Journal of Biology, 2006; 5(2): 5-5 (más artículos en esta revista)

Represión de la inmunidad adaptativa a heteróloga antígenos durante la infección por Plasmodium hemozoin inducida por el fracaso de la función de células dendríticas

BioMed Central
Owain R Millington (owain.millington @ strath.ac.uk) [1], Caterina Di Lorenzo (cdl3s@clinmed.gla.ac.uk) [1], R Stephen Phillips (S. Phillips @ bio.gla.ac. uk) [2], Paul Garside (paul.garside @ strath.ac.uk) [1], James M Brewer (james.brewer @ strath.ac.uk) [1]
[1] División de Inmunología, infección e inflamación de la Universidad de Glasgow, Glasgow G11 6NT, UK
[2] División de Infección e Inmunidad, Joseph Black Building, University of Glasgow, Glasgow G12 8QQ, Reino Unido
[3] Dirección actual: Centro de Biofotónica de la Universidad de Strathclyde, Glasgow G4 0NR, Reino Unido

Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License (http://creativecommons.org/licenses/by/2.0], que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que la obra original es debidamente citados.

Resumen
Fondo

Las células dendríticas (CDs) son fundamentales para el inicio y la regulación de la respuesta inmune de adaptación durante el proceso de infección. Modulación de DC función pueden, por tanto, permitir la evasión del sistema inmune de los patógenos. Significativos de la depresión del anfitrión respuesta inmune sistémica a la vez concurrente infecciones y vacunas heterólogas se ha observado durante la infección por malaria, pero los mecanismos que subyacen a esta inmune hyporesponsiveness son controvertidos.

Resultados

En este sentido, demuestran que la sangre etapas de la infección por malaria provoca una falta de función DC in vitro e in vivo, provocando la activación subóptima de las células T que participan en la respuesta inmune heteróloga. Este efecto sobre las células T de activación pueden ser transferidos a los beneficiarios no infectada por países en desarrollo aislado de ratones infectados. Es significativo que las células T activadas por estos países en desarrollo carecen de efector posteriormente función, como lo demuestra una falta de migrar a los órganos linfoides folículos, lo que resulta en una ausencia de células B heteróloga respuestas a los antígenos. Los estudios de fraccionamiento hemozoin muestran que, en lugar de infectados en eritrocitos (glóbulos rojos) membranas, reproduce el efecto de infectados intactos los glóbulos rojos en países en desarrollo. Por otra parte, hemozoin que contienen países en desarrollo se podrían identificar a las células T áreas del bazo en vivo.

Conclusión

La infección por Plasmodium inhibe la inducción de inmunidad adaptativa a heteróloga antígenos de la modulación de la función DC, proporcionando una posible explicación para los estudios epidemiológicos vinculación con la malaria endémica infecciones secundarias y la reducción de la eficacia de la vacuna.

Fondo

La malaria es la principal enfermedad parasitaria de los seres humanos en toda las zonas tropicales y subtropicales, que afecta principalmente a niños menores de 5 años de edad y causando 500 millones de casos clínicos y hasta 2,7 millones de muertes cada año [1]. Además de la infección inducida por la mortalidad, la malaria también está asociada con problemas de salud pública derivados de alteraciones de la respuesta inmune. A pesar de que esta inmunosupresión puede haber evolucionado como un mecanismo mediante el cual el parásito puede prevenir inmune mediada por liquidación [2 - 8], deja la malaria-las personas infectadas o animales de experimentación más susceptibles a infecciones secundarias, como la no-tifoidea Salmonella [9], herpes zoster virus [10], virus de la hepatitis B [11], el virus de la leucemia Moloney [12] y la infección por nematodos [13], así como virus de Epstein-Barr reactivación [14 - 17]. Debido a que la eficacia de las vacunas heterólogas también puede ser suprimida por la malaria pacientes infectados [18 - 21], los niños que presenten signos clínicos de la malaria son rara vez hasta después de inmunizados contra la malaria quimioprofilaxis, que puede mejorar la respuesta a la vacunación [22]. En un reciente estudio de una nueva vacuna conjugada contra pneumococci, la eficacia se redujo durante la temporada de transmisión de la malaria [23], lo que demuestra el posible impacto de la infección por malaria a gran escala de los regímenes de la vacuna. Ciertas vacunas, sin embargo, parecen inducir las respuestas de protección con independencia de la malaria y el efecto inmunosupresor de la infección por malaria podría, por tanto, no se extiende a todos los antígenos [20]; estudios in vivo son necesarios para investigar aún más esta controversia. Varios estudios en animales han descrito la supresión de la función inmunológica de los parásitos Plasmodium in vitro e in vivo [24 - 34], pero los mecanismos implicados siguen sin estar claros.

Células dendríticas (DCS) tienen un papel crucial en la activación de células T y, por consiguiente, en la inducción de respuesta inmune adaptativa y la inmunidad [35, 36]. Hay pruebas de que muchos agentes patógenos han desarrollado mecanismos que subvierten la función DC, con lo que la modulación de la acogida de la respuesta inmune en su beneficio [37, 38]. Estudios recientes han revelado que los países en desarrollo son importantes en la infección por malaria, sobre todo durante los primeros eventos de inducción de la respuesta inmunitaria protectora a la infección [39, 40]. Se ha informado de que los glóbulos rojos (eritrocitos) infectados con el schizont etapas Plasmodium falciparum activar plasmacytoid países en desarrollo como detectado por el aumento de expresión del antígeno CD86 y las citoquinas interferón α (IFN-α) in vitro [41]. En contraste, las etapas asexual eritrocítica de P. falciparum, se mostró a menoscabar la capacidad de los países en desarrollo humano para someterse a la maduración in vitro [42]. De hecho, la sangre periférica países en desarrollo de P. falciparum los niños infectados demostraron una reducción de los niveles de complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) de moléculas HLA-DR en comparación con los controles no infectados [43], lo que sugiere una reducción del estado de activación. Por lo tanto, la capacidad de los parásitos de la malaria para inhibir la maduración de los países en desarrollo podrían estar involucrados no sólo en parásito específico de la inmunosupresión, sino también en la supresión de las respuestas a antígenos heterólogos como las vacunas y los agentes patógenos no relacionados [2, 19, 20]. Como humanos parásitos de la malaria son específicos de acogida, sin embargo, las observaciones sobre el efecto de la malaria en países en desarrollo son en gran medida limitados a los estudios in vitro.

En este sentido, describen el mecanismo subyacente a esta supresión de la inmunidad in vitro e in vivo. DC es la activación dinámica alterada por eritrocitos parasitados (pRBCs), en parte debido a la deposición de la malaria pigmento hemozoin (HZ) dentro de estas células. Tras la presentación de antígeno por heteróloga pRBC expuestos países en desarrollo, hay menos expansión de CD4 + 'ayudante' células T que son esenciales para la inducción de inmunidad adaptativa. Posteriormente, la migración de células T de folículos linfoides sea anulada, dando lugar a defectos de células B expansión y la diferenciación y un fracaso de la respuesta de anticuerpos. Estos estudios explican por qué la inmunidad a la malaria es lento para desarrollar y por qué la protección contra infecciones secundarias se reduce a Plasmodium las personas infectadas.

Resultados
Heteróloga represión de la respuesta inmune durante la infección por malaria

En primer lugar, examinó la respuesta a un antígeno heteróloga durante Plasmodium chabaudi (AS cepa) la infección (Figura 1a] para determinar si este modelo murino refleja la inmunosupresión clínica observada con p. la infección por P. falciparum [18 - 21]. Los ratones fueron inmunizados con el antígeno modelo ovoalbúmina (OVA) y lipopolisacárido (LPS) para actuar como coadyuvante en distintos momentos después de la infección, y OVA específicos de suero de inmunoglobulina G (IgG) fue medido 21 días después.

Modulación de países en desarrollo in vitro de eritrocitos infectados

DC activación es fundamental para la inducción de la inmunidad adaptativa [35], y estudios previos han sugerido que varios protozoos patógenos han desarrollado mecanismos para suprimir esta respuesta y, en consecuencia, a reducir inmune mediada por la protección [44]. PD Humanos cultivadas con p. falciparum-eritrocitos infectados son hyporesponsive a la estimulación con LPS y menos capaz de estimular CD4 + T-cell respuestas [42]. Esta observación sigue siendo controversial, sin embargo, como los estudios que utilizan modelos murinos han sugerido que los países en desarrollo pueden ser activados durante el aumento de la parasitemia en vivo [45] y siguientes cultura in vitro con el parásito schizont eritrocitos infectados [40].

Como por encima de los resultados indicó que la respuesta inmune in vivo es regulado dinámicamente durante el proceso de infección, se estudió la capacidad de P. chabaudi eritrocitos infectados por países en desarrollo para modular directamente, mediante el examen de la expresión de MHC clase II y co-estimuladoras moléculas en países en desarrollo. De médula ósea procedentes de países en desarrollo fueron incubadas con los eritrocitos infectados y la expresión de marcadores de superficie examinado en diversas ocasiones a lo largo de las siguientes 24 horas. Nuestros resultados muestran que los países en desarrollo expresaron un nivel muy bajo de la superficie de MHC clase II y la co-estimuladoras moléculas CD40, CD80 y CD86 cuando cultivadas en el medio de cultivo por sí solo, lo que confirma el estado inmaduro de estos países en desarrollo en la cultura (Figura 2a-d]. La estimulación con LPS promovió un aumento significativo en el nivel de expresión de todos los co-estimuladoras moléculas dentro de 6 horas. PD incubadas con pRBCs eritrocitos o no, sin embargo, aumentar la expresión de MHC clase II, CD40, CD80 y CD86, lo que indica que parásitos de la malaria no inducen la activación directa DC. Análisis de la producción de citoquinas puso de manifiesto que países en desarrollo expuestos a RBC pRBCs o producir pequeñas, aunque detectables, las cantidades de ambas interleuquinas IL-12 e IL-10 que son mil veces más bajos que los observados después de la estimulación LPS (Figura 2e, f], lo que sugiere que la presencia de parásitos no da lugar a la activación DC. La viabilidad de tratados de control de países en desarrollo y las células se cuantificó después de 24 horas de la cultura de la exclusión trypan azul (Figura 2g] y yoduro de propidio (PI) y annexin V tinción (datos no presentados) y no se vio afectada significativamente por pRBCs.

Una vez establecido que pRBCs en una proporción de 100:1 no directamente inducir la maduración DC, examinó si pRBC tratados con países en desarrollo mantienen su capacidad para madurar en respuesta a LPS tratamiento in vitro. Países en desarrollo están expuestos a eritrocitos o pRBCs durante 24 horas y, posteriormente, impugnó con LPS. Después de 18 horas de estimulación LPS, los niveles de expresión de MHC clase II, CD40, CD80 y CD86 aumentado de forma significativa (Figura 3a-d]. Países en desarrollo pre-incubadas con pRBCs impugnada y, posteriormente, con LPS, sin embargo, mostraron significativamente más bajos niveles de expresión de MHC clase II, CD40 y CD86 en comparación con los que se observan cuando las células no fueron tratados con pRBCs o se pre-incubaron con eritrocitos antes de la LPS desafío (Figura 3a-d]. Kinetic estudios demostraron que la capacidad de inducir a pRBCs este hyporesponsive estado en países en desarrollo exige por lo menos 6 horas antes de la incubación antes de la adición de LPS (datos no presentados). La producción de citoquinas tras el tratamiento con LPS puso de manifiesto que, aunque tratados con países en desarrollo pRBCs todavía podría producir niveles apreciables de IL-12 e IL-10 en respuesta a LPS, la cantidad producida es significativamente más bajo que el producido por países en desarrollo pre-incubadas con los eritrocitos (Figura 3e, f]. A medida que la interacción entre CD40 en países en desarrollo y su ligando CD40L en células T in vivo se sabe que será fundamental en la producción de compuestos bioactivos IL-12 y upregulation de adherencia y co-estimuladoras moléculas [46, 47], estimulado de médula ósea - derivados países en desarrollo con CD40L-transfectadas fibroblastos (Figura 3g, h]. PD tratados con eritrocitos significativamente upregulated expresión CD40 en respuesta a CD40L y produce altos niveles de la inducible IL-12p40 subunidad. CD40 ligadura, sin embargo, no rescatar a la reducción de la maduración de tratados con países en desarrollo pRBCs, aunque, como ya se observó con el tratamiento LPS, estas células siguen produciendo IL-12 p40, pero en menor medida que los grupos de control.

Modulación de países en desarrollo en vivo durante la infección por malaria

Como nuestros resultados sugieren que el paludismo es eritrocitos infectados podrían modular la capacidad de respuesta de los países en desarrollo in vitro, estamos investigando el siguiente estado de activación de esplénica países en desarrollo en vivo durante un tiempo-curso de la infección con P. chabaudi. Países en desarrollo aislado de bazo de ratones 4 días después de la infección mostraron un fenotipo moderadamente activa, como lo demuestra el aumento de expresión de CD40 y CD80 (Figura 4a], lo que confirma informes anteriores [45]. Países en desarrollo aislado de animales infectados 12 y 20 días después de la infección, sin embargo, mostró una reducción del nivel de activación, con niveles más bajos de CD40, CD80, CD86 y CMH clase II moléculas en su superficie en comparación con países en desarrollo de los animales no infectados (Figura 4b, c] . Considerando que países en desarrollo de ratones no infectados upregulated CD40, CD80 y CD86 tras la estimulación LPS (Figura 4d-g], aisladas de países en desarrollo el bazo de p. chabaudi-ratones infectados sigue siendo refractaria a LPS in vitro inducida por la maduración, con una reducción de los niveles de estas moléculas después de la estimulación. De este modo parece que, in vivo, países en desarrollo pronto se activan después de la infección, y el nivel de activación en países en desarrollo se ha reducido tras el pico de infección (días 12-20), y esto no puede ser derogada por la estimulación microbiana ex vivo.

La identificación de P. chabaudi componentes que inducen DC hyporesponsiveness

Como nos ha demostrado que la infección por malaria modula aspectos clave de la función DC, queríamos examinar los posibles mecanismos implicados. Inicialmente, para determinar si la maduración del parásito de la trophozoite etapa a la etapa schizont in vitro o algún proceso metabólico en el pRBCs se requiere para la inducción de la DC hyporesponsiveness, pRBCs se fijaron con paraformaldehído y se incubaron con países en desarrollo durante 24 horas antes de la adición de LPS (Figura 5a-c]. Los niveles de expresión de MHC clase II, CD40 y CD86 se redujeron significativamente cuando países en desarrollo fueron co-cultivadas con pRBCs fijo antes de LPS desafío, lo que confirma que trophozoite eritrocitos infectados downregulate DC activación en respuesta a LPS de tratamiento y sugieren que el crecimiento y la maduración del parásito en schizonts no es necesaria para la represión. En un intento por comprender los mecanismos implicados en el parásito mediada por la modulación de la función DC, que investigó el papel de determinados componentes del parásito en el LPS-inducida por la maduración de países en desarrollo. Abordamos esta cuestión inicialmente por analizar el efecto parásito que las proteínas expresadas en la superficie de la membrana eritrocitaria tienen en función DC. Países en desarrollo están expuestos a RBC membranas (fantasmas), aislados de infectados o no infectada eritrocitos. Después de 24 horas de cultura, países en desarrollo fueron retados con el LPS y la expresión de co-estimuladoras las moléculas analizarse 18 horas más tarde (Figura 5d, e]. Nuestros resultados muestran claramente que los fantasmas aislados de pRBCs no alteró la capacidad de los países en desarrollo a responder a tratamiento LPS in vitro, como se observa por los niveles de MHC clase II y CD40, lo que demuestra que las proteínas expresadas en la superficie de las membranas pRBCs al parecer no son esenciales para la modulación de la función DC.

Una vez establecido que las proteínas del parásito expresado en la membrana celular eritrocitaria no son responsables de la modulación de LPS inducido por países en desarrollo de la maduración in vitro, hemos centrado nuestra atención en HZ, un subproducto de la digestión de hemoglobina. Hemos observado que la médula ósea procedentes de países en desarrollo cultivadas in vitro con eritrocitos infectados por malaria acumulado pigmento intracelular (Figura 6a]. Análisis de citometría de flujo esplénico de países en desarrollo, identificados por CD11c expresión, también demostró un aumento en el tamaño y la granularidad de los países en desarrollo durante el proceso de infección (Figura 6b], y países en desarrollo aislado ex vivo, así como países en desarrollo en las secciones bazo mostró conspicua HZ deposición (Figura 6 bis] .

Con el fin de evaluar el papel de HZ en el parásito inducida por la modulación de la función DC, que inicialmente analizaron su capacidad para activar directamente en países en desarrollo vitro (Figura 6c-e]. Incluso en la dosis más alta (20 μ M), HZ no inducir la maduración DC, ya que los niveles de MHC clase II, CD40 y CD86 eran las mismas que las expresadas por los niveles de controles sin tratar. A continuación, examinó si HZ tratados con países en desarrollo todavía respondido a tratamiento LPS in vitro (Figura 6f-h]. Nuestros datos demuestran claramente una relación dosis-dependiente de la inhibición inducida por LPS maduración de países en desarrollo de HZ, como se ha visto por la reducción de los niveles de MHC clase II, CD40 y CD86. En conjunto, estos resultados indican que HZ, en lugar de pRBC membranas, es un factor clave que participan en la represión de la función DC murino in vitro e in vivo.

La falta de pRBC tratada con países en desarrollo para inducir a las células T efectoras función

El claramente por encima de experimentos implicados HZ mediada por la supresión de DC en función del fracaso de la producción de anticuerpos y por la demora en la adquisición de inmunidad protectora visto durante la infección por malaria in vivo. Para examinar las consecuencias funcionales de la malaria en función directa DC, se analizó la capacidad de los países en desarrollo afectados para activar ingenuo, OVA específicos de células T del receptor de células T transgénicos. Estas células de permitir el control de los antígenos específicos de células CD4 + T-respuesta celular antígeno como su especificidad es conocida y que pueden ser rastreados utilizando un clonotypic de anticuerpos dirigidos contra sus células T del receptor. Una de las primeras células de la superficie antígenos expresados por las células T después de la activación es CD69, que es detectable en una hora de la ligadura de las células T del receptor complejo [48]. Curiosamente, no hubo diferencias significativas en el porcentaje de OVA específicos de las células T que expresan CD69 entre RBC tratados y tratados con pRBC grupos (Figura 7], lo que demuestra que las células T que interactúan con modulación de países en desarrollo son igualmente activados.

Para investigar si el tratamiento de países en desarrollo con pRBCs podría alterar la dinámica de las células T respuesta proliferativa, la cosechada en las células T 48, 72, 96 y 120 horas de cultura (Figura 7b]. La capacidad de pRBC tratados con países en desarrollo para inducir a los T-la proliferación de las células se redujo drásticamente en comparación con el grupo control a lo largo del período de observación (ver Figura 7b]. El análisis de células T producción de IL-2, IL-5, IL-10 e IFN-γ (Figura 7c-f] reveló que cada uno de citocinas se downregulated en la pRBC-grupos tratados en comparación con RBC tratados con los controles. La reducción observada en T-la proliferación celular y la producción de citoquinas no puede ser explicado por T-muerte celular, como niveles similares de necróticas y apoptosis de células T se detectaron en ambas condiciones de FACS análisis de yoduro de propidio y annexin tinción (datos no presentados). Así pues, aunque países en desarrollo pre-tratados con pRBCs in vitro puede inducir la activación inicial de ingenuo CD4 + T las células, causando upregulation de CD69, estas células T no proliferan de manera eficaz y con una disminución de la capacidad de secretar citocinas efectoras.

Represión de T-B-y la proliferación celular durante la infección por malaria

Para caracterizar completamente los efectos aguas abajo de HZ inducida DC hyporesponsiveness heteróloga en la respuesta inmune, directamente investigado antígeno-específica de células T respuestas in vivo mediante la transferencia de trazabilidad OVA-CD4 + específicas de las células T en ratones receptores [49]. Esto nos permite seguir la respuesta de una pequeña, pero detectable, el número de antígenos específicos de células CD4 + T las células durante la inducción de una respuesta inmune adaptativa. Las células fueron transferidas a los beneficiarios tras la inicial pico de parasitemia (día 12 de la infección) y vacunados 1 día después. En p. chabaudi infectados ratones inmunizados, OVA-CD4 + específicas de las células T se sometió a una activación inicial similar a la del antígeno específico de células T en ratones no infectados, según las estimaciones de upregulation de CD69 (Figura 8] y el aumento de tamaño / blastogenesis (también un indicador de activación; datos no presentados), lo que confirma la observación in vitro (ver Figura 7a]. Antígeno específico de CD4 + células T en los ganglios linfáticos y bazo en no ampliar en la misma medida en ratones infectados no infectada como en los controles (Figura 8b], sin embargo, en parte debido a los antígenos específicos de células CD4 + células T hizo una reducción del número de divisiones (Figura 8c]. Curiosamente, no detectar el aumento de la apoptosis (determinada por annexin tinción) de los óvulos de células T específicas transferido la malaria en los individuos infectados (datos no presentados).

Uno de los más importantes componentes de CD4 + T-células efectoras función es la migración en primaria folículos linfoides de interactuar con, y para proporcionar ayuda, de antígenos específicos de células B [50]. Para realizar el seguimiento de los efectos de la infección por malaria en estas poblaciones, transferidos de células B-receptor de células B transgénicos específicos para huevo de gallina blanco lisozima (HEL) tomados de la MD4 de ratones transgénicos, junto con la OVA-DO11.10 específicos y células T inmunizados con OVA junto a HEL [51]. B-cell expansión en animales no infectados llegó a su máximo 5 días después de la inmunización (Figura 9a]. Ampliación de HEL-específica de células B fue casi completamente en ablated p. chabaudi de los animales infectados inmunizados con OVA-HEL/LPS (Figura 9a], sin embargo, lo que sugiere un defecto en B-activación de las células y / o células T ayudan a los ratones infectados.

La falta de heteróloga de antígenos específicos de células T de migración durante la infección por malaria

Expansión óptima del antígeno específico de células B afines requiere su interacción con CD4 + células T [52, 53]; Por tanto, nuestro estudio la localización de OVA-CD4 + específicas de las células T tras la vacunación. Cinco días después de la inmunización de ratones no infectados, la expansión clonal de antígenos específicos de células T se puso de manifiesto mediante técnicas de inmunohistoquímica, y estas células han comenzado a migrar hacia las células B-folículos (Figura 9b]. En p. chabaudi de ratones infectados, sin embargo, no sólo hay un número reducido de OVA de células T específicas, pero estas células fueron casi completamente excluidos de células B folículos (ver Figura 9b]. La migración fue cuantificado usando un láser de barrido citometría [54, 55]. Como se muestra en la Figura 9c, la proporción media de OVA específicas de CD4 + en las células T de células B folículos se redujo significativamente en P. chabaudi-ratones infectados tras la vacunación en comparación con los no infectados, los animales vacunados. Esto demuestra que en los animales infectados, CD4 + T las células no migran en folículos y, por tanto, dejar de interactuar con los antígenos específicos de células B, las dos medidas esenciales en la inducción de protección, inmunidad adaptativa. Es importante destacar que estos fracasos en T-y B-función de la célula son similares a las situaciones en que la tolerancia es inmune inducida [56 - 58], aunque pocos estudios han examinado directamente la interacción de T y células B in vivo durante el curso de infecciones. Cabe señalar que, en contraste con la fase inflamatoria temprana de la infección, la arquitectura linfoide normal era evidente cuando estos defectos en la migración se han observado, con distingue claramente, intacta y B-células T (véase Figura 9b].

Para investigar si el hecho de que las células T en la migración folículos es simplemente debido a una posible alteración en la arquitectura linfoide o quimioquinas gradientes causados por la infección por malaria, OVA-CD4 + específicas de las células T se activan inicialmente in vitro con el de médula ósea procedentes de países en desarrollo y pRBCs y luego fue trasladado en ratones receptores no infectada. La expansión de células T estimuladas in vitro con cultivos de países en desarrollo con eritrocitos infectados se redujo después de su traslado en comparación con la expansión de OVA específicos de las células T activadas en presencia de eritrocitos no infectados (Figura 9d], y estas células tampoco a emigrar en células B folículos (datos no presentados).

Para resolver si el defecto en las células T migración se debe a su activación en el contexto de la infección por parásitos o para la modulación de la función DC, altamente purificada países en desarrollo de los bazos de la malaria-los animales infectados o no infectada controles pulsos con OVA y trasladado en ingenuo BALB / c receptores a lo largo de ratones con células T DO11.10, marcadas con el tinte fluorescente 5,6-carboxi-fluoresceína succinimidyl-éster (CFSE). A raíz de la transferencia de óvulos-pulsado países en desarrollo de ratones no infectados, las células T dividido de manera eficiente, como se ha visto por CFSE dilución (Figura 9e]. En ratones transferidos con OVA-pulsado países en desarrollo purificado de los bazos de la malaria-ratones infectados, sin embargo, OVA-CD4 + específicas de las células T no para dividir a la misma medida (ver Figura 9e], lo que sugiere que países en desarrollo expuesta a la malaria, los parásitos son menos capaces de inducir eficaz de células T respuestas. Por otra parte, países en desarrollo purificado de cultivo in vitro con pRBCs y pulsado con el antígeno son menos capaces de inducir un óptimo de células T de respuesta cuando se la transfiera a los beneficiarios no infectada (datos no presentados). De este modo, el defecto en las células T función y la migración se debe principalmente a la modulación de la función DC por el parásito de la malaria, y no simplemente el resultado de la activación de células T en el contexto de la infección.

Discusión

Varios informes anteriores han sugerido una represión generalizada de la respuesta inmune durante la infección con Plasmodium [2 - 10, 12 - 21, 24 - 34, 59]. Un posible mecanismo podría ser el deterioro de la función de los países en desarrollo, un tipo de células que es esencial en la generación de la primaria de la respuesta inmune [42]. Pero la importancia de esta observación para los estudios in vivo, las consecuencias para la función inmunológica abajo, y lo que (si procede) parásito componente mediado este efecto sigue siendo poco clara. En este sentido, hemos demostrado que países en desarrollo son moduladas por el parásito de la malaria y son reprimidos por la infección con P. chabaudi a través de la malaria pigmento HZ. Es importante destacar que la infección por Plasmodium también causa un defecto importante en la inducción de respuestas inmunes en vivo: la expansión y la migración de células CD4 + células T es muy reducido, resultando en una consiguiente reducción de la interacción entre estas células T y células B y en la ayuda que puede proporcionar a las células B. A pesar de resultar gravemente dañados T-migración de células efectoras y función, la estimulación temprana de antígeno-específicos CD4 + células T no se ve afectada por la infección por malaria, como las células T estimuladas in vitro e in vivo upregulate CD69, lo que sugiere que, a pesar de la supresión de la función DC, antígeno es suficiente para inducir la presentación inicial de células T de activación.

A pesar de que el defecto observado en CD4 + T-función de la célula parece estar directamente relacionado con la inhibición de países en desarrollo, también se ha sugerido que óptima de células T de expansión y diferenciación requiere la interacción de T y células B [60]. Por lo tanto, puede ser que el hecho de que países en desarrollo para activar correctamente y, posteriormente, inducir a las células T en la migración de células B folículos también resultados en la reducción de la expansión de CD4 + células T observado aquí. Sin embargo, el fracaso de óptima CD4 + T-cell expansión y la migración durante el proceso de infección claramente en los resultados de la derogación de células B de expansión y una posterior falta de producción de anticuerpos específicos en vez de puntos durante el proceso de infección. Por lo tanto, de protección, inmunidad sistémica contra los no-parásito antígenos, y presumiblemente contra los antígenos del parásito, no se ha dado con eficacia.

Aunque las alteraciones en la arquitectura del bazo durante la infección con P. chabaudi se han descrito [61], estos cambios fueron menos evidentes en nuestro modelo, con intactas B220 + B de células folículos todavía claramente discernible de 17 días de la infección (ver Figura 9b]. Curiosamente, los ratones inmunizados infectados en el día 4 de la infección (cuando linfoide estructura ya está perturbado [61]] fueron capaces de generar respuestas de anticuerpos, lo que sugiere que, a pesar de la ruptura de la arquitectura, inmune cebado sigue normal en estos ratones.

Nuestro hallazgo importante que activan las células T no a emigrar en folículos puede en parte ser debido a alteraciones esplénica no visualizarse en nuestro tinción inmunohistoquímica para el B220, o para la alteración de los gradientes de quimioquinas importante para T-migración celular en ratones infectados. Para abordar estos problemas, nos transfieren las células T que han sido cebados in vitro en presencia de parásitos de la malaria en ratones receptores no infectada con la arquitectura linfoide normal. Además, estamos inmunizados ingenuo, los ratones no infectados con OVA-cargado países en desarrollo que han sido cultivadas in vitro con eritrocitos infectados. En todas estas situaciones se podría separar el efecto de los parásitos a los países en desarrollo o de las células T se describe la alteración de la arquitectura linfoide (véase la figura 9]. En cada caso, las células T cebados en la presencia de parásitos de la malaria o células T priming de países en desarrollo expuestos a la infección no se diferencian plenamente después de su traslado en los receptores no infectada. De este modo, la alteración de la arquitectura esplénica puede por sí sola no cuenta para nuestras observaciones, lo que sugiere que el fracaso en T-la diferenciación celular se debe a la modulación DC.

Otra posible explicación para el defecto observado en la inducción de la inmunidad podría ser a través de la competencia para el acceso a los antígenos entre adoptively transferido OVA específicos de las células T endógeno y la malaria antígeno específico de células T. Por lo tanto, una gran dosis de sangre, los antígenos del parásito podría impedir la inducción de otros ( 'espectador') la respuesta inmune. Sin embargo, estudios que examinaron las respuestas espectador en otras enfermedades parasitarias (por ejemplo, [62 - 65]], así como el potente estimulante capacidad de las micobacterias que contienen completa Freunds' adyuvante [66], sugieren que la inhibición de dicha inmunidad no se produce, a pesar de potencialmente grandes cantidades de antígenos que compiten. En nuestros experimentos, ingenuo OVA-CD4 + específicas de las células T activadas in vitro e in vivo en presencia de eritrocitos infectados upregulated CD69 en la misma medida que las células T estimuladas por los controles no infectados, lo que sugiere que un acceso suficiente a antígeno se disponía a iniciar T - cascadas de señalización celular (véanse las figuras 7 y 8]. Por otra parte, la transferencia de células T activadas en presencia de eritrocitos infectados, o la transferencia de purificado países en desarrollo de ratones infectados no infectada en los destinatarios, transfirió el inmunosupresor fenotipo, lo que sugiere que el efecto no puede atribuirse a la competencia fuera de la OVA-específica de células T la malaria-células específicas (véanse las figuras 8 y 9].

En busca de una explicación mecanicista de estas observaciones, que inicialmente se centró en analizar el efecto parásito que las proteínas expresadas en la membrana de los eritrocitos podría tener en función de DC. Se sabe que el desarrollo de los parásitos dentro de los eritrocitos es, junto con los cambios en las células huésped, incluida la acogida de células membranas plasmáticas [67], y está bien establecido que los parásitos expresar 'neo-proteínas' en la acogida de la superficie celular , Algunos de los cuales se informa de inducir inmunidad protectora [68 - 70]. Eritrocitos infectados con el roedor específico de la cepa P. chabaudi adherirse a determinados tipos de células interactuando con moléculas como CD36 [71], lo que se conoce como cytoadherence. Es importante destacar que la interacción de p. falciparum-eritrocitos infectados con CD36 se ha demostrado que la supresión de mediar en función DC [72]. El examen de la p. chabaudi genoma no ha revelado ningún homólogos de la p. falciparum proteína PfEMP1 [73], lo cual es importante en el secuestro [72]. Por el contrario, una familia multigene expresar antígenos de superficie fue identificada en P. chabaudi [73], lo que puede tener un papel en cytoadherence [74].

Otra importante diferencia entre p. chabaudi (el roedor específico de la cepa utilizada aquí) y los humanos específicos de la cepa P. falciparum es la presencia de complejos de superficie, conocida como perillas, en p. falciparum-eritrocitos infectados, que fortalecen las interacciones entre los receptores y pRBCs expresado en otras células [75]. P. chabaudi infectadas no tienen pRBCs evidente perillas [76]. Así pues, aunque p. falciparum y P. chabaudi muestran las diferencias en sus mecanismos de cytoadherence, pRBC mediada DC represión podría ocurrir a través de interacciones con las moléculas de membrana, como el CD36. Por lo tanto, países en desarrollo expuestos a los fantasmas de eritrocitos infectados o no infectada eritrocitos, antes de que el LPS desafío. Los fantasmas aislados de pRBCs no alteró la capacidad de los países en desarrollo a responder a tratamiento LPS in vitro, lo que sugiere que los antígenos expresados parásito en las membranas plasmáticas de eritrocitos no inducir a la represión anteriormente descritas tras el contacto con países en desarrollo in vitro. En apoyo de este hallazgo es la observación de que la inmunización de ratones con pRBC fantasmas pueden inducir protección de parásito desafío [77], lo que sugiere que la proteína estructura se mantiene en eritrocitos fantasmas y fantasmas que, a diferencia de los parásitos intacto, no son intrínsecamente inmunosupresores.

Como fijo pRBCs suprimida la LPS inducido por la maduración de países en desarrollo que pRBC membranas no, HZ parecía ser un buen candidato para investigar a la hora de buscar el mecanismo del parásito inducida por la modulación de la función DC. Informes anteriores han sugerido que HZ entorpece seriamente la diferenciación y la capacidad funcional de los monocitos y macrófagos murino mediante la producción de IL-10 y / o la inducción de un proliferador de peroxisoma activados por los receptores-γ (PPAR-γ) [78 - 82]. La extrapolación de estos resultados a países en desarrollo sigue siendo algo controversial, sin embargo, con otros trabajadores sugiriendo un papel proinflamatorio de HZ, posiblemente a través del Toll-like receptor-9 [83 - 86]. Nuestros resultados sugieren que el parásito intracelular de componentes, entre ellos HZ, en efecto, suprimir la DC y la función de maduración in vitro. El mecanismo exacto que participan en esta represión sigue siendo indefinido, aunque es interesante que la fagocitosis de HZ se ha encontrado para incrementar la degradación de la proteína kinasa C [87]. De este modo, la degradación de las principales moléculas de señalización intracelular puede ser un mecanismo por el cual los parásitos Plasmodium reprimir DC función. En conjunto, estos resultados sugieren que, en contraste con p. falciparum, intracelular HZ en lugar de p. chabaudi derivados de la membrana de proteínas expresadas se encarga de la supresión de la función APC.

Los resultados aquí presentados demuestran claramente que es función DC dinámicamente modulados in vitro e in vivo asexual de sangre-fase parásitos de la malaria. Estos resultados respaldan estudios previos con p. falciparum-eritrocitos infectados y los monocitos humanos derivados de países en desarrollo [42], así como estudios in vitro e in vivo de Plasmodium yoelii murino con países en desarrollo [88]. Otros estudios sugieren, sin embargo, que p. chabaudi schizonts activar países en desarrollo in vitro [40]. Del mismo modo, en estudios anteriores [45, 89], países en desarrollo aislado de P. yoelii de ratones infectados durante el pico de parasitemia se encontraron para ser activado de manera eficiente y para procesar y presentar el antígeno a las células T ingenuas. En el presente estudio, países en desarrollo expuestos a trophozoite eritrocitos infectados muestran problemas de maduración en respuesta a la estimulación, lo que indica que no se trata sólo de diferentes parásitos (P. yoelii versus P. chabaudi), sino también las diferentes etapas (trofozoítos versus schizonts) que tienen diferentes efectos en función de CC. Es interesante señalar que las diferencias observadas en la capacidad de pRBCs DC para estimular la maduración pueden surgir a través de la contaminación del parásito material con micoplasmas, que se sabe que contienen potentes Toll-like receptor (TLR) ligandos que activar de manera eficiente países en desarrollo [90 - 92]].

Recientemente se ha sugerido que, durante la infección por malaria en vivo, países en desarrollo se activan durante la infección temprana y, a continuación, mostrar tolerancia TLR más tarde a la infección, cada vez que no responde a la estimulación LPS [93]. Creemos que este no es el caso con p. chabaudi, sin embargo, porque no vemos ninguna evidencia directa de la maduración de los países en desarrollo por el parásito (ver Figura 2]. Además, a las movilizaciones de países en desarrollo muestran una mayor capacidad a T-estimular la proliferación celular y la producción de citoquinas [36], ninguno de los cuales fueron observados en las células T ensayos en el estudio actual. Por el contrario, sugieren que el transitorio incremento en la expresión de marcadores de activación en países en desarrollo ex vivo refleja las altas concentraciones de citocinas pro-inflamatorias principalmente causados por la fase temprana de la infección [94]. En apoyo de esto, un reciente informe que describe activado países en desarrollo a través de citoquinas inflamatorias sin patógenos estimulación upregulated marcadores de activación, pero no fueron capaces de conducir CD4 + T-diferenciación celular [95].

La capacidad de países en desarrollo para interactuar con CD40L en células T in vivo también se ha utilizado para explicar las diferencias entre in vivo e in vitro, estudios [45]. Es interesante señalar que en nuestro estudio no hemos podido rescatar DC maduración cuando pRBC tratados con países en desarrollo fueron estimulados con CD40L-transfectadas fibroblastos, también sugiere que la tolerancia TLR (el estado refractario de países en desarrollo a una segunda estimulación con un ligando TLR) no está involucrado en el fracaso de países en desarrollo para responder a la estimulación. Esto sugiere que los efectos que p. chabaudi eritrocitos infectados por ejercer en función de DC in vitro podría ser más profundo que las provocadas por las p. yoelii infección. Ya sea que estos cambios en la CD11c + población en su conjunto reflejan los cambios en los distintos subgrupos de países en desarrollo esperan una investigación más a fondo. Es importante destacar que hemos demostrado que la inmunosupresión visto se debe a la inhibición de esta función DC en lugar de represión de las células T o ruptura esplénica de la arquitectura, como la transferencia de células T activadas en el contexto de parásitos in vitro o de países en desarrollo de ratones infectados fue suficiente para evitar posteriores de células T en la diferenciación de los beneficiarios no infectada (véase la figura 9].

Los resultados presentados aquí demuestran, por primera vez, que la supresión de la inmunidad asociada con P. chabaudi afecta a varias poblaciones de células esenciales para el desarrollo de la inmunidad. DC función se altera durante la infección por parásitos, como consecuencia de la ingestión de HZ, y aunque CD4 + células T específicas para un no-antígeno del parásito se activan tras la vacunación, no para ampliar clonal de la forma más eficiente en los controles no infectados. Fundamentalmente, estas células T posteriormente mostrar un defecto en su capacidad de migrar a las células B-áreas y, en consecuencia, dejar de prestar una ayuda efectiva para los de células B de expansión y producción de anticuerpos. Estos resultados ponen de manifiesto un defecto de cebado heteróloga de la respuesta inmune durante la infección por Plasmodium y proporcionar una explicación para el aumento de infecciones secundarias y la reducción de la eficacia de las vacunas en las zonas donde el paludismo es endémico.

Materiales y métodos
Los animales y las infecciones desafío

Mujeres ratones BALB / c fueron adquiridos de Harlan Olac (Bicester, Reino Unido). DO11.10 ratones, con CD4 + células T específicas para la OVA 323-339 péptido en el contexto del MHC clase II IA d molécula reconocida por el anticuerpo KJ1.26 clonotypic [96] se obtuvieron originalmente de N. Lycke, Universidad de Gotemburgo, Suecia. MD4 ratones que contienen HEL específicos de células B [51] se backcrossed en los BALB / c de fondo. Todos los ratones fueron mantenidos en Biológica de Servicios, Universidad de Glasgow, en determinadas libre de agentes patógenos y condiciones utilizó por primera vez entre 6 y 8 semanas de edad de acuerdo con los entes locales y Reino Unido Home Office reglamentos.

Para iniciar una infección de la malaria, se inocularon ratones con 1 × 10 6 p. chabaudi AS-eritrocitos infectados intra-peritoneally. Parasitemia fue supervisado por delgadas manchadas de sangre frotis con tinción de Giemsa. Peak parasitemia ocurrieron en 5-6 días post-infección, tras lo cual disminuyó los niveles de parásitos y se mantuvo en baja, pero por lo general niveles detectables para el resto de los experimentos (ver Figura 1a], tal como está descrita anteriormente [97]. Ratones infectados se celebraron en un reverso luz / oscuridad ciclo a fin de que los parásitos recolectados a las 08:00 h se encontraban en la etapa tardía trophozoite. Para los estudios in vitro, la sangre fue recolectada cuando parasitemia fue 30-40%. Sangre infectada se recuperó en heparina (10 UI / ml) por punción cardiaca y diluida en buffer fosfato-salino (PBS; Invitrogen, Paisley, Reino Unido) a la necesaria concentración de pRBCs.

En varias ocasiones después de la infección por malaria, los ratones fueron vacunados por vía intravenosa con 500 μ g OVA (Sigma-Aldrich, Poole, Reino Unido), o un conjugado de óvulos y HEL (Biozyme, Gwent, Reino Unido) [50], junto con 50 ng LPS (a partir de Salmonella abortus-equi; Sigma-Aldrich).

Preparación de médula ósea países en desarrollo

Países en desarrollo se prepararon a partir de médula ósea, tal como está descrita anteriormente [98]. Suspensiones de células se obtuvieron a partir de fémur y la tibia de las mujeres ratones BALB / c. La médula ósea concentración celular se ajustó a 5 × 10 5 células / ml y cultivadas en seis platos así (Costar Corning, Nueva York, EE.UU.) en completo RPMI (cRPMI: RPMI 1640 suplementado con L-glutamina (2 mM), penicilina (100 U / ml), estreptomicina (100 μ g / ml) (todos de Invitrogen) y el 10% de suero de ternera fetal (FCS; Labtech Internacional, Ringmer, Reino Unido) que contiene 10% de la cultura X63 sobrenadante de células de mieloma de ratón transfectadas con granulocitos - macrófago el factor estimulante de colonias (GM-CSF) cDNA. frescas medio fue agregado a los cultivos celulares cada 3 días. El día 6, países en desarrollo fueron cultivadas y cosechadas en la concentración requerida para cada procedimiento experimental, como se describe a continuación. Esta técnica generada un gran número de países en desarrollo CD11c + en gran parte libre de granulocitos y monocitos contaminación, tal como está descrita anteriormente [98].

Cultivo in vitro de CDs infectados con fijo o no infectada eritrocitos

La sangre de p. chabaudi AS-ratones infectados se lavan dos veces en PBS antes de ser resuspendido en cRPMI para su adición a países en desarrollo. Para la fijación, sangre infectada se lavan tres veces en PBS y resuspendido en el 0,5% de paraformaldehído durante 30 min a 4 ° C. Fija los eritrocitos fueron lavados en PBS, resuspendido en el 0,06% Gly-Gly (Sigma-Aldrich) por 5 min a 4 ° C y lavado dos veces más en PBS antes de ser resuspendido en cRPMI para su adición a DC. Después de 24 h la cultura, países en desarrollo fueron estimulados con 1 μ g / ml de LPS y la expresión de células, las moléculas de superficie se analizaron 18 h más tarde por citometría de flujo. Para confirmar la fijación completa, nos mostró que el 2 × 10 7 fijo, los eritrocitos infectados no pudo establecer la infección cuando se inyecta intra-peritoneally en una hembra BALB / c ratón.

Cultivo in vitro de CD40L-transfectadas con fibroblastos países en desarrollo

Las líneas de células 3T3-CD40L y 3T3-SAMEN [46] fueron los regalos de tipo p. Hwu (NCI, Bethesda, EE.UU.). Las células fueron cultivadas en cRPMI en T75 frascos de cultivo de tejidos (Elena Biosciences, Gateshead, UK) y, cuando confluentes, cosechada y distribuida en seis platos así en el 2,5 × 10 5 células / ml de cRPMI. De médula ósea procedentes de países en desarrollo se cultivaron con personas infectadas o no infectadas eritrocitos en una proporción de 1:100. Después de 24 h, países en desarrollo han sido recolectados, resuspendido en 1 × 10 6 células / ml y cultivadas en una proporción de 1:1, ya sea con 3T3-CD40L o 3T3-SAMEN células por un nuevo 24 h. El nivel de expresión de CD40 en países en desarrollo fue analizado por citometría de flujo y la cultura sobrenadantes recogidos para IL-12 de citoquinas análisis.

T-estimulación de células in vitro

De médula ósea países en desarrollo fueron centrifugadas a 450 × g, resuspendido en 1 × 10 6 células / ml y 500 μ l alícuotas se distribuyeron en 24 y placas de cultivo de tejidos (Corning Costar) con pRBCs o eritrocitos. Después de 24 h de incubación a 37 ° C en el 5% de CO 2, antígeno países en desarrollo se cargan durante 6 h con 5 mg / ml OVA (Worthington bioquímicas, Freehold, EE.UU.). OVA específicos de las células T fueron aisladas de la mesentérica y ganglios linfáticos periféricos de DO11.10 ratones transgénicos [96] en el fondo SCID y cultivadas en una proporción de 1:1 con los países en desarrollo. T-proliferación celular se evaluó después de 48, 72, 96 y 120 h de la cultura y evaluada por la incorporación de [3 H] timidina (0,5 μ Ci / pocillo) para las últimas 24 h de la cultura. Las células fueron recolectadas utilizando una Betaplate 96-así recolector (Wallac Oy, Turku, Finlandia) y [3 H] timidina incorporación medidos en una Betaplate líquido scintillation counter (Wallac).

Citoquinas ensayo

Para la detección de IL-12 (p40 y p70) e IL-10, OptEIA ™ inmunoensayo enzimático (ELISA) Kits (Becton Dickinson, Oxford, Reino Unido) se han utilizado de acuerdo a las instrucciones del fabricante. Para células T citoquinas, Mouse Th1/Th2 6-Plex kit (Biosource, Nivelles, Bélgica) fue utilizado de acuerdo a las instrucciones del fabricante. Para el análisis de la producción de citoquinas ex vivo, una sola célula de suspensiones de células de bazo fueron preparados por el roce Nitex a través de la malla (Cadisch & Sons, Londres, Reino Unido) en medio RPMI 1640. Después del lavado, las células fueron resuspendido en 4 × 10 6 células / ml en cRPMI, ya sea sola o con 1 mg / ml OVA o 5 μ g / ml Concanavalina A (CONA; Sigma-Aldrich) y sobrenadantes incluidos en la muestra después de 48 h. Estos se almacenaron a -20 ° C hasta el análisis estándar de protocolo sandwich ELISA (anticuerpos utilizados: para IFN-γ captura, R4-6A2; para IFN-γ detección, XMG1.2; para IL-5 captura, TRKF5; para IL - 5 detección, TRKF4; Pharmingen, Oxford, Reino Unido) y los niveles de citoquinas en sobrenadantes calculada en comparación con las normas de citocinas recombinantes (R & D Systems, Abingdon, Reino Unido).

Citometría de flujo

Alícuotas de 1 × 10 6 células en 12 × 75 mm tubos de poliestireno (Falcon BD, Oxford, UK) se resuspendido en 100 μ l de tampón FACS (PBS, 2% FCS y 0,05% NaN 3) que contiene Fc Block (2.4G2 sobrenadante del hibridoma) así como la adecuada combinación de los siguientes anticuerpos: anti-CD4-PerCP (clon RM4-5), anti-CD11c-PE (clon HL3), anti-CD40-FITC (clon 3 / 23), anti-CD69-PE (clon H1.2F3), anti-CD80-FITC (clon 16-10A1), anti-CD86-FITC (clon directrices 1), anti-MHC-II (clon 2G9), anti-B220-PE (clon RA3-6B2) , PE-hámster control isotipo IgG, FITC-rata IgG2a, κ isotipo control y FITC-hámster IgG1, λ isotipo control (anti-TNP) (todos Pharmingen), biotina KJ1.26 de anticuerpos con biotina o HEL. Biotinylated se detectaron anticuerpos de incubación con fluorocromo y conjugado con streptavidina (Pharmingen). Después del lavado, las muestras fueron analizados utilizando un citómetro de flujo FACSCalibur equipado con un 488 nm con láser de argón y un rojo 635 nm láser de diodo y analizados mediante el software CellQuest (BD BioSciences, Oxford, Reino Unido).

Preparación de fantasmas de eritrocitos infectados y no infectados ratón sangre

Los fantasmas de infectados y no infectados eritrocitos se generaron tal como está descrita anteriormente [67]. En pocas palabras, la sangre se recogió en heparina por punción cardíaca y lavados tres veces en PBS. Infectadas y no infectadas eritrocitos se concentraron en PBS suplementado con 113 mM de glucosa (Sigma-Aldrich) y el 3% FCS. Eritrocitos infectados fueron incubadas en un volumen igual de buffer de glicerol (10% de glicerol (Sigma-Aldrich), complementado con un 5% FCS en PBS) durante 1 h a 4 ° C. Los parásitos y fantasmas fueron separados en un continuo Percoll (Amersham Biosciences, Little Chalfont, UK) gradiente (ρ: 1.02-1.10 g / cm 3) en medio intracelular de amortiguación (IM: 20 mM NaCl, KCl 120 mM, 1 mM MgCl 2, 10 mM de glucosa, 5 mM Hepes pH 6,7) por centrifugación a 5000 × g durante 30 min. Los fantasmas fueron lavados en buffer de mensajes instantáneos y capas en un plan en dos etapas gradiente de Percoll (ρ: 1,01 +1,02 g / cm 3) para separarlos de los fantasmas que aún podría contener parásitos. Los fantasmas de eritrocitos no infectados se obtuvieron mediante la adición de 40 veces el volumen de tampón fosfato (5 mM NaH 2 PO 4 / Na 2 HPO 4, 1 mM PMSF, 0,01% azida, pH 8.5). La suspensión fue centrifugada a 32000 × g durante 30 min. Los fantasmas de infectados y no infectados eritrocitos fueron lavados tres veces en PBS antes de ser resuspendido en cRPMI para su adición a países en desarrollo en una proporción de 100:1.

Hemozoin preparación

HZ fue aislada a partir de sobrenadantes obtenidos a partir de las culturas de p. falciparum gametocitos, amablemente proporcionada por Lisa Ranford-Cartwright, (División de Infección e Inmunidad, de la Universidad de Glasgow, Reino Unido). La endotoxina libre de buffers y las soluciones se utilizan en todo. Sobrenadantes fueron centrifugadas durante 20 min a 450 × g. El precipitado se lavó tres veces en un 2% y SLS resuspendido en guanidina 6 M HCl. Después de 5-7 lavados en PBS, el precipitado se resuspendió en PBS y sonicated durante 90 minutos usando Soniprep 150 (Sanyo Científico, Bensenville, EE.UU.) a una amplitud de 5-8 μ m de reducir al mínimo la agregación y mantener la suspensión de HZ. Total hemo contenido se determinó como se describe anteriormente [99] de depolymerizing hemo polímero en 1 ml de NaOH 20 mM y 2% SDS, incubando la suspensión a temperatura ambiente durante 2 h y luego leer la densidad óptica a 400 nm utilizando un UV-visible Helios espectrofotómetro (Thermo Spectronic, Cambridge, UK). Países en desarrollo fueron pulsados con 1-20 μ M HZ - una gama de concentración de similar a la observada en países en desarrollo se cultivaron en una proporción 1:100 con pRBCs.

Evaluación del antígeno-anticuerpo específico respuestas

Sangre periférica y se recogió el plasma fue separado por centrifugación a 450 × g durante 10 min y almacenado a -20 ° C hasta su análisis. OVA-IgG específica fue medida estándar de sandwich ELISA utilizando un conjugado con peroxidasa-anti-mouse IgG total (Sigma-Aldrich).

Adoptivos transferencia de antígeno específico de los linfocitos

Los ganglios linfáticos y bazo fueron homogeneizados y las consiguientes suspensiones de células se lavan dos veces por centrifugación a 400 × g durante 5 min y resuspendido en RPMI. Las proporciones de antígenos específicos de células T fueron evaluados por citometría de flujo, y syngeneic beneficiarios recibieron 3 × 10 6 antígenos específicos de células. En algunos experimentos, las células fueron marcadas con el tinte fluorescente CFSE (Molecular Probes, Oregon, EE.UU.), inmediatamente antes de su uso [100]. El nivel de la CFSE en las células se analizaron por citometría de flujo y se expresan como la media proporción del antígeno específico de células T en relación con cada uno CFSE pico.

Inmunohistoquímica

Bazo se congelaron en nitrógeno líquido en la integración de los PTU medio (Miles, Elkart, EE.UU.) en cryomoulds (Miles) y almacenados a -70 ° C. Muestras de tejido (8 μ m) se redujeron en un criostato (ThermoShandon, Cheshire, UK) y almacenados a -20 ° C. Las secciones fueron teñidas bloqueado y tal como está descrita anteriormente [55], utilizando B220-FITC para mancha de células B áreas y biotina-KJ1.26 para detectar OVA-DO11.10 células específicas, y visualizar utilizando Estreptovidina-Alexa Fluor 647 (Molecular Probes) . Todas las fotografías fueron tomadas a 20 × magnificación.

Para visualizar HZ deposición en países en desarrollo, las células fueron fotografiados utilizando un Axiovert S-100 microscopio Zeiss utilizando un 63 × petróleo-lente de inmersión normal brillante de campo de imagen. A imagen de HZ en esplénica DC, el 8 de μ m se cortaron secciones como se describe más arriba y manchado con biotina-CD11c seguido por Estreptovidina-HRP y, por último, tyramide-488 (PerkinElmer, Boston, EE.UU.). Las imágenes fueron tomadas luego de brillantes de campo y fluorescencia verde y las imágenes fusionadas invirtiendo y, a continuación, falsa coloración brillante de la imagen sobre el terreno de tal forma que depositó HZ apareció rojo y verde apareció CD11c.

- Escaneo láser citometría

Las secciones fueron teñidas, tal como se describe más arriba. Las secciones fueron escaneadas en un láser de barrido equipados con citómetro de argón, helio, neón, láser y ultravioleta (Compucyte, Cambridge, EE.UU.) y visualiza con el sistema de procesamiento de imágenes Openlab (Improvisación, Coventry, Reino Unido). La localización de los transgénicos y las células T de células B se trazan folículos. Usando estos mapas tejido el número de transgénicos en las células T se define puertas se calculó para tres puertas en vaina linfoide periarteriolar (PALS) y tres de células B folículo puertas por sección. Los datos se representará gráficamente como la proporción media de transgénico linfocitos T en cada puerta de embarque en relación con el número de células T transgénicos en toda la sección y son la media de tres lecturas de tres ratones por grupo.

El aislamiento de países en desarrollo de bazo

Fueron extirpados el bazo y un solo suspensiones de células obtenidas como se ha descrito anteriormente. En algunos experimentos, las células fueron estimuladas con 1 μ g / ml LPS durante 18 h antes de su análisis por citometría de flujo. Para obtener purificado países en desarrollo de bazo de ratones, una sola célula suspensiones fueron etiquetados utilizando un Kit de aislamiento CD11c (Miltenyi Biotec, Bisley, Reino Unido), con arreglo a las instrucciones del fabricante. Países en desarrollo fueron entonces purificados utilizando dos columnas MS magnetica (Miltenyi Biotec) que resultaron ser 85-95% puro de análisis de citometría de flujo.

El análisis estadístico

Los resultados se expresan como media ± desviación típica o desviación estándar, tal como se indica. Importancia fue determinada por ANOVA de un factor en relación con el test de Tukey utilizando Minitab. Un valor de p inferior a 0,05 fue considerado significativo.

Agradecimientos

Los autores no tienen conflictos de intereses financieros. Damos las gracias a Rush C. Grierson y A. de asistencia utilizando láser de microscopía de barrido. Damos las gracias a Lisa Ranford-Cartwright para que nos proporciona la cultura sobrenadantes de p. falciparum gametocitos y Christoph Janssen por su ayuda en la preparación HZ. Esta labor fue apoyada por la financiación de la Wellcome Trust otorgó a JMB, RSP y PG (Grant Número 066890/Z/02/Z).