Diagnostic Pathology, 2006; 1: 19-19 (más artículos en esta revista)

Estratificación de pulmón de células no pequeñas de pacientes con cáncer la terapia con factor de crecimiento epidérmico inhibidores del receptor: la fluorescencia EGFR ensayo de hibridación in situ

BioMed Central
Marileila Varella-Garcia (marileila.garcia @ uchsc.edu) [1]
[1] Universidad de Colorado Health Sciences Center, Cancer Center, Aurora, CO, EE.UU.

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Resumen

ADN de fluorescencia de hibridación in situ (FISH) es la tecnología utilizada para el estudio cromosómico y genómico cambios en suspensiones celulares fijas y tejidos bloquear los preparativos. La técnica se basa en la hibridación específica de los pequeños fragmentos de ADN marcado, las sondas, a secuencias complementarias en un objetivo molécula de ADN. Demand for FISH assays in formalin-fixed, paraffin-embedded tissues has been increasing, mainly in conditions in which diagnosis is not achieved in cell smears or tissue imprints, such as solid tumors. Por otra parte, el desarrollo de terapias moleculares dirigidas a la oncología se ha extendido la aplicabilidad de las pruebas para predecir la sensibilidad o resistencia a estos agentes. El uso eficiente de los inhibidores de la tirosina cinasa (TKI) del factor de crecimiento epidérmico receptor (EGFR) como agentes terapéuticos en avanzado de células no pequeñas de cáncer de pulmón (NSCLC) depende de la identificación de los pacientes que puedan demostrar el beneficio clínico de estos tratamientos específicos. El gen EGFR número de copias determinado por FISH se ha demostrado como un eficaz predictor de resultados de CPNM para pacientes EGFR TKIs; sin embargo hay retos pendientes para la normalización de los procedimientos de laboratorio y la definición del sistema de puntuación. Esta metodología artículo se centra en el EGFR prueba FISH. Se detalla el sistema de puntuación utilizado en los estudios realizados en la Universidad de Colorado Cancer Center en el que una asociación significativa entre el aumento de EGFR número de copias y el resultado clínico a TKIs, y propone directrices interpretativas para la estratificación molecular de CPNM para pacientes TKI terapia.

Marcadores predictivos en los carcinomas

La mejora de la supervivencia de pacientes con cáncer ha sido una tarea difícil para todos los oncólogos y otros especialistas médicos relacionados, debido a la complejidad de este grupo de enfermedades. Prevención, detección temprana y la mejora de las opciones terapéuticas son los principales enfoques que pueden hacer la diferencia y han recibido excelente atención de cáncer de médicos, investigadores y organismos de financiación. Mucho se ha aprendido en los últimos diez años sobre la biología del tumor y la genética, y una mejor comprensión de los mecanismos celulares que subyacen a la iniciación y progresión del cáncer ha permitido el desarrollo de innovadoras estrategias terapéuticas. Entre estas se encuentran la base molecular terapias, que para resolver cuestiones concretas de vías de señalización celular que son importantes tumor-conductores.

La terapia molecular dirigida sobre el terreno se encuentra todavía en sus primeras etapas de la exploración. Sin embargo, emocionante resultados se han comunicado con ejemplos dramáticos de la mejora en el resultado de neoplasias anteriormente conocido por su mal pronóstico. Una de las primeras terapias dirigidas validado en oncología implica cáncer de mama metastásico y el anticuerpo monoclonal trastuzumab (Herceptin, Genentech Inc, San Francisco, CA) [1]. En aproximadamente el 20% de los cánceres de mama el factor de crecimiento epidérmico humano receptor 2 gene (c-erb-B2, ERRB2 o HER2), un miembro de la tirosina quinasa del receptor 1 (RTK1) la familia, se amplifica y overexpressed en el receptor y estos tumor de características se asoció significativamente con un mal resultado clínico [2]. Sin embargo, las mujeres con HER2 overexpressing cáncer de mama metastásico recibieron un beneficio significativo de trastuzumab, un anticuerpo monoclonal humanizado recombinante, anticuerpos lanzó como una opción terapéutica en 1998. La selección de estos pacientes para el tratamiento se ha realizado mediante la evaluación de los niveles de expresión proteica en los ensayos de inmunohistoquímica (IHC) y / o el número de copias del gen HER2 en la fluorescencia de hibridación in situ ensayos (FISH) [3, 4].

Más recientemente, uno internacional (HERA) y dos NCI-patrocinado por la fase III de ensayos clínicos (NSABP B31 y NCCTG N9831), que se han inscrito más de 6000 pacientes, han demostrado que la combinación de paclitaxel con trastuzumab tras la quimioterapia adyuvante mejoró significativamente los resultados entre las mujeres con quirúrgicamente eliminado HER-2 positivo el cáncer de mama [5, 6]. Estos resultados amplió el espectro de pacientes con cáncer de mama pueden beneficiarse de la terapia de trastuzumab con metástasis etapa temprana el cáncer de mama.

De células no pequeñas de cáncer de pulmón (CPNM) es otro tumor sólido que se ha producido un impacto favorable de la terapia dirigida. El cáncer de pulmón es un importante problema de salud pública en los países occidentales y ha sido durante mucho tiempo la causa más común de muerte por cáncer [7]. Este cáncer usualmente se diagnostica en fase avanzada, cuando el pronóstico es pobre y las opciones de quimioterapia son limitados. Otro miembro de la familia RTK1, el factor de crecimiento epidérmico receptor (EGFR, HER1), es de largo que se sabe que overexpressed en una fracción significativa de NSCLC [8]. EGFR es un 170 tipo I kDa del factor de crecimiento del receptor de membrana con 1186 aminoácidos codificados por 28 exones que abarca cerca de 190 kb en el cromosoma 7p11.2. Estos receptores existen como monómeros activo pero, a unirse a ligandos como el factor de crecimiento epidérmico (EGF) y la transformación del factor de crecimiento alfa (TGF α), pasan por cambios conformacionales que faciliten la dimerización, ya sea con otra molécula de EGFR o HER2 con, o HER3 HER4 moléculas. La dimerización es seguido por interacciones autophosphorylation de residuos de tirosina clave en la activación de bucle catalítico tirosina quinasa dominios a través de la transferencia de los fosfatos de adenosina trifosfato (ATP). EGFR activado itinerarios incluyen la mitogen-activated proteína quinasa (MAPK) vía, que induce la proliferación celular, así como la AKT y la señal de transductor y activador de la transcripción (STAT) vías, que contribuyen a la supervivencia celular.

El papel del EGFR como un oncogén se ha dilucidado desde hace muchos años y el nivel de expresión de proteína EGFR se ha demostrado que ser elevados en varios tipos de cáncer en relación con los tejidos normales [9]. En el cáncer de pulmón, hay varios mecanismos clave para la activación del EGFR, como la sobreexpresión de ligandos [10], la amplificación de genes [11, 12] y la activación de mutaciones [13]. El descubrimiento de agentes con la capacidad para antagonizar EGFR funciones en las células del cáncer, como el anticuerpo monoclonal cetuximab (Erbitux, ImClone Systems Inc) y los específicos inhibidores de tirosina quinasa (TKIs) gefitinib (Iressa, AstraZeneca, Reino Unido) y erlotinib (Tarceva, OSI Pharmaceuticals Inc) han aumentado el interés clínico en este receptor del factor de crecimiento (14,15). Gefitinib y erlotinib se activo por vía oral-EGFR TKIs que bloquean las vías de transducción de señal implicadas en la proliferación y la supervivencia de las células cancerosas y otros de acogida dependientes de la promoción de procesos de crecimiento celular del cáncer. Estos fármacos tienen mecanismos intracelulares de acción y competir con la ATP por la unión de EGFR, por tanto directamente la inhibición de EGFR autophosphorylation. En estudios retrospectivos, los pacientes con CPNM avanzado tratados con erlotinib o gefitinib han mostrado mayores tasas de respuesta objetiva y mayor supervivencia que los no tratados los pacientes [16, 17]. Erlotinib se muestra en el NCIC-BR.21 ensayo de fase III para proporcionar importantes beneficios para la supervivencia de pacientes con NSCLC en comparación con el placebo [18] y fue aprobado para uso clínico en los EE.UU. (noviembre 2004) y Europa (junio de 2005). Gefitinib no logró alcanzar una mejora significativa en la supervivencia en las grandes aleatorizado ISEL (Iressa Evaluación de Supervivencia en el cáncer de pulmón) estudio [19]. Sin embargo, existe una clara tendencia hacia mejores resultados en el grupo tratado de los pacientes en comparación con el placebo, lo que sugiere que hay un subgrupo de pacientes que beneficiarse con el uso de gefitinib. Curiosamente, en ambos erlotinib y gefitinib CPNM ensayos con asignación al azar aproximadamente el 30% de los pacientes fallecieron dentro de 4 meses de tiempo de tratamiento, que indican claramente que hay un subconjunto de pacientes con cáncer de pulmón que no reciben ningún beneficio clínico de EGFR-TKI terapia.

La disponibilidad de la terapia molecular dirigida con importantes agentes anti-tumor actividad en CPNM avanzado tanto como agente único y en combinación con la quimioterapia y la necesidad de aumentar la eficacia de estos tratamientos son factores instando a la elaboración y validación de las pruebas de laboratorio para la evaluación de la EGFR en pacientes con cáncer de pulmón. Los esfuerzos de investigación se han centrado en un gran número de clínicas y los factores biológicos que puedan predecir los pacientes con CPNM que podrían beneficiarse de tratamientos moleculares específicas y, en definitiva, encaminadas al desarrollo de su sensibilidad y especificidad pruebas de laboratorio para detectar pacientes. Al principio, los niveles de expresión de EGFR se ensayó sin éxito predictivo de respuesta a gefitinib [2022], aunque estudios más recientes en las grandes cohortes de fase II han detectado una asociación positiva entre altos niveles de proteína EGFR y la sensibilidad a ambos erlotinib y gefitinib [23 , 24]. La activación de mutaciones missense y supresiones en el dominio tirosina quinasa del gen EGFR fueron los primeros cambios moleculares asociados con claridad objetivo respuesta a gefitinib y erlotinib [25 - 27]. El impacto de estas mutaciones EGFR en la supervivencia global, sin embargo, ha variado de una fuerte correlación positiva en algunas poblaciones [28 - 30] en una medida mucho menos marcada correlación en otros [23, 24]. Curiosamente, las mutaciones EGFR también confiere superior resultado de la quimioterapia en el homenaje de juicio [31] e incluso pueden ser marcadores de pronóstico de acuerdo a los últimos hallazgos que, no tratados, los pacientes con mutaciones tienen mayor supervivencia [24, 32].

Genómica para obtener secuencias de EGFR detectados por fluorescencia de hibridación in situ (FISH) también se ha demostrado como un excelente predictor de respuesta [23, 24, 33] y mayor supervivencia [23, 33] en grandes cohortes de pacientes tratados con gefitinib y erlotinib. Más recientemente, los análisis moleculares realizados en los pacientes incluidos en el estudio ISEL también han demostrado que la mayor supervivencia se correlaciona con altos niveles de EGFR genómica ganar detectados por FISH [34]. Curiosamente, si el EGFR genómica abundancia en los tumores es evaluado por otras técnicas, tales como el sur de Blotting o cuantitativa en tiempo real PCR, la asociación entre el aumento de número de copias de genes y la sensibilidad a TKI no es significativa o marginalmente significativo (30,35,36 ). La diferencia probablemente refleja las características técnicas de cada una de las metodologías. FISH es un método in situ que permite la identificación de células individuales en el contexto de la arquitectura del tejido.

Southern blot y PCR basado en técnicas de extracción son de alcance mundial basado en los métodos que se ven influidas por la dilutional efectos de estroma y la infiltración de células reactivas.

Las mutaciones en el dominio tirosina quinasa del gen HER2 que fueron similares a las descritas para el gen EGFR se detectaron en frecuencias muy bajas en CPNM y probablemente no son clínicamente relevantes [37, 38]. Por el contrario, alto nivel de genómica para ganar el gen HER2 detectados por FISH resultó ser un predictor significativo de resultados a gefitinib y un potenciador de la sensibilidad al gefitinib en EGFR FISH positivo pacientes NSCLC [38].

FISH ensayo: principio y desafíos técnicos

La base técnica de hibridación in situ realizadas por intacto material citológico fue descrito por Gall y Pardue [39] empleando sondas radiomarcada. El desarrollo de etiquetado fluorescente de sondas de ácido nucleico [40] no sólo derogó la necesidad de que los reactivos radiactivos, sino también ampliar la aplicabilidad de la técnica que permite el análisis simultáneo de numerosas regiones cromosómicas claramente etiquetados utilizando sondas. Desde entonces, FISH ha sido cada vez más aceptada como una poderosa herramienta de investigación para investigar los cambios cromosómicos en dividir o no dividir celdas. Más recientemente con la continua liberación comercial de las sondas de ADN FISH también se ha convertido en una técnica importante en el diagnóstico de la patología.

El componente clave de la tecnología FISH es la complementariedad de propiedad de la molécula de ADN. Después de desnaturalización y en condiciones adecuadas de temperatura y pH, el doble hundidos molécula de ADN es exactamente regenerada. Si un juego de un solo hundidos fragmentos de ADN marcado el desempeño de nucleótidos se presenta como una sonda en o poco después de desnaturalización, estos fragmentos pueden ser incorporados a la nueva molécula de doble hundidos en lugares específicos determinados por su secuencia de nucleótidos. Después, la etiqueta fluorescente en la sonda permite la visualización del número de copias y la ubicación de la meta en las secuencias de interfase núcleos, los cromosomas se propaga o fibras de ADN.

En oncología, la mayoría de los especímenes biológicos están disponibles como fijado en formol e parafina embebidos (FFPE) tumor bloques. Dos principales estrategias técnicas han sido empleadas para el análisis FISH de estos especímenes FFPE: requiere un aislamiento de los núcleos intactos de secciones de grosor del tumor y la hibridación bloques ensayos se realizan en las suspensiones de células, y el otro utiliza los cortes finos de toda la parafina embebido en bloques para ensayos y análisis. En nuestro laboratorio, estamos a favor del análisis de secciones delgadas de toda la parafina de los bloques incrustados ya que esta estrategia tiene la ventaja fundamental de mantener intacta la arquitectura general del tejido. En consecuencia, es posible realizar una comparación directa de los peces con los resultados de detalles morfológicos en las secciones teñidas por hematoxilina y eosina (H & E) o manchas de inmunohistoquímica. Por otra parte, en estas secciones es posible distinguir con confianza alta núcleos de tumor del estroma y núcleos de reacción y de utilizar la no-células tumorales como los controles internos para la hibridación, si es necesario.

Un cierto nivel de protocolo de adaptación es necesaria para obtener resultados óptimos en ensayos FISH FFPE realizado en cortes de tejido. Pasos específicamente importantes son la correcta manipulación y tratamiento de los tejidos después de la biopsia o la resección de la paciente, la extracción de tejidos las proteínas que pueden interferir con la hibridación y la adecuación de la hibridación y la configuración posterior a la hibridación de lavado condiciones. La degradación del ADN y enlaces cruzados entre las hebras de ADN debe ser cuidadosamente evitado en el resecado o biopsia de tejidos, y las graves disección de grandes bloques de 1-3 mm de espesor piezas para permitir un modelo uniforme, adecuada y la fijación de incubación a 10% neutral para formalina tamponada 8 a 24 horas se recomienda. Degradadas o enlaces cruzados de ADN impide sonda vinculante desnaturalizados que las proteínas de alta fluorescencia generar ruido, y por tanto de estas situaciones, los fluorescentes señales no son detectadas o imposibles de puntuación. Además, una adecuada fijación asegura la preservación de la morfología de los tejidos, también un parámetro crítico para los peces en el análisis de tumores sólidos.

Algunos laboratorios de patología se han mostrado renuentes a aceptar las pruebas de rutina FISH. Las principales desventajas de los presuntos mediante FISH en el diagnóstico clínico son la necesidad de costosos microscopios de fluorescencia equipado con alta calidad de inmersión múltiples objetivos y filtros de fluorescencia. Por otra parte, debido a que el fluorescente se desvanecen las señales luminosas en virtud de la iluminación y se desvanecen al ampliarse el almacenamiento, la hibridación resultados deben ser permanentemente grabadas con cámaras digitales. Teniendo en cuenta el personal de laboratorio, hay también un efecto negativo por el hecho de que el protocolo es laborioso, microscopio análisis requiere una formación especializada y hay una insuficiencia de mano de obra para absorber incremento de la prueba. Sin embargo, estos factores son, sin duda mejorando con el tiempo. Costo de microscopios de fluorescencia y los sistemas de imágenes están disminuyendo y la automatización de muchos de laboratorio y analíticos medidas está disponible en más de una fuente comercial. Además, laboratorios clínicos, tanto en privado y académico en la configuración de los últimos tiempos han visto un aumento en el número de solicitudes de pruebas de FISH en las enfermedades genéticas, neoplasias hematológicas y tumores sólidos. La expansión de la terapia de trastuzumab con metástasis precoz del cáncer de mama después de los recientes hallazgos que trastuzumab fue eficaz en el tratamiento adyuvante ajustes [5, 6] ya ha intensificado la demanda de HER2 FISH ensayos. Validación de la prueba FISH EGFR para seleccionar CPNM para pacientes con terapia EGFR TKIs también traerá un gran número de especímenes a los laboratorios de patología clínica. Por otra parte, EGFR TKIs se consideran las opciones de tratamiento en otros tumores como colon, cabeza y cuello y pancreático carcinomas [14, 15] y la prueba FISH podrían resultar útiles para la selección de estos pacientes. Por lo tanto, la creciente aplicación asociada con factores como la disminución de los costes de equipamiento y la liberación de las plataformas automatizadas para el ensayo y análisis se espera ampliar significativamente a la comunidad basada en la experiencia en tecnología FISH en un futuro próximo.

Directrices para el EGFR FISH ensayo y análisis de microscopio

El protocolo estándar de ensayo y el análisis de número de copias de la gen EGFR en FFPE secciones de pulmón en nuestro laboratorio con el SpectrumOrange LSI EGFR / SpectrumGreen CEP 7 sonda set (Vysis / Abbott Molecular, IL) se describe brevemente. Normalmente, recibimos una H & E-teñidas y dos secciones secuenciales en blanco cortado en 4 um y montadas en portaobjetos cargados positivamente. Regiones ricas en células tumorales se identifican en el H & E manchadas de diapositivas y la más pequeña área de interés necesario para cubrir una parte importante de tumor se define por la hibridación y marcados en la parte trasera de la diapositiva en blanco con diamantes con punta de escribano. El protocolo se personaliza en función del tamaño de la sección. La diapositiva en blanco de una biopsia de la noche a la mañana se incuba a 56 ° C, mientras que las grandes secciones son incubados durante 2 a 4 horas. Las secciones se aprobó inicialmente a través de tres de 10 min CitriSolv (Fisher científico) incubaciones para deparaffinization, seguido por 10 min de inmersión en el 100% de etanol. Posteriormente, biopsias son tratados con incubaciones secuencial en 2 × SSC a 75 ° C durante 6 minutos, a 0,25 mg / ml de proteinasa K / 2 × 37 quater a la cooperación Sur-Sur durante 10 min, y en 2 × SSC durante 5 min a temperatura ambiente. Los tiempos de incubación de 2 × la cooperación Sur-Sur y la proteinasa K son más largos para los especímenes más grandes resecado, de hasta un 20 min. Diapositivas luego se sumergen en alcohol clasificado serie (75 ° C, 85 ° C, 100 ° C), secado al aire, y la sonda se aplica en el área de interés. Basándose en el tamaño y la forma de esta zona, un cubreobjetos de vidrio se ha seleccionado para cada sección (12 mm o 15 mm de diámetro, 10 × 22 mm, 18 × 18 mm, 22 × 22 mm) y la cantidad de sonda a utilizar se calcula basándose en la superficie de los cubreobjetos para mantener la concentración final sonda especificada por el fabricante. La hibridación zona está cubierta con el seleccionado cubreobjetos y selladas con cemento de goma. Las muestras se calientan en un horno seco por 10-15 min a 80 ° C para la desnaturalización del objetivo y las AND sonda y posteriormente se incubaron durante la noche a 37 ° C en cámara humidificado. Una vez terminada la hibridación tiempo, el sello de goma de cemento es despojado desactivada, el cubreobjetos es suavemente eliminado, y las diapositivas inmediatamente se incubaron a 2 × SCC/0.3% NP-40 a 73 ° C durante 2 min. Por otra parte, 1,5 × M urea/0.1 la cooperación Sur-Sur a 45 ° C durante 30 minutos también se puede utilizar. Después de un rápido lavado de 2 × SSC a temperatura ambiente y la deshidratación de etanol clasificado en la serie, DAPI en la lucha contra el fade solución (0,3 ug DAPI en Vectashield medio de montaje, Vector Laboratories) se pipeta en la muestra y la zona está cubierta con una participación de 20 × Cubreobjetos de 40 mm. A raíz de este protocolo relativamente sencillo, hemos encontrado que los peces de ensayo tiene éxito en una gran mayoría de los especímenes FFPE (> 90% en las muestras procedentes de grandes estudios multicéntricos retrospectivos, ~ 100% fijado recientemente en muestras clínicas).

Usamos epifluorescente microscopios equipados con 100 W de mercurio y lámparas de arco provisto de baja potencia (10 ×) y de alta potencia (40 × 100 × y) de alta calidad objetivos, en combinación con la única (rojo, verde, azul), doble ( rojo / verde) y de triple banda pase (rojo / verde / azul) filtros de interferencia (Chroma Technology) para la detección simultánea de ambos EGFR y CEP7 objetivos en el contexto nuclear. Digital documentación está garantizado por dos campos microscópicos (o más heterogénea en especímenes) y un Z-apilamiento característica se utiliza para tener en cuenta los múltiples planos focales cuando la imagen. Cada muestra es evaluada por dos lectores independientes, cada uno de los cuales se analizan por lo menos 50 celdas seleccionadas de por lo menos 4 zonas tumor. Si los resultados son concordantes logrado, el resultado es asignado a la muestra. Si hay desacuerdo, un lector de 3 ª realiza el análisis y el resultado alcanzado por la mayoría de los lectores se ha asignado a la muestra.

Los tumores de pulmón puede ser muy heterogéneo con interspaced grupos de células tumorales mostrando más o menos graves anormalidades moleculares, una característica que hace hincapié en la necesidad de exploración completa del tumor varias zonas en cada sección. También es fundamental para llevar a cabo análisis de microscopio FISH señales en las secciones de los tumores sólidos, en paralelo con la investigación correspondiente de H & E secciones teñidas con el fin de alcanzar un nivel de interpretación histológica de la sección que no pueden ser proporcionados por la DAPI. A efectos prácticos, las principales medidas microscopio en el análisis y la interpretación se resumen en la Tabla 1.

FISH EGFR y los patrones de estratificación de pacientes con CPNM

El EGFR FISH resultados obtenidos en las células tumorales anotó se resumen en cuatro índices que representan a la (a) porcentaje de células que presenten al menos 4 copias de las señales de EGFR, (b) porcentaje de células que presenten al menos 15 ejemplares de las señales de EGFR, ( c) Relación media del gen EGFR señales / CEP 7 señales por célula, y (d) presencia de suelta o apretada de genes o grupos de genes atípicamente grandes señales. Directrices para la clasificación de especímenes como EGFR FISH positivo o negativo sobre la base de estos índices se enumeran en el cuadro 2. En resumen, los tumores con al menos el 40% de las células que muestra por lo menos 4 copias de las señales de EGFR o con amplificación del gen EGFR se clasifican como EGFR FISH positivo. Las muestras con menos del 40% de las células que muestra por lo menos 4 copias de las señales de EGFR y de amplificación de genes no están clasificados como EGFR FISH negativo.

Los valores umbral para la estratificación de los pacientes en el EGFR FISH positivo o negativo EGFR FISH categorías se determinaron en un estudio retrospectivo realizado en pacientes con CPNM avanzado tratados con gefitinib [23]. Estos pacientes fueron estratificados inicialmente en seis FISH grupos de acuerdo con un creciente número de copias del gen EGFR en sus células tumorales (disomy, bajo la trisomía en el par, la trisomía en el par de alta, baja polysomy, polysomy alto, y de amplificación de genes) y estos grupos fueron evaluados para clínicos resultado. La relación entre los resultados de FISH y el resultado clínico representado por la respuesta a gefitinib, tiempo para la progresión de la enfermedad después del tratamiento, y la supervivencia después del tratamiento a favor de la combinación de los cuatro grupos con FISH no genómico o de baja ganancia para EGFR (disomy a la baja polysomy) como FISH negativos y la combinación de los dos grupos con alta ganancia para genómica EGFR (alto polysomy y amplificación de genes) como FISH positivo. En ese estudio, entre los pacientes con tumores EGFR en el FISH disomy categoría no hubo respondedores, el 75% de los pacientes progresó, mediana del tiempo hasta la progresión fue de 2,5 meses, y la supervivencia global fue de 7 meses. Del mismo modo pobres resultados se observó entre los pacientes con tumores EGFR categorizada con trisomía FISH y bajo polysomy patrones. En contraste, los pacientes con tumores EGFR mostrando FISH positivo de ellos incluía el 86% de los respondedores y sólo el 33% de los pacientes con enfermedad progresiva. La mediana de supervivencia libre de enfermedad fue del 6,3 meses y la supervivencia global fue de 9 meses en este subgrupo de pacientes. Aunque en ese estudio retrospectivo la tasa de respuesta fue mayor y la mediana de supervivencia fue mayor en los pacientes tratados con gefitinib gen EGFR que alberga a más de amplificación de alta polysomy, las diferencias no fueron significativas y los resultados clínicos en estos dos subgrupos difieren significativamente de los pacientes FISH negativo.

Similar asociación positiva del gen EGFR número de copias con resultados de EGFR TKIs fue encontrada por nuestro laboratorio UCCC en tres cohortes tratadas con el EGFR TKI gefitinib [23, 32, 34] y en una cohorte CPNM avanzado tratados con erlotinib en el que el molecular marcadores fueron evaluados en el Hospital Princess Margaret en Toronto, Canadá (22). En cada uno de estos estudios, que incluían no seleccionado cohortes de pacientes, la prueba FISH EGFR identificado un subgrupo de 30-40% de pacientes con CPNM que se pueden beneficiar de TKIs. Futuro Están en marcha estudios para la validación de la prueba FISH EGFR como biomarcadores predictivos de inhibidores de EGFR. En un informe preliminar del juicio ONCOBELL actualmente se llevan a cabo en Italia [41], la tasa de respuesta a gefitinib fue de 68% en el EGFR-FISH positivo y el 9% en el EGFR negativos FISH CPNM pacientes (p <0,001). Confirmación del óptimo de corte en los valores de frecuencia de las células tumorales mostrando alto número de copias de genes para la identificación del EGFR pacientes FISH positivo basado en el mejor ajuste análisis de resultados clínicos para el objetivo de las terapias moleculares También está en marcha.

Cromogénico hibridación in situ (CISH) es otro de tejido a base de técnica con la ventaja de utilizar brightfield microscopía [42]. Sin embargo, ha CISH nivel más bajo de la resolución de FISH y se ha fijado para el color de un solo ensayo, por lo tanto, prevenir el uso simultáneo de una sonda para el control aneusomy. Aunque reconocemos el potencial de aplicabilidad de CISH en la determinación de HER2 amplificación de genes en pacientes con cáncer de mama que son candidatos para terapia de trastuzumab, el sistema de puntuación propuesto para EGFR FISH CPNM en la actualidad no pueden extrapolarse a la tecnología de CISH.

EGFR amplificación de genes en células no pequeñas del cáncer de pulmón

En el cáncer de mama, la amplificación del gen HER2 usualmente ocurre como un gran grupo de genes de señales en torno a un 17 CEP y la señal es clásicamente definida por una proporción de genes en el cromosoma 17 señales ≥ 2 [3, 4]. La clasificación de amplificación del gen EGFR en cáncer es más difícil. Un factor determinante de la complejidad es la alta frecuencia de las copias sobrantes del CEP 7 (Figura 1A, B] que diluye el gen ganar sólo cuando la proporción de genes y cromosomas se utiliza como un índice. Otro factor determinante es la variedad de mecanismos de amplificación del gen EGFR. En el análisis de un gran número de primaria o metastásico CPNM especímenes, reconocimos seis patrones de amplificación del gen EGFR, como se detalla en el cuadro 3 y se ilustra en las figuras 1 y 2. El patrón predominante (~ 60%) es la clásica, grandes y relativamente sueltos grupos de más de 20 copias del gen señales que se considera cuando el amplicón se presenta como una coloración homogénea región (HSR). En estos casos, la ratio de EGFR / CEP 7 es probable ≥ 2, a pesar de la ganancia habitual del CEP 7 señales (Figura 2A]. Una fracción de aproximadamente el 10% -15% de amplificación de los tumores muestra un segundo modelo representado por los grupos incluidos 4 a 10 copias del EGFR. La combinación de estos pequeños grupos con copias adicionales del CEP 7 en cada célula del tumor por lo general disminuye la proporción EGFR / CEP 7 a menos de 2. En el tercer patrón, que se encuentra en el 15-20% de los casos amplificados EGFR, el EGFR amplicón CEP 7 incluye una sucesión de secuencias, lo que resulta en co-localizados grupos de EGFR y el CEP 7 señales (Figura 2B]. Un cuarto modelo está representado por un pequeño conjunto de aproximadamente el 5% de los casos amplificados que atípicamente gran pantalla brillante de genes y señales que representan más probable es que la amplificación de un segmento de ADN que abarca el EGFR sonda (Figura 2C]. En el quinto y más raras patrón (~ 1%) la amplificación de secuencias de EGFR son sufragados inestable, extracromosómicos doble minutos (Figura 1C]. El sexto incluye como patrón de amplificación de genes en particular, es un alto número de copias EGFR (≥ 15 señales de EGFR en ≥ 10% de las células) como consecuencia de aneusomy cromosómicas (Figura 2D], lo que representa aproximadamente el 5% de los tumores amplificado. Con excepción de la cuarta y quinta FISH patrones descritos anteriormente, todos los demás han sido igualmente observada en metafase y la interfase las células de NSCLC líneas celulares investigadas en nuestro laboratorio [43].

La heterogeneidad intratumoral común en CPNM añade a la complejidad descrita. Gen EGFR de amplificación pueden ser distribuidos en forma homogénea las áreas tumor en una sección de tejido o puede limitarse a ciertas células. En este caso, pueden estar presentes en determinados focos de células tumorales o difusa interspaced entre los no-amplificado tumor núcleos. Estos hallazgos han apoyado la definición de amplificación de EGFR en tumores pulmonares en nuestros estudios se basan en un mínimo porcentaje de células (≥ 10%) en lugar de utilizar el gen en el cromosoma ratio> 2 clásicamente aceptada y aprobada por los EE.UU. Food and Drug Administration ( FDA) para el gen HER2 en cáncer de mama. En el heterogéneo especímenes, la proporción EGFR al CEP 7 puede ser significativamente afectada por la selección de células que se anotó, por lo tanto, propuso mantener el marcador en varias zonas tumorales como un intento de obtener un resultado más representativo.

Conclusión

El EGFR FISH ensayo de acuerdo con la puntuación descrito criterios desarrollados en nuestro laboratorio en la Universidad de Colorado Cancer Center permite la evaluación del gen EGFR pautas que pueden ayudar en la estratificación de pacientes con CPNM avanzado para el tratamiento con el EGFR TKIs gefitinib y erlotinib. El ensayo es fácilmente aplicable a las secciones delgadas de la norma FFPE tumor bloques y los resultados se puede determinar en núcleos seleccionados dentro del contexto correcto histológico. Sin embargo, reconocemos que la información adicional de los posibles ensayos clínicos aún se requiere antes de recomendaciones relacionadas con el manejo del paciente se puede hacer. Estudios que combina EGFR FISH con otros marcadores moleculares como EGFR IHC y análisis de mutaciones en curso son también, y es posible que un grupo de pruebas en última instancia resultan ser mejor que una sola prueba para la selección de los pacientes con CPNM para TKI.

La utilidad de la prueba FISH en FFPE secciones se espera ampliar en el futuro como adicionales cromosómicas y anomalías del genoma se identifican como pronóstico y predictivo de marcadores moleculares en cánceres humanos. Muchos tumores sólidos se han considerado para terapias moleculares dirigidas y selección de pacientes para los tratamientos muy probablemente dependerá de la perfil molecular del tumor. Es fundamental para definir las directrices para ensayos de laboratorio e interpretación de los resultados para cada caso concreto, y poner en marcha con éxito el control de calidad y programas de garantía de calidad para calificar los laboratorios clínicos para ofrecer estos exámenes.

Conflicto de intereses

En los últimos 5 años, Marileila Varella-García recibió honorarios de Abbott Molecular de <$ 2000. Marileila Varella-García es uno de los inventores / solicitantes de la solicitud de patente PCT/US2005/018879; Título: Métodos para la Predicción de resultados clínicos epidérmico al receptor del factor de crecimiento Inhibidor de pacientes con cáncer (Universidad de Colorado).

Agradecimientos

Apoyado por NCI subvenciones CCSG 2P30-CA46934, esporas P01-CA58187, EDRN U01CA85070. El autor está en deuda con Lin Chen, Sujatha Gajapathy, Margaret Skokan, y Ana C. Xavier por su excelente apoyo técnico.