Journal of Biology, 2006; 5(3): 7-7 (más artículos en esta revista)

Astrocitos gliales derivadas de los precursores restringidos promover la reparación de la médula espinal

BioMed Central
Jeannette E Davies (jdavies@bcm.edu) [1], Carol Huang (cxhuang@bcm.edu) [1], Christoph Proschel (Chris_Proschel@urmc.rochester.edu) [3], Mark Noble (Mark_Noble@urmc.rochester . edu) [3], Margot Mayer-Proschel (Margot_Mayer-Proschel@urmc.rochester.edu) [3], Stephen Davies JA (sdavies@bcm.edu) [1]
[1] Departamento de Neurocirugía, Baylor College of Medicine, 1709 Dryden Street, Suite 750, Houston, Texas 77030, EE.UU.
[2] Departamento de Neurociencias, 1 Baylor Plaza, Houston, Texas 77030, EE.UU.
[3] Departamento de Genética Biomédica de la Universidad de Rochester Medical Center, 601 Elmwood Avenue, Rochester, Nueva York 14642, EE.UU.

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Resumen
Fondo

Trasplante de embrionarios o de células progenitoras neuronales es una estrategia atractiva para la reparación de las heridas del sistema nervioso central. Trasplante de estas células por sí solas para aguda lesiones de la médula espinal no ha dado lugar a la regeneración axonal sólido más allá de los sitios de lesión. Esto puede deberse a progenitores a diferenciar tipos de células que apoyan el crecimiento axonal mal y / o la imposibilidad de modificar el medio ambiente inhibitorio de los adultos del sistema nervioso central (CNS) las lesiones. Estamos motivados por lo tanto, que antes de la diferenciación neural de embriones de los precursores de astrocitos, que se cree para apoyar el crecimiento axonal en el SNC inmaduro lesionado, sería más beneficioso para los sistemas CNS reparación.

Resultados

Trasplantes de astrocitos procedentes de embriones glial restringido-precursores (GRPs), promovida robusto crecimiento axonal y restauración de la función del aparato locomotor después de las lesiones agudas transection de la rata adulta la médula espinal. Trasplante de GRP derivados de astrocitos (GDAs) en lesiones de la columna dorsal promover el crecimiento de más del 60% de la columna dorsal ascendente axones en los centros de las lesiones, con el 66% de estos axones se extienden más allá de los sitios de lesión. Grid-análisis a pie de GDA trasplantados ratas con lesiones del tracto rubrospinal reveló mejoras significativas en función del aparato locomotor. GDA trasplante también inducida por una sorprendente redistribución de tejido lesionado, reprimidas inicial cicatrices y rescató a axotomized CNS neuronas con cortar la atrofia de los axones. En marcado contraste, indiferenciada GRPs no reprimir la formación de cicatriz o apoyar el crecimiento axonal y la recuperación del aparato locomotor.

Conclusión

Pre-diferenciación de los precursores gliales en GDAs antes del trasplante en lesiones de la médula espinal conduce a mejorado notablemente los resultados en trasplante de células precursoras, ofreciendo tanto una novela y una estrategia muy eficaz nuevo tipo de células para la reparación de lesiones CNS.

Fondo

Lesión traumática para los adultos, sistema nervioso central (SNC) está asociada con varios tipos diferentes de daños, todos los cuales plantean importantes retos a los intentos de llevar a cabo la reparación tisular. Promover el crecimiento regenerativa de la ruptura de motor y sensorial axones requiere la prestación de servicios apropiados de sustratos y / o el superior de una variedad de inhibidores que impiden la regeneración axonal. La expresión molecular de los inhibidores de crecimiento axonal ha sido ampliamente caracterizado por fibrosis, tejido de la cicatriz glial [1 - 4] y en la mielina CNS [5 - 7]. En particular, los astrocitos adultos en los lugares de la lesión se ha demostrado que expresar proteoglicanos que inhiben el crecimiento axonal [4, 8, 9] y tienen un importante papel en la formación de tejido cicatrizal desalinearse [10], que carece de la organización lineal de adultos CNS sustancia blanca cree que se necesitarían para un rápido, de larga distancia axón crecimiento [11 - 14].

Una amplia gama de enfoques se han aplicado tras CNS lesión regenerativa para promover el crecimiento de ambas sensorial y motor axones, con especial hincapié en el trasplante de una gran variedad de tipos de células, a menudo en combinación con otras terapias. Cell basada en el trasplante de estrategias para promover el crecimiento axonal a través de lesiones de la médula espinal [15] han incluido el uso de células madre neuronales, neonatal cerebro astrocitos, fibroblastos, de médula ósea y células derivados sistema nervioso periférico neuroglia, como las células Schwann y células ensheathing olfativo. Aunque los trasplantes de algunos tipos de células han proporcionado más beneficios que otras, la falta general de la regeneración axonal significativa más allá de los sitios de lesión ha llevado a la combinación de estrategias de trasplante celular con la entrega de neurotrófico factores, los tratamientos diseñados para anular o degradar la cicatriz, y / o con el uso de biomateriales para ofrecer los posibles sustratos de tejidos y estructuras organizadas [16, 17]. Estas combinaciones han dado lugar a diferentes grados de éxito de la regeneración axonal.

Hemos estado interesados en la posibilidad de que la reparación de lesiones de adultos CNS podría ser especialmente mejorado con la introducción de células inmaduras de la CNS, un tejido que tiene una mucho mayor capacidad regenerativa de los adultos CNS (revisado en [18]]. Un posible enfoque es a trasplante de células madre de embriones o de células progenitoras neurales. A pesar de que estas células han demostrado para promover la recuperación limitada de comportamiento a través de remyelination de acogida axones [19 - 22], su trasplante directamente en o adyacente al traumáticas lesiones de la médula espinal no se ha traducido en la regeneración de un número significativo de los axones endógeno a través del sitio de la lesión [21, 23 - 25]. Esto puede deberse a la incapacidad de la mayoría de estas células para diferenciar [26] o porque el medio ambiente inflamatorio de las lesiones de adultos CNS dirige indiferenciado de células madre neuronales o gliales progenitores a una "cicatriz astrocyte'-como fenotipo [27] que está mal de apoyo de crecimiento axonal [8, 28].

Una alternativa a permitir que la lesión medio ambiente para regular la diferenciación de tallo o células progenitoras para trasplante es un tipo de células inmaduras de la CNS que se sepa que es de apoyo de crecimiento axonal. En este sentido, astrocitos embrionarias han sido durante mucho tiempo de pensamiento como un atractivo tipo de células para la reparación de los adultos CNS [29]. El establecimiento de culturas astrocytic directamente de la CNS embrionarias, sin embargo, genera las poblaciones de células que contienen mezclado astrocytic fenotipos contaminados con gliales y microglia progenitores, y esas poblaciones han dado relativamente modesto éxito en la promoción de la regeneración axonal después del trasplante para adultos CNS lesiones [30, 31]. Aislar embrionarias astrocitos directamente de la CNS embrionarias es también muy difícil, debido a la relativamente baja abundancia de estas células in vivo. La generación de postnatal astrocytic culturas es normalmente asociada con el crecimiento prolongado en condiciones in vitro que permitan el envejecimiento de estas células a un fenotipo menos de apoyo [32], que también ha dado lugar a un mínimo crecimiento axonal después de su trasplante para adultos lesiones de la médula espinal [33] .

Para hacer frente a los problemas mencionados, hemos explorado el enfoque alternativo de pre-embriones diferenciar a los precursores gliales específicos astrocitos in vitro, una técnica que permite la rápida generación de suficientemente grande y homogéneo de la población de embriones astrocitos de un fenotipo deseado para el trasplante de adultos CNS lesiones. Al aplicar este enfoque, hemos generado poblaciones puras de astrocitos directamente de glial restringido-precursor (GRP) las células [34 - 36], las primeras derivadas de células progenitoras población restringida a la generación de neuroglia. Astrocitos fueron generados por exponer a las células GRP a la proteína morfogenética de hueso-4 (BMP-4), que induce astrocito generación de embriones células precursoras neuronales y células GRP tanto in vitro como in vivo [34, 37] y se cree que tienen una función importante en gliales regulan la diferenciación in vivo [38]. GRP derivados de astrocitos (GDAs) BMP generados por la exposición entran dentro de la población de células definida por su fenotipo antigénico como tipo-1 astrocitos. Estudios in vitro de tipo-1 astrocitos purificados postnatal de la CNS han demostrado que promover una amplia neurite el crecimiento de una variedad de neuronas [39, 40], expresan altos niveles de moléculas que apoyan el crecimiento axonal, como laminina y fibronectina [41] y factor de crecimiento nervioso (NGF) o neurotrophin-3 (NT-3) [42] y también muestran un mínimo inmunoreactividad para chondroitin sulfato proteoglicanos (CSPG) [41]. Por otra parte, los dirigidos generación de astrocitos de GRP células embrionarias pueden proporcionar células que muestran los beneficios de crecimiento axonal de la promoción de las propiedades que caracterizan a las primeras CNS.

Nuestro estudio muestra que el trasplante de GDAs agudo en lesiones de la médula espinal de los niveles promueve la reorganización del tejido, la regeneración axonal y la recuperación del aparato locomotor que previamente se han logrado sólo mediante la combinación de trasplante de células con múltiples enfoques terapéuticos. También se presenta, en idénticas lesiones, que las células trasplantadas GRP no se apoya el crecimiento de axón o recuperación funcional, lo que demuestra la importancia crítica de pre-diferenciar las células progenitoras para trasplante antes de la CNS adultos heridos.

Resultados
La regeneración endógena de la columna dorsal axones

Trasplante de GDAs puñalada en la herida de lesiones de la columna dorsal vías de sustancia blanca de rata adulta la médula espinal (Figura 1a-c] como resultado del crecimiento de la mayoría de la corte ascendente columna dorsal axones en el centro de la lesión (Figuras 2 y 3 bis] , Con el 66% de estos axones se extiende más allá de la lesión sitio en sustancia blanca adyacente (Figuras 2 y 3 bis, b, e, f]. Con el fin de minimizar el etiquetado de escatimado axones, una discreta población de axones ascendente alineados con la lesión sitio fue trazado en el paso con un solo biotina dextrano amina (BDA) de inyección de caudal a GDA trasplantados o de control de apuñalar a las lesiones de la mano derecha de la columna dorsal cuneate y gracile vías de sustancia blanca (Figura 1c; véase el Glosario cuadro para obtener una explicación de los términos). Estudios anteriores han demostrado que alrededor del 30-40% de la columna dorsal ascendente proyección de los axones a la columna dorsal surgen núcleos de la columna dorsal postsinápticos en las neuronas espinales laminar 4 y que el 25% de la columna dorsal ascendente axones son también propriospinal en origen [43, 44] . De hecho, se piensa que sólo el 15% de primaria de afferents ganglionares de la raíz dorsal (DRG), las neuronas entran en la médula espinal lumbar en los niveles de llegar a la médula espinal cervical y que la mayoría de dejar la columna dorsal blanca dentro de dos a tres segmentos de entrar [45] . Por lo tanto, nuestro paso en el etiquetado de los axones columna dorsal a nivel cervical incluyen una proporción significativa de los axones de las neuronas tanto DRG CNS y las neuronas espinales.

Ejemplo de cuenta de cada tres parasagittal sección a 8 días después de la lesión reveló números similares de BDA marcado axones caudal de 0,5 mm para el sitio de lesión en ambos el control y experimental médulas espinales, con un promedio de 107 ± 47 vs 101 ± 45 axones incluidos en la muestra por animal, respectivamente (véase también la Figura 2]. En GDA trasplantados cuerdas, en promedio, 61% (desviación estándar (DE) ± 11), de caudal etiquetados axones extendido en el centro de la lesión, 39% (± 15) de los axones caudal de 0,5 mm extendido más allá de la lesión en centro de sustancia blanca adyacente y el 28% (± 7) 1,5 mm más allá de la lesión sitio. Incluso en el relativamente corto de 8 días de tiempo, un pequeño número de axones ampliarse aún más, con un promedio de siete BDA + axones (± 5; 7%) detectada por el animal a 5 mm rostral al perjuicio sitio y cuatro axones (sd ± 3, 4%) en la columna dorsal GDA núcleos en animales trasplantados. Por el contrario, en cuatro de cada cinco animales de control, no se observaron los axones dentro de la lesión o dentro de los centros de sustancia blanca más allá de la lesión. En sólo uno de cada cinco animales de control, seis BDA + axones (4%) se encontraron en la ventral-la mayoría de las regiones de la lesión sitio (es decir, en el margen ventral), efectivamente rostral caudal a la lesión y, por tanto, margen alineados con Centro de la lesión. Estos fueron más probable que sea debido a un limitado axonal ahorradores y / o la brotación de este animal, lo que resulta en la presencia de estos axones en la sustancia blanca ventral de la cuneate camino a la interfaz con materia gris. El hecho de que no BDA + axones se observaron más allá de 1,5 mm rostral a la lesión en este animal (Figura 2], o se observaron lesiones de cruzar la cerca de la superficie o Pial en GFAP-negativos regiones de la lesión buen centro de control en todos los animales , Apoya la hipótesis de que estos seis axones habían brotado alrededor de la lesión en el gris / sustancia blanca interfaz en lugar de haber sido salvado. En general, aproximadamente el 99% de la corte termina de BDA + axones en el control de cables se mantuvo dentro de los márgenes de caudal lesión y ha distróficos terminaciones (Figura 3c]. En marcado contraste, muy pocos axones distróficos se observaron en el caudal de interfaz de GDA junto con los trasplantes de sustancia blanca en comparación con el control de lesiones sitios (comparar Figura 3c y 3d].

GDA 'puente' dispone de soporte para el crecimiento axonal

Para demostrar aún más la capacidad de trasplantados GDAs para apoyar el crecimiento axonal en un modelo de rata adulta de la médula espinal que elimina la posibilidad de axón ahorradores, hemos examinado la capacidad de crecimiento de los axones adyacentes trasplantes de adultos DRG neuronas sensoriales idéntica a cruzar la médula espinal puñalada las lesiones con el servicio de puente GDAs. En estos experimentos, inmediatamente después de la lesión ratas recibieron microtransplants de ratón adulto las neuronas sensoriales que expresan proteína verde fluorescente (GFP) en la columna dorsal blanca 400-500 μ m caudal a GDA trasplantados apuñalar lesiones (Figuras 1c y 4a] o de control de apuñalar inyectados con lesiones los medios de comunicación por sí sola. En estos experimentos también examinó la posibilidad de trasplante de células GRP a promover la regeneración (Figuras 1c y 4c].

Nuevos creciente axones de las neuronas trasplantadas no cruzar GRP trasplantados lesiones (Figuras 4c y 5c] o inyectado con lesiones medianas (datos no presentados). En contraste, 53% (± 3) de rostrally dirigido GFP + axones se convirtió en el centro de GDA trasplantados lesiones, el 62% de los axones en el centro de la lesión llegó a 0,5 mm más allá de sitios de lesión, el 42% llegó a 1,5 mm rostral en sustancia blanca , Y un pequeño número de axones ampliarse hasta 2 mm más allá del sitio de la lesión (Figura 4a]. Comparación de BDA endógeno y las buenas prácticas agrarias + + axones de los dos experimentos (Tabla 1, los experimentos 1 y 2) reveló una eficiencia notablemente similares de crecimiento axonal (66% y 62%, respectivamente) de salir GDA lleno de lesiones. Por lo tanto, el trasplante de GDAs fue capaz de promover el crecimiento axonal a través de la columna dorsal aguda lesiones, pero el trasplante de células GRP (a partir de la cual se derivan GDAs) no tenía tal efecto.

Hubo una notable correlación entre el grado de crecimiento axonal y el grado de ocupación (de transición) de la lesión de GDAs. En dos GDA trasplantados en animales que GDAs no llenar completamente el sitio de lesión, son muy pocos los axones GFP + GDA penetrado en el caudal de los pobres márgenes de la lesión y las buenas prácticas agrarias + axones en lesión centros se limitan a las zonas que contienen GDAs (Figura 4b]. En las zonas de las lesiones carece de GDAs, GFP + axones distróficos terminaciones formado dentro de los márgenes de caudal lesión (Figura 4b]. En estos casos, no se observaron los axones para cruzar el sitio de lesión y entrará rostral sustancia blanca. GFP + axón crecimiento no fue fasciculated y era a menudo alineados con la placenta humana fosfatasa alcalina (hPAP)-procesos positivos de GDAs y paralelamente a la acogida GFAP + astrocito procesos en la rostral y caudal lesión márgenes (Figura 5a]. Del mismo modo, BDA + endógeno axones son a menudo alineados con hPAP + GDAs dentro rostral (Figura 3b] y caudal (Figura 3d] los márgenes de la lesión.

Como la variación en el tamaño de las lesiones ha sido previamente observado después de lesiones de la médula espinal en diferentes cepas de ratones adultos [46], se realizó una evaluación cualitativa de la lesión el tamaño y la forma resultante de apuñalar a lesiones de la columna dorsal en ambos Fischer 344 y ratas Sprague Dawley, que reveló un grado de variabilidad de Fischer 344 ratas que no se observó en Sprague Dawleys (datos no presentados). Esta variación en el tamaño de las lesiones y la forma entre cada uno de Fischer 344 ratas, por lo tanto, impedía su utilización en estudios cuantitativos localización de la regeneración axonal endógena (ver Materiales y métodos sección para más detalles). Ambas cepas de ratas, sin embargo, puso de manifiesto igualmente la inadecuación de las buenas prácticas agrarias + axones para cruzar el control de lesiones y ambas cepas también mostraron con éxito el crecimiento axonal a través de lesiones de la columna dorsal con el servicio de puente GDAs. Por lo tanto, el tratamiento de lesiones de la columna dorsal con GDAs en dos diferentes cepas de ratas como resultado robusto crecimiento axonal a través de los sitios de lesión y el fracaso de los axones para atravesar el control de las lesiones.

Alineación de acogida de tejidos

En ambos columna dorsal experimentos de regeneración axonal, la linealidad de crecimiento axonal se observó, en particular dentro de los márgenes de la lesión (Figuras 3c, d y 5 bis], nos llevó a examinar la organización del tejido subyacente. Trasplante de disociarse GDAs se asocia no sólo con una reducción significativa en astrogliosis, sino también con una notable reorganización de la célula huésped astrocito órganos y procesos dentro de los márgenes de la lesión (Figuras 5 bis y 6 ter, d adicionales y archivo de datos 1). Para examinar de acogida astrocitos, que se aprovechó de una inesperada downregulation de GFAP en los trasplantados GDAs a las 4 y 8 días después del trasplante (Figura 6b] para identificar acogida astrocitos con anti-GFAP inmunoticción. Intra-GDAs lesión, sin embargo, siguen siendo positivos para los marcadores de linaje astrocito S100 y vimentina (Servicio de archivo de datos 2) y no expresar el linaje oligodendrocyte antígenos NG2 (Figura 7e, h] o proteolipid proteína (datos no presentados). GFAP + astrocitos acogida dentro de los márgenes de control de mediano inyectado lesiones (Figuras 3c, 6a, c adicionales y archivo de datos 3), y en los animales que reciben transplantes de células GRP (Figura 5b, c] exhiben la característica hipertrófica células de órganos adultos astrocitos reactivos y formó una densa masa de numerosas, ramified, desajustados los procesos típicos de astrogliotic tejido cicatrizal. Por el contrario, en los animales que reciben trasplantes de GDA, de acogida GFAP + astrocito procesos dentro de los márgenes de la lesión son ahora orientada hacia los centros de lesión (Figuras 5 bis y 6 ter, d adicionales y archivo de datos 1).

Análisis cuantitativo de la alineación de acogida GFAP + astrocytic procesos en los márgenes de la lesión puesto de manifiesto importantes diferencias entre GDA trasplantados y control de lesiones sitios. Control de márgenes de la lesión tenía un ángulo promedio de 59,4 ° (± 22, mediana = 61 °) entre pares adyacentes de astrocytic procesos. Por el contrario, GDA lleno de lesiones ha ángulos promedio de sólo 11,6 ° (± 12,6, mediana = 7 °) entre los adyacentes de acogida GFAP + procesos dentro de los márgenes de la lesión (Figura 6e]. Por otra parte, GDAs dentro de los márgenes de la lesión a menudo con interweaved endógeno astrocitos GFAP + (Figura 6b], se suman la creación de un entorno de las superficies de células gliales, proporcionando así una orientación direccional de crecimiento axonal a través de las interfaces de GDA-puente lesiones y sustancia blanca adyacente (Figuras 5 bis y 6b, d adicionales y archivo de datos 1).

Represión de inhibitoria proteoglicanos

GDA trasplante también se asoció con un retraso de expresión axón-inhibidora del crecimiento de proteoglicanos en la columna dorsal lesiones. Los márgenes de control de la columna dorsal lesiones examinado 4 días después de la lesión muestra una alta densidad de neurocan inmunoreactividad asociada a numerosas, finas, GFAP-procesos negativos (Figura 7], que hemos demostrado anteriormente que se asocia principalmente con NG2 + neuroglia [4] . Además, NG2 inmunoreactividad en el control de las lesiones es predominantemente relacionados con invadir meníngea fibroblastos y vasos sanguíneos en el centro de control de lesiones (Figura 7d, g; ver también [4]]. Por el contrario, los márgenes de las lesiones que contienen GDA injertos a los 4 días después de la lesión mostró una marcada reducción del total de neurocan inmunoreactividad (Figura 7b versus 7 bis], se asemejan a la vez patrón de expresión neurocan observado previamente 2 días después de la lesión en el control de lesiones [4]. GDA trasplantados lesión sitios también demostraron una reducción de NG2 inmunoreactividad en comparación con los controles a los 4 días después de la lesión (Figura 7e, f]. En los 8 días de tiempo, sin embargo, neurocan inmunoreactividad en los márgenes de GDA trasplantados lesiones fue similar en intensidad y la distribución a neurocan detectadas en el control de lesiones a 8 días después de la lesión (Figura 7c], lo que indica que el efecto del trasplante GDA se demora a la expresión de neurocan lesión en los márgenes. Es significativo, sin embargo, incluso en los 8 días de tiempo GDAs punto dentro de los márgenes de la lesión y centros muestran poca o ninguna neurocan inmunoreactividad (Figura 7c]. A diferencia de la mayor densidad uniforme de NG2 inmunoreactividad en centros de lesión a 8 días en el control de los cordones, NG2 inmunoticción dentro de GDA trasplantados lesiones tenía una distribución más irregular (Figura 7h, i]. Este casi seguro que reflejaba una mezcla de quimérico NG2 - GDAs de acogida con NG2 + lesión de tejidos en los centros (comparar Figura 7g y h, i], como no encontramos hPAP + + NG2 células en las lesiones, incluso los 8 días después del trasplante.

GDA trasplante rubrospinal promueve la regeneración axonal y la represión del núcleo rojo neurona atrofia

GDA trasplante fue también beneficioso para los sistemas CNS neuronas, como se ha demostrado mediante el análisis de las vías rubrospinal (RST) axones dentro de las lesiones a la derecha del lado del funiculus dorsolateral de la médula espinal y sus correspondientes órganos de células neuronales en el lateral izquierdo de color rojo núcleo del cerebro ( Figura 1d]. Lesiones graves a este descendiente, el control motor somático vía altera la capacidad de las ratas a paso rítmicamente y coordinar las previsiones exactas y posterior colocación de las extremidades. En los animales en los que la dorsolateral funiculus se transected, GDAs de nuevo lleno el sitio de lesión, se han integrado en el tejido de acogida y la remodelación de acogida astrocitos. En animales que reciben no GDAs, hubo una ausencia total de RST axones dentro de los centros de la lesión (Figura 8b]. La mayoría de BDA + axones en lesión de control de sitios había distróficos terminaciones y se mantuvo entre 500 y 800 μ m de centros de lesión (Figura 8b]. En marcado contraste, en cuatro de los seis animales que reciben trasplantes de GDA, BDA marcado RST axones fueron fácilmente observables en los centros de lesión (Figura 8] y también dentro de caudal sustancia blanca hasta 1,5 mm fuera del lugar de la lesión. Además, la mayoría de axotomized RST axones dentro de GDA animales trasplantados se observó interacción con los GDAs rostral lesión en los márgenes y ha brotado para dentro de 300 μ m de centros de lesión (Figura 8]. Los axones que ha crecido hasta convertirse en caudal sustancia blanca en GDA-puente lesiones fueron invariablemente observados en la ventral la mitad de los sitios de lesión, que se correlacionaban con las regiones de GDA trasplantes que más a menudo continuamente abarcó el sitio de lesión (Figura 8]. En los dos de las seis GDA-receptor en el que los animales GDA injertos no abarcan los sitios de la lesión (véase también la figura 4b], BDA axones no se observaron dentro de sustancia blanca fuera del lugar de la lesión (datos no presentados).

También se examinaron los efectos de GDA trasplantes a más largo tiempo los puntos relacionados con la recuperación en curso de comportamiento (como se explica más adelante) y se encontró que una presencia transitoria de GDAs fue aparentemente suficiente para tener importantes efectos prolongados. A las 5 semanas después de la lesión, hPAP + GDAs ya no eran detectables pero BDA + RST axones se siguen observando en los centros de lesión y había ampliado aún más en sustancia blanca caudal de hasta 3 mm más allá de los sitios de lesión. En particular, en seis de nueve ratas, RST axones También se observó que ahora han surgido hasta dentro de la regiones más dorsales de la lesión y centros de haber crecido a cabo incluso en las raíces dorsales (Figura 8c, d]. La presencia de conos de crecimiento dentro de caudal sustancia blanca (Figura 8e] demuestra claramente que el éxito de los trasplantes de GDA había estimulado RST regeneración axonal más allá de los sitios de lesión. En dos de los nueve ratas, unos muy dispersas axón arborizaciones, similar en morfología a las observadas para los axones innervating terminal campos, también se detecta ahora en materia gris a una distancia de 1-2 mm más allá del sitio de la lesión (Figura 8f]. Ventral márgenes de GDA trasplantados lesiones, que en anteriores momentos mostró más eficaz que abarca de la lesión, siguió mostrando un rostro-caudal alineación de los procesos de acogida astrocito, lo que demuestra que la adaptación del tejido asociado con el trasplante de GDA no requieren la presencia continua de GDAs para el mantenimiento de este efecto. La probable GDAs de importancia en este sentido se indicó que las observaciones de rostro-caudal alineación de astrocitos de acogida fue menos pronunciado en los márgenes de la lesión dorsal GDA, donde la colonización se completa en menos tiempo los puntos anteriores. El dorsal de acogida astrocitos también apareció más que la hipertrófica ventral de acogida astrocitos (Figura 8c]. No obstante, incluso dorsalmente, astrocitos de acogida se suman más y menos reactivo que en los animales control. En contraste con los efectos beneficiosos asociados con el trasplante de GDA, en el control de ratas que recibieron ciclosporina y lesiones, pero no los trasplantes de GDA RST axones se mantuvo en la lesión rostral márgenes a las 5 semanas después de la lesión y había distróficos terminaciones (datos no presentados).

GDA para trasplantes dorsal lateral funiculus lesiones también dio lugar a una supresión de la atrofia de las neuronas en el núcleo rojo lesionado (Figura 9 bis y archivo de datos adicional 4). Atrofia de un número significativo de neuronas núcleo rojo empieza 1 semana después de RST transection [47]. Del mismo modo, encontró que el número de neuronas con un cuerpo celular de diámetro superior a 20 μ m de los heridos izquierda núcleo rojo en ratas no reciben trasplantes de GDA se redujo a 52% de los valores ileso en el lado derecho del núcleo a las 5 semanas después de la lesión . Diseño basado en el análisis estereológicos (ver Materiales y métodos) ha puesto de manifiesto, sin embargo, que el lesionado lateral izquierdo de GDA núcleo en animales trasplantados que figura el 81% ya que muchos de gran diámetro como las neuronas encontrado ileso en el lado derecho del núcleo, de manera efectiva una aproximadamente el 65 % De aumento en el número de neuronas que habían mantenido un cuerpo celular de diámetro superior a 20 μ m por encima de la observada para el control, lesionado rojo núcleos (Figura 9a].

GDA trasplante promueve la recuperación de comportamiento

Otro indicio de la eficacia de GDAs CNS en la promoción de la recuperación se observó comportamiento. Transection de la dorsolateral funiculus rompe descendente, supraespinales axones y los resultados en el déficit crónico en tanto primer plano y detrás de la función motora de extremidades [48], que puede ser detectada por la red de distribución a pie de comportamiento de ensayo [49]. A raíz de la transection dorsolateral funiculus, las ratas que recibieron trasplantes realizados GDA significativamente mejor que los controles en todos los posteriores a la cirugía puntos temporales (Figura 9b] y su comportamiento mejorado de forma significativa entre 3 días y 28 días después de la lesión (en ambos sentidos de medidas repetidas ANOVA, p <0,05). Las ratas que recibieron trasplantes de GDA hizo una media de 4,7 errores a 3 días después de la lesión y el trasplante y la mejora a una media de 2,9 errores a los 28 días después de la lesión. En contraste, el control de ratas lesionadas hecho en promedio 6,0 errores a 3 días después de la lesión, y no mostró mejoría estadísticamente significativa en cualquier momento posterior, con una media de 5,1 errores a los 28 días después de la lesión. Antes de la cirugía, en ratas control y grupos tratados igualmente bien realizada, con una base media de 2,0 errores. De este modo, el número medio de errores cometidos por GDA trasplantados animales ha mejorado a sólo 0,9 puntos por encima de línea de base, en comparación con el no cobro de control de ratas lesionadas a los 28 días después de la lesión. Por otra parte, el análisis de cada uno de los ratas a los 28 días demostró que cuatro de los nueve lesionadas animales que recibieron trasplantes de GDA había resultados que fueron estadísticamente ahora idéntico al que tenían antes de la cirugía de base resultados (datos no presentados). Como se señala más adelante, por lo tanto, parece que el trasplante de GDA se asoció con reducciones tanto en el grado de déficit neurológico a los 3 días después de la lesión y con una mayor recuperación en las 4 semanas posteriores a la lesión.

Nuestros datos demuestran claramente el fracaso de las células trasplantadas GRP para suprimir la formación de cicatriz y el apoyo a través de crecimiento axonal aguda lesiones de la médula espinal. A la luz de un reciente estudio que muestra la capacidad de GRPs para reprimir glutamato mediada por la neurotoxicidad in vitro [50], sigue habiendo, no obstante, el potencial de muy trasplantados GRPs aún para promover la recuperación funcional a través de este mecanismo, un efecto que sería detectable durante la primera semana después de la lesión. Para investigar esta hipótesis, se realizó un análisis de la red a pie rendimiento en el momento los puntos que van de 3 días a 2 semanas después de la lesión en una nueva serie de combinado RST-ratas lesionadas que han recibido trasplantes de células GRP, GDAs medio de control o las inyecciones. De acuerdo con los resultados anteriores, GDA-trasplantados, una vez más, las ratas mostraron una recuperación significativa de la función del aparato locomotor en comparación con los controles (Figura 9c] en todos los puntos temporales después de la lesión (en ambos sentidos de medidas repetidas ANOVA, p <0,05). En particular, a los 14 días después de la lesión, GDA trasplantados ratas tenían una puntuación media de 1,5 (± 0,2) errores en comparación con 5,9 (± 0,2) errores de la lesión-sólo los controles (Figura 9c]. En marcado contraste, GRP trasplantados animales no mostraron recuperación de la función del aparato locomotor en comparación con los controles en todos los puntos temporales después de la lesión (Figura 9c].

Discusión

Hemos demostrado que astrocitos procedentes de la médula espinal de embriones células GRP puede promover la regeneración axonal y recuperación funcional después del trasplante en adultos aguda lesiones de la médula espinal. La capacidad de GDAs para llenar el sitio de lesión, reprimir astrogliosis, reajustar los tejidos de acogida y expresión de retraso de crecimiento axonal-inhibitoria proteoglicanos sugiere que estas células son extraordinariamente eficaces en la prestación de un ambiente que apoye el crecimiento axonal en las lesiones agudas CNS. Estos atributos, en combinación con su capacidad para reducir la atrofia de las neuronas axotomized CNS y promover una recuperación significativa de comportamiento, hacer GDAs una atractiva novela con el tipo de células que para reparar los daños CNS.

Los efectos de GDAs en el crecimiento tanto de la columna dorsal ascendente y descendente axones RST axones más allá de los sitios de lesión se comparan favorablemente con las anteriores a base de trasplante de la médula espinal terapias. Intra-lesión del nervio ciático injertos han demostrado ser relativamente poco apoyo de axón sensorial reentrada en sustancia blanca rostral a la columna dorsal transection lesiones sin tratamientos adicionales que apoyan el crecimiento axonal [51]. Intra-lesión trasplante de células del estroma de médula por sí solo no ha dado lugar a algún axones sensoriales salir de la rostral márgenes de injertos [52] y, a pesar de que la capacidad de regeneración de los axones sensoriales para cruzar la columna dorsal o la raíz dorsal entrada zona lesiones puente de células ensheathing olfativo es todavía contencioso [53 - 56], se acepta generalmente que la lesión intra-células Schwann y neonatal astrocito injertos son también poco apoyo de axón reentrada de acogida en sustancia blanca [33, 57]. Aunque el crecimiento de axones en RST y más allá de GDA-puente lesiones fue menos eficaz que la observada para el ascenso por los axones de las columnas dorsales, la capacidad de los axones RST para salir GDA-puente lesiones y ampliar hasta 3 mm más allá de la lesión, sin embargo, ofrece una marcada mejora en relación con el completo fracaso de RST axones de cruzar lesiones de la médula espinal de puente con las células ensheathing olfativo [58].

Nuestros experimentos demuestran el valor de pre-diferenciación de células precursoras previa al trasplante y demostrar que las señales encontradas en el sitio de lesión no son capaces de convertir las células GRP a una población que apoya el crecimiento axonal. Esto fue confirmado por el completo fracaso de las células trasplantadas GRP para suprimir la formación de cicatriz y proporcionar un puente que apoya el crecimiento axonal. The fact that pre-differentiation of these cells to GDAs is required for repair of acute spinal cord injuries was also confirmed by the inability of transplanted GRP cells to support locomotor recovery in our RST-lesion model. These data are consistent with previous studies showing a failure of undifferentiated GRP cells to promote supraspinal axon regeneration [ 24 ] or behavioral recovery [ 19 ] after transplantation to spinal cord injuries. Whether this is because the adult lesion environment lacks the signaling molecules required to generate GDA-like cells from transplanted GRP cells in vivo or whether those signals are overridden by other influences, such as inflammatory cytokines, remains to be investigated.

Determination of the exact mechanisms by which any cell type provides benefit after transplantation to the traumatically injured CNS is challenging given the wide range of possible effects of such procedures, and there are a variety of means by which GDA transplantation could have contributed to the significant recovery of locomotion we observed in our grid-walk experiments. The early onset of recovery at the 3-day time point suggests an initial neuroprotective effect associated with GDA transplantation, consistent with our observed rescue of red nucleus neurons from atrophy. Rescue of red nucleus neurons from atrophy has been achieved through provision of brain-derived neurotrophic factor (BDNF [ 59 ]). Ongoing analyses of gene expression in GDAs shows readily detectable levels of BDNF mRNA (CP, unpublished observations). In contrast, previous studies indicate that postnatal type-1 astrocytes (derived from the cortex) do not make BDNF [ 42 ], revealing another advantage of GDAs. Thus, it is apparent that the antigenic category of type-1 astrocytes [ 60 ] in which GDAs were originally placed [ 35 , 36 ] is too broadly defined and needs refinement.

The significant increases in behavioral recovery from 3 days onwards observed in GDA-treated animals in two separate experiments also suggests that axon regeneration and/or plasticity of connection may have contributed to overall functional recovery. As suppression of atrophy of axotomized red nucleus neurons has also been associated with regeneration of their axons into sciatic nerve grafts [ 59 ], the significantly greater number of neurons with cell body diameters over 20 μm in the injured red nucleus of GDA-treated animals at 5 weeks after injury, combined with the further elongation of RST axons in caudal white matter observed between 8 days and 5 weeks, supports a possible contribution of RST axon growth and plasticity to overall behavioral recovery. The relatively modest extent of RST axon growth, however, and the formation of terminal-like structures within adjacent gray matter at the spinal level of cervical vertebra C4, makes it likely that effects of GDAs on other pathways also contributed to functional recovery. Previous studies have shown that recovery of locomotor function after dorsal spinal cord hemisection injuries is associated with plasticity of corticospinal innervation of surviving propriospinal pathways, which in turn form new connections with denervated motor neurons [ 61 ]. The ability of GDAs to provide benefit to both ascending dorsal column and RST axons raises the possibility that GDAs will also be found to support the recovery of other axon populations relevant to locomotion, such as those in the descending reticulospinal and lateral corticospinal pathways [ 49 ] .

We have previously shown that decorin-mediated suppression of the levels of the core proteins and glycosaminoglycan side chains of CSPGs can render spinal cord injuries more permissive for axon growth [ 62 ]. The delayed expression of inhibitory CSPGs associated with GDA transplantation therefore seems likely to have had an important role in enabling regenerative axon growth. The absence of neurocan and NG2 immunoreactivity shown by GDAs within sites of injury indicates that intra-lesion GDAs may be refractory to signaling molecules known to induce expression of neurocan in neonatal astrocyte cultures [ 63 ]. Thus, intra-lesion GDAs maintained an axon-growth-supportive phenotype with respect to CSPG expression. Moreover, the presence of GDAs within lesions also modified the host response to injury and resulted in a significant reduction in NG2 expression within lesion centers and a delay in neurocan expression at lesion margins, which together may have created a window of opportunity for axons not only to enter but also to exit the injury site. In this context, the greater extent of initial RST axon retraction from the injury site compared with ascending dorsal column axons may mean that all but the fastest-responding RST axons missed this window of inhibitor suppression. The ability of decorin infusion to maintain a significant reduction in the levels of multiple axon-growth-inhibitory CSPGs within acute spinal cord injuries at 8 days after injury [ 62 ] suggests that a combined treatment with GDA and decorin may extend the window of opportunity for acute RST axon regeneration.

Also of potential importance to the ability of GDAs to promote axonal regeneration, and perhaps one of the most interesting effects of GDA transplantation, was the extent of linear tissue organization induced by these cells at sites of injury. Although previous studies have demonstrated that alignment of host astrocytic processes alone is not sufficient to promote axon growth across CNS injuries in the presence of inhibitory CSPGs [ 12 , 64 ], clearly the efficiency of axon growth across an injury site with reduced inhibitor expression will be enhanced if axons are not required to negotiate a maze of misaligned cellular processes, that is, if they can take the shortest route. The fact that a dissociated suspension of GDAs is able to effect a linear alignment within acute adult spinal cord injuries without the addition of an aligned bio-matrix suggests that the creation of such tissue organization is a fundamental aspect of the biology of these cells.

Conclusión

In summary, GDA transplantation into the injured spinal cord promoted levels of axon regeneration, alignment of host tissue, suppression of scar formation, neuronal rescue and locomotor recovery that have not been associated with transplantation of other cell types. Critically, these benefits were dependent upon pre-differentiation of glial precursors to a desired astrocytic phenotype prior to transplantation and were not observed with transplantation of glial-restricted precursors. Our study demonstrates that the environment of acute, adult spinal cord injuries does not promote differentiation of glial precursors into the most advantageous cell type for tissue repair and functional recovery. Achieving such linear tissue organization, robust axonal growth and functional recovery in the absence of additional biomaterials, cell modification, or delivery of adjunctive bioactive therapies leads to great interest in now determining whether the beneficial effects of transplanted astrocytes derived from embryonic precursors can be enhanced still further by the application of rational combination therapies.

Materials and methods
Isolation of GRPs and generation of GDAs

GRPs labeled with A2B5 antibody (a cell-surface glycolipid unique to this cell type during early stages of rat spinal development) were isolated by fluorescence-activated cell sorting of dissociated cell suspensions from spinal cord of embryonic day 13.5 transgenic Fischer 344 rat embryos expressing the gene for hPAP under the control of ROSA26 promoter (transgenic rat line:TgN(R26ALPP)14EPS) [ 65 ]. GRPs were maintained in culture with DMEM-F12 media (Gibco/Invitrogen, Carlsbad, USA) with 10 ng/ml basic fibroblast growth factor (bFGF; Sigma, St. Louis, USA) and N2 tissue culture supplement (Gibco/Invitrogen) on a mixed laminin/fibronectin substrate and exposed to 10 ng/ml of human recombinant BMP-4 (R&D Systems) for 7 days in culture to differentiate them into A2B5-negative astrocytes. The following culture conditions were controlled and consistent between batches of GDAs: growth substrate, cell density, growth media, cell feeding schedule, the concentrations and source of growth factors, the total length of time in culture and the number of passages of GRPs before initiating the differentiation protocol.

Characterization of the GDA phenotype in vitro

Cells in culture were labeled live with A2B5 monoclonal antibody (Chemicon, Temecula, USA; for GRPs or type-2 astrocytes) or anti-NG2 antibodies (Chemicon; for oligodendrocyte precursors), then fixed with cold acid and alcohol and labeled with antibodies for GFAP (Sigma; for astrocytes), FGF receptor 3 (Sigma; for type-1 astrocytes), or proteolipid protein (plp)/DM20 (Chemicon; for oligodendrocyte lineage cells). Secondary antibodies were purchased from Jackson Immunologicals (West Grove, USA) and Molecular Probes (Eugene, USA). BMP-4-induced GDAs were uniformly immunoreactive for human alkaline phosphatase in vitro . Although no NG2 + or plp/DM20 + oligodendrocyte precursors were detected in these cultures, undifferentiated GRPs (A2B5 + GFAP - ) or astrocytes of a type-2 phenotype (A2B5 + GFAP + ) were occasionally detected after BMP-4 treatment. These cell types represented less than 1% of the total cell population. To ensure GDA suspensions for transplantation did not contain undifferentiated GRPs or cells with the phenotype of type-2 astrocytes, potentially contaminating cell types were removed from the suspension by immuno-panning with the anti-A2B5 antibody. A small volume of the resulting suspension was plated onto glass coverslips and labeled with antibodies to A2B5 and GFAP to verify a uniform type-1 astrocyte phenotype. For transplantation, 100% GFAP + A2B5 - GDAs were suspended in Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) at a density of 30000 cells/μl.

Lesion models and cell transplantation

Adult female Sprague Dawley or Fischer 344 rats (3 months old, Harlan, Indianapolis, USA) were anesthetized by injection of a cocktail containing ketamine (42.8 mg/ml), xylazine (8.2 mg/ml) and acepromazine (0.7 mg/ml) . For dorsal column injuries (Figure 1a–c ), the right-side dorsal column was unilaterally transected between cervical vertebrae 1 and 2 using a 30-gauge needle as a blade (see also [ 4 , 11 , 62 ]). Lesions extended to a depth of 1 mm and extended laterally 1 mm from the midline. For rubrospinal tract lesions, unilateral transections of the right-side dorso-lateral funiculus including the rubrospinal pathway were conducted at the C3/C4 spinal cord level with microscissors (Fine Science Tools, Foster City, USA). Lesions extended to a depth of 1 mm and extended medially 1 mm from the lateral pial surface of the spinal cord (Figure 1d ).

A total of 4 μl of GDA or GRP suspension (30000 cells/μl; 120000 cells) per animal was acutely transplanted into six different sites in dorsal column lesions (two injections each into medial and lateral regions of the rostral and caudal lesion margins, and two injections into medial and lateral regions of the lesion center; Figure 1b ). All dorsal column in vivo experiments were conducted in the absence of immunosuppressants. GDA or GRP transplants were injected in an identical pattern into lesions of the dorsolateral funiculus and a total of 6 μl of GDA or GRP suspension (30000 cells/μl; 180000 cells) injected per injury site. Control lesion rats were injected with 6 μl HBSS. One set of rats in the dorsolateral funiculus lesion-only group and all rats that received GDA or GRP transplants and dorsolateral funiculus lesions were administered daily injections of cyclosporine (1 mg per 100 g body weight) beginning the day before injury and transplantation through to experimental endpoints. Sham-operated rats in which the spinal cord was exposed but not lesioned, and rats that received a lesion but no cyclosporine, were included as control groups (Table 1 ).

Our previous studies have characterized scar formation and CSPG expression after spinal cord injury in adult Sprague Dawley rats, a strain commonly used in CNS regeneration studies. Unilateral dorsal column stab injuries identical to those in the present study reliably generated lesions of uniform size and induced consistent, quantifiable changes in CSPG expression in adult female Sprague Dawley rats [ 4 , 62 ]. As the GDAs were derived from hPAP Fischer 344 rats, however, we conducted an initial pilot series of intra-lesion GDA transplants versus untreated controls in dorsal column injuries of both adult female Fischer 344 and Sprague Dawley rats and assayed the ability of axons growing from adjacent DRG neuron transplants to cross sites of injury versus controls that did not receive GDAs. Although GFP + axons consistently failed to cross control lesions in both strains of rats, we observed significant variations in lesion size and margin morphology in control Fischer 344 rats, a phenomenon that we did not observe in Sprague Dawley rats. The greater variation in lesion size and rostro-caudal distances of lesion margins from lesion centers in Fischer 344 rats precluded accurate quantification of the numbers of endogenous, BDA-labeled axons at set distances from lesion centers in this strain of rats. Therefore, a separate study to investigate and quantify regeneration of BDA + endogenous ascending dorsal column axons and CSPG expression in GDA-transplanted versus control dorsal column lesion animals was conducted in Sprague Dawley rats (see Table 1 for the rat strains and numbers of animals used in each study). Thus, bridging dorsal column lesions with GDAs in two different strains of rat, in two separate axon regeneration experiments, both resulted in robust axon growth across sites of injury and failure of axons to traverse control injuries.

Adult DRG neuron transplantation

Single-cell suspensions of adult mouse sensory neurons were prepared from 10- to 12-week-old transgenic mice expressing the gene for enhanced GFP [ 66 ] as previously described [ 11 , 12 , 62 ]. No growth factors were added to the neuron suspension. 500 nl of the neuron suspension (about 1500 neurons/μl) was acutely microtransplanted into dorsal column white matter approximately 500 μm caudal to the lesion (Figure 1c ).

Histology

At 4 days, 8 days and 5 weeks after surgery, animals were deeply anesthetized and transcardially perfused with 0.1 M PBS followed by 4% paraformaldehyde in 0.1 M PBS. For frozen sectioning, dissected spinal cords were cryoprotected in a 30% sucrose/PBS solution at 4°C overnight. Tissue was embedded in OCT (Sakura Finetek, Torrance, USA) and quickly frozen. Serial 25-μm thick frozen sections were cut in the sagittal plane and air-dried onto gelatin-coated glass slides. For vibratome sectioning, dissected spinal cords were post-fixed in 4% paraformaldehyde overnight, then embedded in 5% gelatin/5% agar. Serial 75-μm thick sagittal sections were collected and processed as free-floating sections. All tissue sections were washed in PBS, blocked with 4% normal goat serum in solution with 0.1% triton/PBS for 30 min, then incubated with appropriate primary antibodies in the blocking solution overnight at 4°C. Secondary antibody incubations were for 1 h at room temperature.

The following primary antibodies were used: monoclonal anti-GFAP (Sigma) and polyclonal anti-GFAP (Sigma); monoclonal anti-vimentin (Chemicon); monoclonal anti-plp/DM20 (Chemicon); polyclonal anti-NG2 (Chemicon); polyclonal anti-GFP (Molecular Probes); monoclonal anti-hPAP (Sigma); polyclonal anti-hPAP (Fitzgerald, Concord, USA). Secondary antibodies conjugated with Cy5, Cy2 (Jackson), Alexa-488 or Alexa-594 (Molecular Probes) were used to visualize primary antibody binding. All secondary antibodies were pre-absorbed against rat serum. To control for nonspecific binding of secondary antibodies, adjacent sections were also processed as described above without primary antibodies. Labeled sections were examined using an Olympus BX60 fluorescence light microscope and a Leica TCS SP2 confocal microscope. Molecule co-localization and cellular associations were determined with Leica three-dimensional analysis software. All immunohistological images were acquired with confocal microscopy (Leica TCS SP2) of sections cut in the sagittal plane. Spinal cord rostral to the lesion is shown to the left in all figures.

Tracing endogenous dorsal column or rubrospinal axons

In both lesion models, endogenous axons were traced by injection of 10% BDA in sterile PBS (Molecular Probes) 8 days before an experimental endpoint. In the dorsal column lesion model, ascending endogenous axons were traced by BDA injection to a depth of 0.5 mm into the right-side cuneate and gracile white matter at the C3/C4 spinal level (Figure 1c ). Descending RST axons were traced in the dorsolateral-funiculus lesion model by injection of BDA into the magnocellular region of the left-side red nucleus (coordinates: 6.04 mm posterior, +0.7 mm lateral and 7.6 mm below bregma). For histological analysis of BDA-labeled axons, 25 μm serial sagittal sections were collected and processed for immunohistochemistry, as described above. BDA was visualized by incubating tissue sections with the VectastainABC solution (Vector Labs, Burlingame, USA), and further intensified with the Tyramide-Alexa 488 reagent (Molecular Probes).

Quantification of endogenous ascending dorsal column axons

The number of BDA-labeled axons was counted in every third tissue section spanning the medial-lateral extent of dorsal column injury sites at the following locations: 0.5 mm caudal to the injury; directly at the injury center; 0.5 mm, 1.5 mm and 5 mm rostral to the injury site; and within the dorsal column nuclei. To control for differences in axon tracing and labeling efficiency between animals, the numbers of BDA-labeled axons counted within the lesion center and at all rostral sites were normalized to the number of BDA-labeled axons detected 0.5 mm caudal to the lesion site for each tissue section examined. The normalized values from each tissue section for each separate animal (control and GDA-transplanted) were averaged to generate values for each animal. The values for each animal ( n = 6 GDA-transplanted, 5 control) were then averaged and displayed graphically. ANOVA or t -tests were performed as appropriate, with a value of p &lt; 0.01 taken to be significant. For separate experiments analyzing the growth of GFP + axons from microtransplanted sensory neurons, identical methods were used to count GFP + axons from alternate sagittally orientated 75 μm vibratome sections.

Quantification of alignment of host GFAP + astrocyte processes

Confocal images were generated from scanning through 30-μm thick sagittal oriented sections of caudal and ventral dorsal column lesion margins immunostained for GFAP to show host astrocytic processes. Five sections were selected from the lateral to medial center of lesions in three control and three GDA-transplanted rats (see Additional data files 1 and 3). Within each confocal image, GFAP + processes were randomly selected within the lesion margin and 'best fit' lines traced over them using Image Pro Plus software (Media Cybernetics, Silver Spring, USA). Then an immediately adjacent GFAP + process was identically traced and the angle between the lines calculated with the Image Pro Plus software. In all, 20 pairs of GFAP + host astrocytic processes from each confocal image (5 images per group) were analyzed and the mean and median angles were determined. A t -test was performed to determine the statistical significance of the difference in measured angles between astrocytic processes for GDA and control groups, with a highly significant p value of &lt; 0.0001.

Grid-walk behavioral analysis

Two weeks prior to surgery, rats were trained to walk across a horizontal ladder (foot misplacement apparatus, Columbus Instruments, Columbus, USA) and only rats that consistently crossed without stopping were selected for experiments. The grid-walk test is a sensitive measure of the ability of rats to step rhythmically and to coordinate accurate placement of both fore- and hind-limbs. For analysis of acute to long-term recovery of locomotor function in GDA-transplanted versus untreated lesion controls (Table 1 , Experiment 3), trained rats were randomly assigned to one of four groups: RST lesion + GDA + cyclosporine ( n = 9) ; RST lesion + suspension media + cyclosporine ( n = 9); RST lesion only ( n = 7); and sham operation ( n = 7). One day before surgery (baseline) and at time points of 3, 7, 10, 14, 17, 21, 24, and 28 days after surgery, each rat was tested three times and the number of missteps from each trial was averaged to generate a daily score for each animal. To compare the effects of GRP and GDA transplants on recovery of locomotor function (Table 1 , Experiment 4), a further series of trained rats were randomly assigned to one of three groups: RST lesion + GRPs + cyclosporine ( n = 6); RST lesion + GDAs + cyclosporine ( n = 5); and RST lesion + medium injection + cyclosporine ( n = 6). Grid-walk performance was tested in an identical fashion to that used for rats in Experiment 3 at time points of 3, 7, 10, and 14 days after injury. Two-way repeated measures ANOVA and the Tukey post test (with a significance level of p &lt; 0.05) were used to analyze both datasets.

Quantification of red nucleus neurons

At 5 weeks after injury and transplantation, 25 μm serial frozen sections were cut in the coronal plane from the brains of rats that had undergone behavioral analysis. Every third section through the rostro-caudal extent of the red nucleus was stained with 0.2% cresyl violet. Standard, design-based stereology methods (CAST software, Olympus, Melville, USA) were used to quantify numbers of neurons in both red nuclei of RST-lesioned, GDA-transplanted ( n = 6) and control (medium injection + cyclosporine, n = 6) rats. An optical fractionator was applied to left- and right-side red nuclei from every sixth section. Cell bodies greater than 20 μm in diameter and characteristic neuronal morphology were counted. The numbers of neurons counted in the left-side injured red nucleus were normalized to counts obtained for the uninjured right-side nucleus for each animal. The values for each animal within a group were averaged and displayed graphically. A t -test was performed to determine the statistical significance of the difference between the groups (with a value of p &lt; 0.01 taken to be significant).

All procedures were performed under the guidelines of the National Institutes of Health and approved by the Institutional Animal Care and Utilization Committee of Baylor College of Medicine, Houston, USA.

Additional data files

The following files are available: a figure showing the alignment of host GFAP + processes in animals that have received GDA transplants (Additional data file 1 ); a figure showing the expression of astrocytic markers by GDAs in vivo (Additional data file 2 ); a figure showing misaligned host astrocytic processes in control lesions (Additional data file 3 ); and a figure showing suppression of atrophy of axotomized red nucleus neurons by intra-spinal transplanted GDAs (Additional data file 4 ).

Material complementario
Additional data file 1
A figure showing the alignment of host GFAP
+
processes in animals that have received GDA transplants
Additional data file 2
A figure showing the expression of astrocytic markers by GDAs
in vivo
Additional data file 3
A figure showing misaligned host astrocytic processes in control lesions
Additional data file 4
A figure showing suppression of atrophy of axotomized red nucleus neurons by intra-spinal transplanted GDAs
Agradecimientos

This work was supported by funding from the Christopher Reeve Foundation, NIH RO1-NS046442, NIH RO1-NS42820, the New York State Department of Health Spinal Injury Research Program grants CO19772 and CO16889 and the New York State Center of Research Excellence for Spinal Cord Injury . The 1F6 anti-neurocan antibody was obtained from the Developmental Hybridoma Bank developed under the auspices of the NICHID and maintained by the University of Iowa, Department of Biological Sciences.