47, 48], lo que indica la presencia de dominios intrínseca de reglamentación de la actividad Dicer. Como se informó recientemente, las proteínas celulares que interactúan con Dicer como Ago2 [54], X frágil retraso mental proteína (FMRP) [55], TRBP [56, 57], y la proteína kinasa R (PKR)-la activación de la enzima (PACT) [ 58] también pueden representar los principales reguladores de la actividad Dicer. Además, Dicer acaba de poner de manifiesto que se parte de un efector miRNP [24], con lo cual el acoplamiento y la puesta en marcha de medidas efector genes miARN guiada por silenciamiento de ARN.

TRBP

TRBP fue identificado y caracterizado en 1991 como un factor celular que actúan en sinergia con la proteína viral Tat transactivation en el de la repetición terminal larga (LTR) del virus de inmunodeficiencia humana tipo 1 (VIH-1), dando lugar a la transcripción de genes virales [59] . TRBP existe principalmente en dos isoformas diferentes: TRBP1 y TRBP2 [60], que poseen tres dsRBDs y una base C-terminal, coexisten en la célula y están codificados por dos alternativamente iniciado isoformas de mRNA que difieren en sus 5 'termina. TRBP2 es de 21 aminoácidos de más de TRBP1 [60 - 62]. TRBP También se ha demostrado que obligar Impuesto humanos de células T-1 del virus de la leucemia, aunque esta interacción transactivating inhibe la actividad de Impuestos [63]. Otra función de TRBP es la inhibición de la inducida por interferón dsRNA-PKR regulados [64].

Recientemente, TRBP ha informado a desempeñar un papel en los genes miARN guiada por silenciamiento de ARN. TRBP fue identificado por el análisis proteómico de immunoprecipitates preparado a partir de HEK 293-derivados estables las líneas celulares que expresan el pabellón de etiquetado Dicer [56]. Además los análisis revelaron la asociación de Dicer-TRBP con Ago2 y el requisito de TRBP para la contratación de Ago2 a la siRNA obligado por Dicer. TRBP se muestra para facilitar la división de pre-miRNAs in vitro y optimizar RNA mediada por silenciamiento de siRNAs y endógenos miRNAs [57]. Estos resultados apoyan el papel de TRBP, la primera Dicer-que interactúan las proteínas identificadas desde Ago2, Dicer en la prestación de asistencia en función de pre-procesamiento de los genes miARN complejo y contribuir a RISC asamblea de la contratación de Ago2 a los genes miARN.

A Dicer interacción con el homólogo de Drosophila humanos TRBP, locuaz (Loqs), que comparten el 34% de identidad en el nivel de aminoácidos, también fue observado por dos grupos independientes [65, 66]. En cuanto a la alimentación humana TRBP, Loqs se requiere para el procesamiento normal de pre-miRNAs por Dicer-1 [65, 66] y eficiente para los genes miARN mediada por silenciamiento en distintos contextos [65]. De este modo, cada mosca conocida RNasa III es emparejado con una dsRBD que contienen la proteína que facilita su función en los pequeños ARN biogénesis.

R2D2

La generación de siRNA complejo purificado de células Drosophila S2 consta de dos subunidades stoichiometric: Dicer-2 y R2D2 [67]. R2D2, que fue nombrado así porque contiene dos dsRNA vinculante dominios (R2) y se asocia con la DCR-2 (D2) en Drosophila [67], es homóloga a C elegans RDE-4 [68, 69]. El Dicer-2/R2D2 complejo, pero no Dicer-2 por sí sola, se une a siRNA y aumenta la secuencia específica de ARNm de la degradación mediada por los RISC. R2D2 Se ha demostrado que actuar como un biosensor para detectar diferencias termodinámico de la base de sincronización en las extremidades de un siRNA [70]. Así, en concierto con Dicer-2, R2D2 determina que siRNA capítulo se incorporarán en los RISC y también puede discriminar un impostor siRNA [71, 72]. Estos resultados indican que R2D2 puentes y la puesta en marcha de medidas efector Drosophila RNAi la vía de facilitar el paso de siRNA a Dicer RISC. Ya sea un mecanismo similar opera en los seres humanos aún no se ha investigado.

RISC y miRNPs

El o los genes miARN siRNA generados por Dicer se carga en un efector miRNP o siRNP compleja, respectivamente, y las guías para el reconocimiento y la regulación del mRNA blanco. El ARNm específicamente reconocidos por el RNP complejos inicialmente ser exfoliados o translationally reprimidos, dependiendo de si la guía: mRNA emparejamiento es perfecto o no [25]. En los seres humanos, la regulación del mRNA de miRNAs se cree que consisten principalmente en la represión de traducción, aunque un estudio reciente informó de que miRNAs downregulate un mayor número de transcripciones que se pensaba anteriormente [73]. Yekta et al [74] demostraron que MIR-196 muestra perfecta complementariedad (presencia de un único G: U wobble) con HOXB8 mRNA y dirige su división en embriones de ratón. Los genes de Mir-196 mapa para homeobox (HOX), agrupaciones, que codifican factores de transcripción esencial para el programa de desarrollo en los animales. Bagga et al [75] observó que el dejar que los genes miARN-7 induce la degradación de su objetivo, lin-41, en C elegans. Por otra parte, se observó que el nivel de los lin-4 genes miARN objetivos, lin-14 y lin-28, se redujo en respuesta a lin-4 de expresión. Estas observaciones sugieren que mRNAs que contienen los genes miARN parcial complementario sitios pueden no sólo ser objeto de represión traslacional, sino también ser objeto de degradación en vivo.

Los estudios iniciales sobre el RISC informó de la existencia de un gran (~ 150 kDa a ~ 500 kDa) multiproteicos RNP complejo que exhiben secuencia específica de la actividad nucleasa [54, 76, 77]. Los pequeños RNAs de ~ 21 a 25 nt se encontraron a copurify con el RISC aislado de las células Drosophila S2 [76], una característica compartida por los complejos RISC de otras especies [78]. Un estudio realizado por Pham et al [78] siempre que el primer vistazo del mecanismo involucrado en RISC de montaje. Los autores proponen un período de tres etapas el modelo de formación RISC en Drosophila. Aislamiento de tres complejos, con el nombre R1, R2 y R3, por electroforesis en gel nativo puso de manifiesto que siRNA vinculante a Dicer-2 es responsable de la formación de R1. R1 es probablemente el ~ 360 kDa complejo como el descrito RISC [77]. R1 sirve como un precursor para formar tanto la R2 y R3 complejos. R3 es un gran aumento de ATP-complejo que contiene siRNAs desenrollada, cofractionates con RNAi factores conocidos, se une y cleaves orientados mRNAs en un siRNA afines que dependen de manera [78].

Recientemente, tres estudios publicados en el mismo número de Cell [24, 79, 80] proporcionaron más pistas sobre la composición, la concentración, y la función de los RISC. Gregory et al [24] mostró que el ser humano RISC se compone de al menos tres proteínas: Dicer, TRBP, y Ago2. Recientemente, la proteína dsRBD PACT también se encontró a estar asociado con Dicer, hAgo2, y en un TRBP ~ 500 kDa y compleja para funcionar como un componente del RISC [58]. En primer lugar, una ATP-dependientes helicasa se propone separar las dos vertientes siRNA, uno de los cuales se cree que obligar a Ago2. Sin embargo, un reciente modelo de consenso sugiere que Ago2 directamente recibe el doble hundidos siRNA y cleaves el siRNA capítulo en lugar de pasajeros, con lo que la liberación de los ss guía para mediar división o la represión de la ARN objetivo [24, 79, 80]. En contraste, los pasajeros de la línea división no es importante para la incorporación de miRNAs que se derivan de duplexes coincidentes, lo que sugiere que este mecanismo no podrá aplicarse a miRNAs endógena en los seres humanos.

En 2002, Mourelatos et al [81] informó de la identificación y caracterización de un complejo miRNP que registran una elevada semejanza con el RISC. Los autores aislados una amplia gama de miRNAs que forman un complejo con tres grandes proteínas: Gemin3, Gemin4, y EIF2C2 (hAgo2). Gemin3, a 105 kDa DEAD-box putativo helicasa, pueden estar involucrados en la anulación de dos genes miARN hundidos y la liberación de los genes miARN * capítulo para el reconocimiento de la meta.

P-/GW-bodies

¿De dónde procede el miRNP ARNm mediada por la regulación o división se producen en la célula? Estudios recientes revelaron la existencia de focos específicos frente al citoplasma, denominado transformación (P-órganos) [82, 83] o GW182 que contienen organismos (GW-órganos) [84]. El GW órganos, que fueron nombrados así porque contienen el GW182 RNA-proteína de unión, se enriquecen en proteínas que participan en la degradación de ARNm [85]. Liu et al [82] demostraron la localización de Ago proteínas de mamíferos en P-cuerpos. De hecho, Ago proteínas se encontraron para interactuar con GW182 [86]. Silencios de GW182 o mutaciones que impidieron Ago proteínas en la localización de problemas de traducción P-/GW-bodies represión de mRNAs [86]. La presencia de siRNAs exógenos También se detectó en esos órganos [87]. Estos estudios apoyar un vínculo funcional entre P-/GW-bodies frente al citoplasma de mRNA de traducción y la represión mediada por miRNAs.

Estos citoplásmica P-/GW-bodies puede no ser la única sitios de la degradación del mRNA en la célula. Dos grupos independientes también ha detectado un RISC-como la actividad en el núcleo de células de mamíferos cultivadas [88, 89]. Es tentador especular que el efector complejo nuclear de mediación esta actividad puede estar estrechamente relacionado con el ARN inducida por la iniciación de silenciamiento génico transcripcional (RITS) complejo se encuentra en S pombe [90].

Ago2

Ago2 es miembro de la PAZ y Piwi dominio (PPD) familia de proteínas, que se compone de proteínas muy básicas que están presentes en metazoos y hongos, pero no en el incipiente levadura Saccharomyces cerevisiae [91, 92]. Ocho miembros de la familia Ago se expresan en los seres humanos [93], y las isoformas Ago1 a 4 están estrechamente relacionados. Los cuatro pueden obligar siRNAs y miRNAs, pero sólo Ago2 está presente en un ARNm-RISC división competente [94, 95]. Varios paralogues de Ago proteínas se encuentran en los reinos y su número varía de 1 a S pombe [96] para más de 20 en C elegans [43, 97].

Estudios estructurales han aportado ideas clave en el mecanismo de RNAi. Ago2 se compone de una central PAZ y un dominio C-terminal PIWI dominio. La resonancia magnetica nuclear solución estructura de la Drosophila Ago1 PAZ dominio obligada a ARN se resolvió recientemente [98, 99]. La estructura consta de un zurdo, de seis hundidos β-barril tope de uno de sus extremos por dos α-hélices y envuelto en una cara por un distintivo apéndice, que comprende una larga horquilla β-y un breve α-hélice. Combinada estructural y vinculante de los estudios PAZ dominio indicó que proporciona un carácter vinculante para el bolsillo 3 'protuberantes extremos de siRNAs [98 - 101].

Estudios estructurales reveló que la PIWI dominio consta de 5-β-hundidos hojas rodeadas por tres hélices [102] vinculante y media de la RNA ss 5 'finales [103 - 105]. La estructura de Archaeoglobus fulgidus PIWI dominio en un complejo con siRNA-como dúplex, que imita los 5 'final de un filamento del RNA guía obligada con vistas a un objetivo ARNm, se ha resuelto. Este estudio reveló la presencia de un metal altamente conservadas-lugar de unión que las anclas de los 5 'nt de la guía de ARN [105]. Estudios estructurales PIWI también determinó que el dominio catalítico de la actividad de nucleasa Ago2, dada su semejanza con RNasa H [95, 102, 104], en términos de estructura y actividad; como RNasa H, Ago2 actividad es dependiente de cationes divalentes como Mg 2 + o Mn 2 + [106]. El PIWI dominio y RNasa H también comparten un motivo de DDE, similares a las presentes en el centro catalítico de la integrasa proteínas [107].

Información estructural de Pyrococcus furiosus Ago [102], junto con la demostración de que Ago2 es el núcleo de corte de la máquina RISC humanos [95, 108], a condición de fuertes evidencias que sugieren que el dominio PIWI pueden ser responsables de esta mediación "Slicer". Esta posibilidad fue apoyada asimismo por las observó inhibición de la meta mRNA división actividad debido a la supresión de la DDE motivo de hAgo2 [95]. En siRNA guiada por silenciamiento de ARN, Ago2 cleaves, en un ATP de manera independiente, phosphodiester la columna vertebral de la meta mRNA entre los nucleótidos 10 y 11, según los cálculos de la ARN guía 5 'finales [80, 94, 109].

El mecanismo de traducción represión mediada por proteínas Ago todavía no está claro, aunque evidencias recientes sugieren la posibilidad de que algunos Ago-que contienen complejos Mayo reprimir la traducción en los órganos P-[110, 111].

FMRP

En humanos, la pérdida de función de mutaciones en el FMR1 (retraso mental frágil 1) producto génico FMRP es la causa de la más común de retraso mental, el síndrome X frágil [112, 113]. Una expansión de la repetición de CGG en la 5'NTR de FRM1 se asocia con problemas de metilación del ADN de la isla CpG y la CGG se repita, lo que resulta en una inhibición de la transcripción y traducción [114, 115].

FMRP es un ARN citoplásmico de la proteína de unión que se encuentran asociados con polyribosomes como parte de un mRNA ribonucleoprotein (mRNP) compleja, lo que sugiere un papel para FMRP en la traducción del mRNA reglamento [112]. De hecho, esta proteína de 632 aminoácidos, que contiene dos K-homología (KH) dominios y un cuadro de RGG, actúa como un regulador negativo de la traducción in vitro e in vivo [116 - 118]. A relationship between FMRP and the RNAi pathway was unveiled by the copurification of dFMR1 with the Drosophila RISC, which also contains Ago2 and the vasa intronic gene (VIG) [ 119 ]. Similarly, Ishizuka et al [ 55 ] used a tandem affinity purification approach to isolate an RNP complex that contains dFMR1, Ago2, the RNA helicase Dmp68, and the ribosomal proteins L5/5S RNA and L11. Ishizuka's group demonstrated that dFMR1 is a component of the RISC effector complex and is associated with Dicer and Ago2 [ 55 ]. Knockdown of dFMR1 by introduction of dFMR1 dsRNA had only mild effects on the efficiency of RNAi [ 55 , 119 ].

The work of Jin et al [ 120 ] suggested that FMRP could interact with miRNAs, Dicer, and Ago1 in mammalian cells in vivo, raising the possibility that FMRP could use miRNAs to regulate translation of specific mRNAs. Indeed, a recent study from our laboratory showed that human FMRP can act as an miRNA acceptor protein for Dicer and facilitate the assembly of miRNAs on specific target RNA sequences [ 121 ]. This activity appears to be mediated by the KH domains. In this study, the requirement of FMRP for efficient RNAi in vivo was unveiled by reporter gene silencing assays using various small RNA inducers, which also supported its involvement in an ss siRNP effector complex in mammalian cells. These results defined a possible role for FMRP in miRNA-guided RNA silencing and provided further insight into the molecular defects in patients with the fragile X syndrome.

VIG

The VIG protein has been shown to be associated with the Drosophila RISC [ 119 ]. An evolutionarily conserved protein expressed in C elegans , A thaliana , S pombe , and mammals, VIG has no recognizable protein domains other than an RGG box, a motif that is known to bind RNA. Although no function has been assigned to VIG, its human homologue, plasminogen activator inhibitor (PAI)-RBP-1, was originally identified as a protein having an affinity for AU-rich elements (ARE) located in the 3′NTR of PAI RNA and regulating its stability [ 122 ]. The authors also demonstrated the importance of Dicer and miR-16, a human miRNA containing a sequence complementary to ARE, in conferring instability to ARE-containing mRNAs. This suggests an interesting connection between the components of the miRNA-guided RNA silencing pathway and regulation of the stability of mRNAs containing AREs, which are known to act in cis to regulate rapid turnover of unstable mRNAs [ 123 ] in their 3′NTR. The exact role of VIG in that context remains to be investigated.

Tudor-SN

The staphylococcal nuclease Tudor (Tudor-SN) has been identified as a component of the RISC in C elegans, D melanogaster , and humans [ 124 ]. Tudor-SN contains five staphylococcal/micrococcal domains and a tudor domain. At first, Tudor-SN was suspected to be the nuclease responsible for the RISC-mediated mRNA target cleavage. However, studies demonstrating that the nuclease activity of the RISC is Mg 2+ -dependent [ 106 ] and produces 5′-phosphomonoester ends [ 125 ] did not support this hypothesis, as Tudor-SN is rather a Ca 2+ -dependant nuclease that generates 3′-phosphomono- and dinucleotides from DNA or RNA substrates [ 126 ].

Recently, a novel relationship was established between Tudor-SN and adenosine deaminases that act on RNA (ADARs). Members of the ADAR family exhibit affinity with dsRNAs and mediate an RNA editing reaction that substitutes adenosine (A) residues by inosines (I) in cellular mRNAs or other dsRNA targets [ 127 ]. Scadden [ 128 ] showed that Tudor-SN specifically interacts with and promotes the cleavage of model hyper-edited dsRNA substrates containing multiple IU and UI pairs. Yang et al [ 129 ] have recently reported that the edition of pri-miR-142 resulted in the suppression of its processing by Drosha, and was instead degraded by Tudor-SN. Similarly, pre-miRNAs have also been shown to be edited by ADARs [ 130 ]. ADAR-induced modification of pri- and pre-miRNA sequences may also contribute to diversifying and influencing the genetic control mediated by miRNAs. For example, structural changes induced by A-to-I edition of pri- and pre-miRNAs may hamper their recognition and processing by the dsRNA-cleaving Drosha and Dicer RNases [ 131133 ]. These studies reveal a new function for RNA editing in the control of miRNA biogenesis.

RITS complex

In the fission yeast S pombe , dsRNA arising from centromeric repeats targets the formation and maintenance of centromere function through RNAi-mediated histone H3 lysine-9 (K9) methylation [ 90 ]. This is accomplished by the effector complex RITS, which contains the proteins Ago1, Chp1, and Tas3, in addition to small RNAs [ 96 ] generated by Dicer [ 134 ]. Homologous to centromeric repeats [ 135 ], these small RNAs appear to guide the RITS components to heterochromatic regions, such as the centromeres, the mating-type region, and the telomeres [ 136 , 137 ]. Upon centromeric binding, RITS promotes Clr4-mediated methylation of histone H3 K9, recruitment of Swi6 [ 138 ], and formation of heterochromatin [ 96 ]. Recently, a study concluded that Dicer and the RNAi machinery were involved in the formation of heterochromatin in higher vertebrate cells, as suggested previously [ 134 ]. The discovery of the effector RITS complex supports a nuclear function for small RNAs derived from Dicer.

IDENTIFICATION OF miRNAs AND THEIR TARGETS

As the major protein components of the miRNA-guided RNA silencing pathway are being identified and characterized, hundreds of new miRNAs are being discovered in several different species. The fact that the interaction between miRNAs and the mRNA targets they regulate is based mainly on partial, rather than perfect, complementarity renders target idenfication rather arduous. However, improvement of our understanding of the determinants governing mRNA recognition by miRNAs has allowed the development of several predictive bioinformatic tools. The growing number of miRNA targets and functions, as revealed by various experimental approaches, let us foresee the importance and complexity of the gene regulatory network utilizing miRNAs.

Identification of miRNAs

Almost 8 years after the discovery of the ncRNA lin-4, known for its crucial role in developmental timing in C elegans [ 3 , 5 ], three independent groups defined miRNAs as a novel family of small (∼ 22 nt) regulatory RNAs that are diverse in sequence and expression patterns, and evolutionarily widespread [ 1012 ]. The authors used different strategies to identify new miRNAs from various species. miRNAs showing features reminiscent of Dicer cleavage can be cloned by reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) on size-fractionated RNA populations. If their sequences are known or predicted, and if they are abundant enough, miRNAs can be detected by Northern blot analysis.

Rapid and large-scale identification of miRNAs prompted experts in the field to establish guidelines for miRNA annotation and institute different criteria, based on expression and biogenesis, for an RNA to be considered as an miRNA [ 139 ]. First, a 22 nt RNA transcript must be detected by Northern blot analysis. Second, the RNA transcript must be detected in a cDNA library prepared from size-fractionated RNA samples. Third, bioinformatic analyses must predict a hairpin-loop structure encoded in the genome and the sequence has to be located on one arm of this structure with a lowest free energy. The hairpin should have small bulges and approximately 60–80 nt in length. Phylogenetic conservation among species represents another important feature which, however, excludes miRNAs that have either disappeared, appeared, or evolved during the course of evolution.

Computational algorithms designed to identify hairpin-loop structures and sequence conservations across species are very useful, especially for less abundant or tissue-specific miRNAs. These small RNAs can be regrouped into families, based on the sequence of their 5′ region [ 139 ]. One computational algorithm that has been developed and tested with C elegans , miRScan, uses different characteristics to identify miRNA genes. It has been designed to find conserved sequences upstream and downstream of the miRNA foldback, identify specific adjacent sequences that can be involved in miRNA transcription or processing, and determine the location of cotranscribed miRNAs in orthologous host genes [ 140 ].

miRBase is the new home of the miRNA data on the web, accessible at the following address: http://microrna.sanger.ac.uk/ [ 141 ]. It provides information previously accessible from the miRNA registry [ 142 ]. As of May 2006 (release 8.1), there were 462 human miRNA sequences among 3963 entries.

To date, miRNA genes constitute about 2% of the predicted genes in mammals. They may be constitutively or developmentally regulated and expressed at various levels in different tissues. Recent estimates suggest that between 30% and 50% of the genes may be regulated by miRNAs [ 144 , 145 ]. This raises the possibility that all the cellular pathways may be governed by miRNAs. However, the question remains: which mRNAs are subjected to miRNA regulation?

Identification of miRNA targets

Identification of miRNA targets is a key step in understanding the biological function of miRNAs. However, the progress of this work is hampered by the mode of mRNA recognition by the regulatory miRNAs itself, which is based on imperfect sequence complementarity [ 25 ]. Characterization of a few experimentally validated miRNA:mRNA interactions allowed to establish a context in which this interaction is favored and helped to develop very useful bioinformatic approaches to identify them. Initial studies indicate that a given miRNA may regulate several different mRNAs and that, conversely, a specific mRNA can be regulated by more than one miRNAs.

Several algorithms currently available on the web, such as TargetScan ( http://genes.mit.edu/targetscan/ ) [ 146 ], Miranda ( http://www.microrna.org ) [ 147 ], and DIANA-microT ( http://www.diana.pcbi.upenn.edu/ ) [ 148 ], combine different parameters of the sequence requirements for miRNA:mRNA binding as predictive methods to identify targets. These computational tools are designed to scan the 3′NTR of mRNA targets, to search for the miRNA seed and to determine the free energy of the interaction. They can also take into account the phylogenetic conservation and the presence of more than one miRNA binding site in a given 3′NTR. Because each of these methods uses different miRNA:mRNA target predictive determinants, the results obtained may differ from one to another. Nevertheless, these bioinformatic tools are crucial in providing initial cues as to the possible mRNA targets regulated by specific miRNAs. They also offer a certain basis for initiating experimental validation on miRNA:mRNA target pair of interest. In turn, a better comprehension of the interaction between miRNAs and their targets will permit the improvement of these predictive methods.

Vella et al [ 143 , 149 ] studied the well-characterized let-7:lin-41 interaction to better understand the architecture and requirements of miRNA:mRNA target recognition. Although the lin-41 mRNA target bears six putative let-7 miRNA binding sites, only two of them appear to be necessary for lin-41 regulation (see Figure 3 ). These two sites are separated by a 27 nt sequence. Generally, the miRNA seed consists in a perfect pairing between miRNA nucleotides 2 to 8 with a sequence located in the 3′NTR of its mRNA target. Although pairing of the 3′ region of an miRNA seems to be less important, it may compensate a weaker binding of the 5′ region. The authors also observed that lin-41 regulation by let-7 was lost upon substitution of the intervening 27 nt sequence by another [ 143 ]. This suggests that miRNA:mRNA interactions do not rely solely on the regions of complementarity and may be more complex than previously thought.

In spite of the difficulties to identify miRNA targets, several groups have found their way to assign a biological function to some miRNAs. Hematopoietic cell lineages derived from mouse bone marrow express specific miRNAs that regulate differentiation. Chen et al [ 150 ] analyzed three miRNAs, miR-181, miR-223, and miR-142 that were differentially or preferentially expressed in hematopoietic cells. They observed that overexpression of these miRNAs in undifferentiated progenitor cells derived from mouse bone marrow altered lineage differentiation. They further analyzed the effects of miR-181 in vivo by infecting mouse Lin bone marrow cells with a viral vector expressing this miRNA and observed that mice expressing miR-181 had a substantial increase in B-lymphoid ( CD19 + ) cells. Lim et al [ 73 ] used a microarray approach to identify miRNA targets after overexpression of known miRNAs. They found that 174 genes were downregulated following overexpression of miR-124, an miRNA preferentially expressed in the brain, in HeLa cells. Incidentally, the target genes were expressed at low levels in the brain. Thus, the expression of miR-124 in HeLa cells caused a shift in gene expression profile towards that of the brain. Using the same approach, expression in HeLa cells of miR-1, expressed in muscle, shifted the expression profile of HeLa cells towards that of the muscle.

BIOLOGICAL FUNCTION OF miRNAs

As experimental evidences are accumulating on how miRNAs recognize and regulate specific mRNA targets, we are beginning to understand the exact function of each miRNA as well as the cellular processes they are regulating. Information pertaining to the biological function of miRNAs in different species, which is the subject of this section, is summarized in Table 2 .

miRNAs and development

Developmental studies of the nematode C elegans led to the discovery of the first small noncoding regulatory RNA, lin-4. C elegans proceeds through four larval development stages termed L1 to L4. Transition from one stage to the next is dictated by temporally regulated heterochronic genes, which are involved in developmental regulatory cascades. Wightman et al [ 4 ] first reported that short repetitive sequences in the 3′NTR of the heterochronic gene lin-14 were negative regulatory elements of Lin-14 expression. The observed increase in Lin-14 protein synthesis associated with two gain-of-function mutations in the 3′ NTR of lin-14 mRNA [ 4 ] was instrumental for this discovery. More than two years later, Lee et al [ 3 ] identified two lin-4 transcripts, one of 61 nt and another of 21 nt. Furthermore, they observed that the lin-4 smaller transcript was complementary to seven repeated sequences in lin-14 3′NTR, identified previously by Wightman et al [ 4 ]. These findings suggested that lin-4 could regulate lin-14 translation via an antisense RNA:mRNA interaction [ 3 ]. Recently, Boehm and Slack [ 169 ] found that lin-4 and lin-14 expression control life span through adulthood, since lin-4 loss-of-function mutant is associated with a shorter life span as compared to wild-type nematodes, whereas overexpression of lin-4 prolonged it. They also noted that animals carrying a temperature-sensitive loss-of-function mutation in lin-14 had a 31% longer life span than wild-type, which is consistent with the phenotype observed with lin -4 [ 169 ].

A second small ncRNA, let-7, was later identified and found also to regulate the transition from late larval L4 to adult stage through the regulation of heterochronic genes in C elegans [ 152 ]. Northern blot analyses revealed that the miRNA let-7 is expressed in a wide range of species, including worm, fly, and human, as opposed to lin-4, and seems to regulate late developmental transition in different species [ 153 ]. Three let-7 miRNA family members, miR-48, miR-84, and miR-241, were identified on the basis of sequence identity of 8 consecutive nucleotides in their 5′ region [ 11 , 170 ]. let-7 regulates lin-41, hbl-1, and daf-12 [ 149 , 152155 ]. The other members of the let-7 family appear to regulate hbl-1 in the L2 to L3 transition [ 157 ]. let-7 also appears to be important for zebrafish embryo development, since injection of a synthetic let-7 miRNA duplex into zebrafish zygotes causes severe growth defect [ 171 ]. Embryos of a maternal-zygotic zebrafish Dicer mutant that were unable to process pre-miRNA into miRNA showed abnormal brain morphogenesis [ 172 ]. This brain defect was rescued by the injection of a preprocessed, mature miRNA, miR-430. The miRNA expression profile of zebrafish embryos is highly tissue-specific during segmentation and later stages, but not in early development, suggesting that miRNAs may play a more prominent role in differentiation or maintenance of tissue identity, rather than in directing tissue fate [ 173 ] .

miRNAs have also a major role in developmental regulation in fly. This conclusion came from miRNA loss-of-function analyses using 2′ O-methyl (Me) antisense oligoribonucleotides in Drosophila embryos [ 159 ]. In these analyses, depletion of as many as 25 of 47 miRNAs expressed in early development caused a severe developmental phenotype. In situ hybridization analyses, using probes recognizing 38 different miRNAs in Drosophila embryos, indicated that the expression profile of most of them is comparable to their vertebrate counterparts [ 174 ], suggesting an evolutionarily conserved role for miRNAs in development.

Recently, two groups independently reported the cloning of the mouse and chicken homologues of C elegans lin -41 [ 175 , 176 ]. They found that mlin-41 and clin-41 are implicated in limb development. Bioinformatic analyses confirmed the presence of let-7 binding sites in the 3′NTR of these two genes. In mice, targeted disruption of the Dicer1 Dicer1 gene was lethal in early development, indicating that Dicer function is essential for proper development in mammals [ 50 ]. Harfe et al [ 177 ] used an inducible inactivation system of Dicer1 to study its importance in late development in mice. In this model, depletion of Dicer led to a severe defect in limb formation.

miRNAs and heterochromatin

The RNAi pathway was also reported to play a role in nuclear events such as genome rearrangement [ 178 ], gene inhibition [ 90 , 134 , 179 ], and chromosome segregation [ 134 ], supporting the idea that the genome integrity itself is preserved by small regulatory RNAs. In a model proposed by Noma et al [ 136 ], dsRNA transcripts are cleaved by Dicer to produce siRNAs, which are incorporated into the RITS complex and guide it to heterochromatic regions, probably through interactions with DNA or native RNA transcripts. Once localized at the siRNA homologous target sequence, the RITS complex recruits the Clr4 methyltransferase that catalyzes methylation of histone H3 at lysine 9. This creates binding sites for the heterochromatin protein Swi6 which, in turn, leads to the recruitment of additional Clr4 and further H3-Lys9 methylation of adjacent nucleosomes. These modifications allow the binding of RITS in a Dicer-independant manner via the chromodomain of Chp1 and the maintenance of gene repression at the transcriptional level. Although this process was first documented in S pombe [ 96 , 136 , 180 ], recent reports indicate the occurrence of a similar transcriptional gene silencing phenomenon in the nucleus of human cells [ 181 , 182 ]. Altogether, these studies reveal a key role for Dicer-derived small RNAs in guiding the RITS complex and regulating the transcriptional and posttranscriptional status of host gene expression.

miRNAs in cell growth and apoptosis

Cell growth and programmed cell death are important processes implicated in both development and differentiation. The bantam gene identified in Drosophila was first discovered on the basis of its effect on tissue growth: tissues were larger when bantam was overexpressed and smaller when bantam expression was suppressed. Although smaller, the flies were proportional and did not exhibit patterning defects [ 158 ]. Later, the same group determined that the bantam gene encoded for an miRNA, not for a protein, that controlled the proapoptotic gene hid . Thus, bantam promotes proliferation while inhibiting apoptosis [ 183 ]. Additional miRNAs involved in the regulation of pro-apoptotic genes in Drosophila were discovered in loss-of-function experiments. In that context, a family of miRNAs comprising miR-2, miR-6, miR-11, miR-13, and miR-308 has been found to be required for suppression of embryonic apoptosis [ 159 ].

Chang et al [ 184 ] used a library of miRNA antisense oligonucleotides bearing 2′ O-Me modifications to inhibit miRNA function in HeLa cells. Monitoring changes in cell growth and apoptosis, they identified several important regulatory miRNAs. In the highly malignant human brain tumor glioblastoma, miR-21 was strongly overexpressed. When miR-21 was knocked down in glioblastoma cultured cells, caspases were activated, causing an increase in cell apoptosis [ 160 ]. This suggests a role for miR-21 as a suppressor of apoptosis in this malignant tumor [ 160 ]. In chronic lymphocytic leukemias (CLL), the antiapoptotic protein B-cell lymphoma 2 (Bcl2) is overexpressed [ 161 ]. Interestingly, frequent deletions and downregulation of the miR-15 and miR-16 genes at the chromosome locus 13q14 are observed in the majority of CLLs [ 162 ]. These findings suggest a role for miR-15a and miR16-1 as repressors of Bcl2 expression and possible inducers of apoptosis [ 161 ].

RELATIONSHIP BETWEEN miRNAs AND DISEASES

Given their recognized importance in gene regulation, a link between miRNAs and several major diseases is expected. For example, defects in miRNA-mediated regulation of mRNA translation may lead to overexpression of specific proteins, which accumulation may cause diseases. In fact, intriguing connections between miRNAs and diseases, such as cancer and viral infections, are emerging.

miRNAs and cancer

A recent study reported that human miRNA genes are frequently located at fragile sites and genomic regions involved in cancer [ 185 ]. Indeed, Calin et al [ 162 ] observed frequent deletions and downregulation of miR -15 and miR -16 genes at 13q14 in CLL. These miRNAs have been shown to negatively regulate the antiapoptotic Bcl2 protein at the posttranscriptional level [ 161 ]. BCL2 repression by these miRNAs induced apoptopsis in a leukemic cell line model [ 161 ], thereby providing a link between the absence of miR-15/miR-16 and leukemia.

Northern blot analyses showed that miR-143 and miR-145 expression is downregulated in various human cell lines derived from breast, prostate, cervical, lymphoid cancers, and, particularly, colorectal tumors [ 163 ]. Potential targets of these miRNAs have been previously implicated in oncogenesis [ 163 ].

A relationship between miRNAs and Burkitt lymphoma (BL) has been suggested. miR-155 is encoded within nucleotides 241–262 of the BIC gene, which is located on chromosome 21. Both the BIC and miR -155 genes are overexpressed in some BL patients, but not in all BL cases [ 164 , 186 ]. Abnormal miRNA expression may thus contribute to the transformation of B cells [ 164 ].

Another miRNA cluster, miR-17-92, is often overexpressed in tumor samples from B-cell lymphomas when compared to normal cell lines [ 165 ]. This cluster is present in an amplified DNA region encoding for the ORF c13orf25 . Alignment of this ORF between mouse and human indicates that the polycistron and its immediate flanking sequences only are conserved. The c13orf25 transcript contains seven pre-miRNAs encoding for miR-17-5p, miR-17-3p, miR-18, miR-19a, miR-20, miR-19b-1, and miR-92-1. Using a microarray analysis of 191 mature miRNAs, five miRNAs from the cluster were found to be highly expressed in B-cell lymphomas, in correlation with an increased expression of c13orf25 [ 165 ]. These studies revealed that the miR-17-92 cluster can act as a potential human oncogene, and was referred as oncomiR-1 by Hammond and colleagues [ 165 ].

Another group subsequently reported that the miR-17-92 cluster was overexpressed in human lung cancer cell lines [ 187 ]. When analyzing the subcellular localization of the c13orf25 transcript, they observed a nuclear localization, restricting its cytoplasmic localization for translation. This suggested that this transcript can act as a vehicle for the expression of the miR-17-92 cluster. Its predicted targets include the tumor suppressor genes PTEN and RB2 [ 146 ]. In a mouse B-cell lymphoma model, the overexpression of miR-17-92 accelerates tumor formation induced by the product of the MYC gene [ 165 ], which encodes an important transcription factor that regulates cell proliferation, growth, and apoptosis. Modification of MYC expression is a commonly observed deregulation leading to tumorigenesis. O'Donnell et al showed that c-myc, through binding to sequences near the miR-17-92 cluster genomic locus, activates miR-17-92 expression [ 188 ]. Among the predicted targets of the miR-17-92 cluster is the transcription factor E2F1, which appears to be negatively regulated by miR-17-5p and miR-20a [ 146 ]. E2F1 is a cell cycle promoter induced upon c-myc expression. Conversely, c-myc expression is induced by E2F1 [ 189191 ]. Therefore, a balance between the gene regulatory processes involving miRNAs and transcription factors may contribute to finely tune E2F1 expression and to generate a tightly controlled proliferative signal [ 188 ].

The let-7 miRNA also seems to be involved in cancer pathogenesis. Calin et al reported that let -7 genes are deleted in many cancers [ 185 ]. Moreover, a reduction in let-7 expression has been observed in samples of human lung cancers or cancer cell lines. Patients associated with a reduced let-7 expression had the worst prognosis after a potentially curative resection [ 192 ]. It is relevant to note that the overexpression of let-7 in lung cancer cells inhibits growth in vitro [ 192 ]. In C elegans , let-60, the ortholog of the human oncogene RAS, was found to contain eight putative let-7 binding sites in its 3′NTR [ 156 ]. As for the three human RAS genes, they also contain multiple let-7 binding sites, allowing let-7 to regulate RAS expression. Evidences of a downregulatory role for let-7 in RAS expression came from experiments using reporter genes fused to the 3′NTR of NRAS and KRAS [ 156 ]. Introduction of let-7a inhibitors relieved this repression [ 156 ]. In this study, miRNA microarray analyses of 21 different samples from lung cancer patients revealed that the expression of the let -7 gene family was reduced, in association with an increased expression of RAS protein. These data suggest a role for the let-7 miRNA family in the regulation of RAS during development of lung cancer [ 156 ].

Deregulated expression of protein components of the miRNA biosynthetic pathway may also be implicated in cancer formation. Karube et al [ 193 ] recently observed a diminution of Dicer expression in nonsmall cell lung cancer samples taken from 67 patients, as assessed by RT-PCR. As for the let-7 miRNA, this reduction was also associated with shorter postoperative survival [ 193 ]. Thus, the presence of Dicer, which mediates miRNA biogenesis, appears to be required for maintaining normal cell function.

miRNA expression profiling of the affected tissues may eventually be important for improving the diagnosis of diseases, such as cancer [ 194 ]. Using a new miRNA profiling method, Lu et al [ 195 ] analyzed mammalian miRNAs from 334 samples, including human cancers. They observed a characteristic general downregulation of miRNA expression in tumors, as compared to normal tissues [ 195 ]. Similarly, Jiang et al used an RT-PCR approach using primers specific to 222 pre-miRNAs to monitor their expression in human cancer cell lines [ 196 ]. Monitoring of global changes in miRNA expression profiles will be useful to establish possible links between miRNAs and diseases.

miRNAs and viruses

Several studies have reported a role for RNA silencing in host defense mechanisms against viruses in plants [ 197 ], and reports suggest that they may also play a similar role in humans. The interaction between RNA silencing pathways and viruses, such as HIV-1, is complex and multifaceted [ 198 ]. Some viral RNAs exhibit secondary structures that are prone to Dicer processing, as evidenced by the discovery of miRNAs derived from Epstein-Barr virus (EBV), a virus belonging to the herpesvirus family, in infected Burkitt's lymphoma cells [ 199 ]. In this case, miRNAs originate from five precursors present in two different clusters of the genome of EBV [ 199 ]. The overall impact of viral miRNAs on cellular and viral gene expression remains to be fully appreciated. They may target and regulate specific human mRNAs, thereby ultimately influencing cell function and viral replication. Indeed, the potential host mRNA targets of these miRNAs, as predicted by bioinformatical analyses, are implicated in many biological processes, such as transcription, cell proliferation, apoptosis, B cell-specific chemokine and cytokine synthesis, and signal transduction [ 199 ]. These findings illustrate how a virus may exploit the RNA silencing machinery for its own purpose.

miRNAs derived from a virus may also be turned against some of its mRNAs, as exemplified by miR-BART2. This EBV miRNA has been shown to be perfectly complementary to the EBV gene BALF5 , encoding for a DNA polymerase, and to target it for degradation [ 199 , 200 ].

The pathogenic human Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus (KSHV) was recently shown to encode an array of 11 distinct miRNAs, all of which are expressed at readily detectable levels in latently KSHV infected cells [ 201 ]. Computer analysis of potential mRNA host targets for these viral miRNAs included several mRNAs previously shown to be downregulated in KSHV-infected cells, suggesting that KSHV miRNAs play a critical role in the establishment and/or maintenance of KSHV latent infection [ 201 ].

The genome of HIV-1 encodes a gene called nef , which is located in the 3′ region and is overlapping with the LTR. Omoto et al identified a nef -derived miRNA, called miR-N367, produced in cells persistently infected with HIV-1. This miRNA has been shown to downregulate the transcription of the HIV-1 genome in human T cells by targeting the negative responsive element of its 5′NTR U3 region and the nef sequence located in the 3′NTR [ 202 , 203 ]. HIV-1 was also found to generate an siRNA that can mediate nucleic-acid-based immunity and to encode a suppressor of RNA silencing in its Tat protein [ 204 ].

Additional evidences suggest that viruses have evolved to take advantage of RNA silencing pathways to enhance the probability of successful infection. For example, the simian virus 40 (SV40) genome was found to encode a pre-miRNA from which two miRNAs can be derived. Expressed at late times in infection, these miRNAs are perfectly complementary to the early viral mRNAs, and target those for degradation [ 205 ]. SV40-infected cells show a reduced expression of viral T antigens, are less sensitive to lysis by cytotoxic T cells, and trigger less cytokine production [ 205 ].

Cellular miRNAs may also play an important role in virus/host interactions. For example, miR-32 was found to restrict retrovirus primate foamy virus type 1 (PFV-1) accumulation in human cells [ 166 ]. However, PFV-1 may counteract this cellular restriction through expression of Tas, a protein inhibiting RNA silencing in mammalian cells [ 166 ]. Moreover, a study showed that the sequestration of miR-122, an miRNA highly and specifically expressed in the liver, resulted in a marked loss of autonomously replicating hepatitis C virus (HCV) RNAs [ 167 ]. HCV replication thus appears to be facilitated by a genetic interaction between miR-122 and the 5′NTR of the HCV genome, making miR-122 a potential target for an anti-HCV intervention.

As for a possible regulation of HIV-1 replication by human miRNAs, computational predictions identified four possible HIV-1 targets: the nef gene targeted by miR-29a and miR-29b, the vpr gene targeted by miR-149, the vpu gene targeted by miR-378, and the vif gene targeted by miR-324-5p [ 168 ]. Microarray profiling confirmed the expression of these miRNAs in HIV-1 replication-competent human T lymphocytes [ 168 ]. Further investigation is required to determine the biological significance of these cellular miRNAs-HIV-1 interactions.

CONCLUSION

miRNAs are now recognized as key regulators of gene expression. Not surprisingly, causal links between deregulation of miRNA expression and some important genetic diseases are gradually emerging. A better characterization of the miRNA expression profiles observed in various clinical situations may ultimately be useful to physicians in providing signatures for specific tumors or infectious diseases. Further investigations that aim at elucidating and understanding the mechanisms involved in miRNA biosynthesis and function are crucial for the design and development of potentially important diagnostic tools and new therapeutic strategies.

We are grateful to Gilles Chabot for graphic design. MP Perron and L.-A. Gobeil are supported by doctoral and master studentships from the Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC), respectively. P. Provost is a New Investigator of the Canadian Institutes of Health Research (CIHR) and The Arthritis Society. This work was supported by Discovery Grant 262938-03 from NSERC and Grant EOP-64706 from Health Canada/CIHR. DL Ouellet and MP Perron contributed equally to this work. P. Provost is the author for correspondence.